現(xiàn)代生物學(xué)進(jìn)展-現(xiàn)代分子生物學(xué)的若干主要進(jìn)展

1、一、生物學(xué)的幾個(gè)發(fā)展階段簡(jiǎn)要回顧一、生物學(xué)的幾個(gè)發(fā)展階段簡(jiǎn)要回顧二、分子生物學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史二、分子生物學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史三、分子生物學(xué)的概念、原理、研究?jī)?nèi)容三、分子生物學(xué)的概念、原理、研究?jī)?nèi)容四、分子生物學(xué)取得的主要理論成就四、分子生物學(xué)取得的主要理論成就五、分子生物學(xué)取得的重要應(yīng)用成就五、分子生物學(xué)取得的重要應(yīng)用成就六、分子生物學(xué)的主要技術(shù)進(jìn)步六、分子生物學(xué)的主要技術(shù)進(jìn)步七、遺傳的分子生物學(xué)七、遺傳的分子生物學(xