基因工程的基本操作程序63047PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序63047（1 1）目的基因的獲取）目的基因的獲?。? 2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（3 3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（4 4）目的基因的檢測(cè)與鑒定）目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程基本操作程序主要包括四個(gè)步驟：基因工程基本操作程序主要包括四個(gè)步驟：第1頁(yè)/共35頁(yè)一、目的基因的獲取一、目的基因的獲?。ㄒ唬ㄒ唬┠康幕颍耗康幕颍褐饕侵饕莀的基因的基因編碼蛋白質(zhì)編碼蛋白質(zhì)也可是也可是具有調(diào)控作用的因子具有調(diào)控作用的因子（如增強(qiáng)子等）（如增強(qiáng)子等）第2頁(yè)/共35頁(yè)（二）（二）目的基因的獲取方法：目的基因的獲

2、取方法：1、從基因文庫(kù)中獲取從基因文庫(kù)中獲取（1）基因文庫(kù)：基因文庫(kù)： 將含有將含有某種生物不同基因某種生物不同基因的許多的許多DNA片斷片斷，導(dǎo)入到受體菌的導(dǎo)入到受體菌的群體群體中中，各個(gè)受體菌分別含有，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)基因文庫(kù)。（2） 基因文庫(kù)的種類(lèi)：基因文庫(kù)的種類(lèi)：部分基因部分基因文庫(kù)文庫(kù)基因組基因組文庫(kù)文庫(kù)第3頁(yè)/共35頁(yè)基因組文庫(kù)：基因組文庫(kù)：包含包含了了一種生物一種生物的的所有基因，所有基因，其目的是分其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。基因。部分基因文庫(kù)：部分基因文庫(kù)：包

3、含包含了了一種生物一種生物的的部分基因，部分基因，如如cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。第4頁(yè)/共35頁(yè) 提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)挠眠m當(dāng)?shù)?限制酶切限制酶切 一定大小的一定大小的DNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)的構(gòu)建方法基因組文庫(kù)的構(gòu)建方法：第5頁(yè)/共35頁(yè)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法文庫(kù)的構(gòu)建方法-反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNA合成互補(bǔ)合成互補(bǔ)DNA形成雙鏈形成雙鏈DNA（即（即cDNA）導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接與載體連接cDNA文庫(kù)文庫(kù) 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 （

4、反轉(zhuǎn)錄酶）（反轉(zhuǎn)錄酶）DNA聚合酶聚合酶第6頁(yè)/共35頁(yè) 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū): : 能能編碼蛋白質(zhì)的序列編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼區(qū)非編碼區(qū): : 不能能編碼蛋白質(zhì)的序列不能能編碼蛋白質(zhì)的序列（含基因（含基因表達(dá)的表達(dá)的調(diào)控序列調(diào)控序列）知識(shí)補(bǔ)充：知識(shí)補(bǔ)充：第7頁(yè)/共35頁(yè)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)能夠能夠編碼蛋白質(zhì)的序列編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子叫做外顯子 不能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子叫做內(nèi)含子內(nèi)含子內(nèi)含子： 外顯子：外顯子

5、： 第8頁(yè)/共35頁(yè)真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子外顯子：能：能編碼蛋白質(zhì)的序列編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，：有調(diào)控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）。聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動(dòng)子）。非編碼序列：非編碼序列：包括包括非編碼區(qū)非編碼區(qū)和和內(nèi)含子內(nèi)含子第9頁(yè)/共35頁(yè)基因組文庫(kù)和基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較：文庫(kù)比較：第10頁(yè)/共35頁(yè)（3）從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法：）從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法：依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息

6、。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的如：根據(jù)基因的核苷酸序列核苷酸序列 基因的基因的功能功能 基因基因在染色體上的位置在染色體上的位置 基因的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性等特性第11頁(yè)/共35頁(yè)2、利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因（1）PCR技術(shù)：技術(shù)：是一項(xiàng)在生物是一項(xiàng)在生物體外體外復(fù)制特定復(fù)制特定DNA片段片段的核酸合的核酸合成技術(shù)，成技術(shù)，短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。（2）原理原理：DNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制（3）條件條件：DNA模板模板 引物（一對(duì)）引物（一對(duì)） 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸 Taq酶（耐

7、高溫的酶（耐高溫的DNA聚合酶）聚合酶）緩沖液緩沖液第12頁(yè)/共35頁(yè)（4）過(guò)程：過(guò)程：變性、退火、延伸變性、退火、延伸三步曲三步曲 變性：變性： 雙鏈雙鏈DNA單鏈單鏈DNA55 60 退火退火：90 95引物與單鏈引物與單鏈DNA模板結(jié)模板結(jié)合合( (堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)) ) 延伸：延伸：70 75 Taq酶酶的作用下，的作用下，從引從引物起始物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸第13頁(yè)/共35頁(yè)（5）結(jié)果：結(jié)果：每循環(huán)一次，目的基因可增加一倍，每循環(huán)一次，目的基因可增加一倍，呈呈指數(shù)形式（指數(shù)形式（2n）擴(kuò)增。擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀第14頁(yè)/共35頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增與與

8、DNA復(fù)制復(fù)制的比較的比較PCR技術(shù)技術(shù)DNA復(fù)制復(fù)制相相同同點(diǎn)點(diǎn)原則原則原料原料條件條件不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋方式方式場(chǎng)所場(chǎng)所酶酶結(jié)果結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸模板、能量、模板、能量、DNA聚合酶聚合酶DNA在在高溫變性高溫變性解旋解旋解旋酶解旋酶催化催化體外體外復(fù)制復(fù)制細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定的的DNA聚合聚合酶酶細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合聚合酶酶大量的大量的DNA片段片段形成形成整個(gè)整個(gè)DNA分子分子第15頁(yè)/共35頁(yè)3、人工合成法人工合成法如果如果基因比較小基因比較小，核苷酸序列又已知核苷酸序列又已知，也可，也可以通過(guò)以通過(guò)DNA合成儀合成儀用化學(xué)方法

9、直接人工合成用化學(xué)方法直接人工合成。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心基因工程的核心1、構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的目的目的： 使使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且，并且可以可以 遺傳遺傳給下一代；給下一代； 使目的基因能夠使目的基因能夠表達(dá)表達(dá)和和發(fā)揮作用發(fā)揮作用。第16頁(yè)/共35頁(yè)2、基因表達(dá)載體的基因表達(dá)載體的構(gòu)成及作用構(gòu)成及作用：復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)目的基因目的基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子標(biāo)記基因標(biāo)記基因第17頁(yè)/共35頁(yè)啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子： 位于基因首端的位于基因首端的一段有特殊結(jié)構(gòu)的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片斷片斷，它是它是RNA聚合酶

10、識(shí)別和結(jié)合的部位聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位；作用：作用：驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA終止子：終止子：位于基因尾端的位于基因尾端的一段有特殊結(jié)構(gòu)一段有特殊結(jié)構(gòu)DNA片斷。片斷。作用：作用：使轉(zhuǎn)錄終止使轉(zhuǎn)錄終止第18頁(yè)/共35頁(yè)標(biāo)記基因：標(biāo)記基因：為了為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)（如（如抗生素抗性抗生素抗性基因基因）。）。注意：注意：?jiǎn)?dòng)子與終止子不同于起始密碼和終止密碼啟動(dòng)子與終止子不同于起始密碼和終止密碼 啟動(dòng)子與終止子啟動(dòng)子與終止子位于位于DNA上，上，是是DNA片段片段，與與基因的基因的

11、轉(zhuǎn)錄有關(guān)轉(zhuǎn)錄有關(guān)。起始密碼和終止密碼起始密碼和終止密碼位于位于mRNA上上， 是是3個(gè)相鄰個(gè)相鄰的堿基的堿基，與，與翻譯翻譯（蛋白質(zhì)的合成）（蛋白質(zhì)的合成）有關(guān)有關(guān)。第19頁(yè)/共35頁(yè)第20頁(yè)/共35頁(yè) 克隆載體克隆載體與與表達(dá)載體表達(dá)載體的構(gòu)成：的構(gòu)成： 二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片片 段。段。表達(dá)載體表達(dá)載體在克隆載體基礎(chǔ)上在克隆載體基礎(chǔ)上增加增加了了啟動(dòng)啟動(dòng) 子、終止子，子、終止子，啟動(dòng)子、終止子啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因?qū)τ谀康幕?表達(dá)必不可少。表達(dá)必不可少。第21頁(yè)/共35頁(yè)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化

12、：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程的過(guò)程。2、常用的轉(zhuǎn)化方法：常用的轉(zhuǎn)化方法：（1）導(dǎo)入導(dǎo)入植物細(xì)胞植物細(xì)胞的方法：的方法： 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用最常用）第22頁(yè)/共35頁(yè)a. 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌：土壤中的一種微生物，自然條件下土壤中的一種微生物，自然條件下感染雙子葉感染雙子葉植物和裸子植物植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。染能力。 b.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理：植物受傷時(shí)，傷口處細(xì)胞會(huì)分泌大量植物受傷時(shí)，傷口處細(xì)胞會(huì)分泌大量酚類(lèi)化合酚類(lèi)化合物物，吸引農(nóng)桿菌

13、，吸引農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNA可可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的的DNA上上。第23頁(yè)/共35頁(yè) 目的基因目的基因插入插入Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA上上 c. 過(guò)程過(guò)程： 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、有效經(jīng)濟(jì)、有效第24頁(yè)/共35頁(yè) 基因槍法基因槍法單子葉植物常用單子葉植物常用的方法，的方法，成本較高成本較高。 花粉管通道法花粉管通道法簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì) （我國(guó)（我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉）第25頁(yè)/共35頁(yè)（2）導(dǎo)入導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞的方法：的方法： 常用常用方法：方法： 顯微注射法顯微注射法 常用的受體細(xì)胞：常用的受體細(xì)

14、胞： 受精卵受精卵目的基因表達(dá)載體提純目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動(dòng)物新性狀動(dòng)物 流程：流程：第26頁(yè)/共35頁(yè)（3）導(dǎo)入導(dǎo)入微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞的方法：的方法： 原核生物特點(diǎn)：原核生物特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少 方法：方法：用用Ca2+（或或CaCl2溶液溶液）處理細(xì)胞）處理細(xì)胞 感受態(tài)感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化。分子，完成轉(zhuǎn)化。第27頁(yè)/共35頁(yè)四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定1

15、、轉(zhuǎn)基因生物、轉(zhuǎn)基因生物DNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因（1）方法：方法：DNA分子雜交分子雜交技術(shù)技術(shù)（2）過(guò)程：過(guò)程：. 提取提取轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的基因組基因組DNA. 用用放射性同位標(biāo)記放射性同位標(biāo)記的目的基因的的目的基因的DNA片段片段 做做探針探針，與轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交與轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交， 若若顯示出雜交帶顯示出雜交帶，表明目的基因已插入表明目的基因已插入染染 色體色體DNA中。中。第28頁(yè)/共35頁(yè)2、目的基因、目的基因是否轉(zhuǎn)錄出是否轉(zhuǎn)錄出mRNA（1）方法：方法：分子雜交分子雜交技術(shù)技術(shù)（2）過(guò)程：過(guò)程：. 提取提取轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的mRNA.

16、 用用放射性同位標(biāo)記放射性同位標(biāo)記的目的基因的的目的基因的DNA片段片段 做做探針探針，與與轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交， 若若顯示出雜交帶顯示出雜交帶，表明目的基因轉(zhuǎn)錄出表明目的基因轉(zhuǎn)錄出 mRNA。第29頁(yè)/共35頁(yè)3、檢測(cè)目的基因、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)是否翻譯成蛋白質(zhì)（1）方法：方法：抗原抗原抗體雜交抗體雜交 （2）原理：原理： 抗原與抗體的特異性結(jié)合抗原與抗體的特異性結(jié)合（3）過(guò)程：過(guò)程：. 提取提取轉(zhuǎn)基因生物的轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì). 用用針對(duì)目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)針對(duì)目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)（抗原）的（抗原）的 抗體（放射性標(biāo)記）抗體（放射性標(biāo)記），與與轉(zhuǎn)基因生物的

17、轉(zhuǎn)基因生物的蛋蛋 白質(zhì)（抗原）雜交白質(zhì)（抗原）雜交，若，若顯示出雜交帶顯示出雜交帶，表表 明目的基因已形成相應(yīng)的蛋白質(zhì)明目的基因已形成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。第30頁(yè)/共35頁(yè)除了上述除了上述分子水平分子水平的鑒定，有時(shí)還需進(jìn)行的鑒定，有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體個(gè)體生物學(xué)水平生物學(xué)水平的鑒定：的鑒定：比如做比如做抗蟲(chóng)、抗病抗蟲(chóng)、抗病的的接種實(shí)驗(yàn)接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度；以確定是否有抗性以及抗性的程度；或?qū)驅(qū)蚬こ坍a(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較活性比較，以確定功能是否相同，以確定功能是否相同第31頁(yè)/共35頁(yè)【特別提示】【特別提示】關(guān)注關(guān)注“操作程序操作程序”中

18、的四個(gè)易混點(diǎn)中的四個(gè)易混點(diǎn)(1)(1)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的。目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的。目的基因目的基因 應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。(2)(2)目的基因與載體相連接時(shí)，可能出現(xiàn)目的基因與載體相連接時(shí)，可能出現(xiàn)3種連接種連接 方式方式，如，如目的基因目的基因目的基因、目的基因目的基因、目的基因 載體、載體載體、載體載體載體。為了防止目的基因或載。為了防止目的基因或載 體自連，基因工程中體自連，基因工程中常用常用2種不同的限制酶種不同的限制酶對(duì)對(duì) 目的基因和載體進(jìn)行目的基因和載體進(jìn)行切割切割，并保證目的基因，并保證目的基因 的的定向連接定向連接（啟動(dòng)子在其前，終止子在其（啟動(dòng)子在其前，終止子在其 后，保證目的基因正常轉(zhuǎn)錄）后，保證目的基因正常轉(zhuǎn)錄）第32頁(yè)/共35頁(yè)(3)(3)基因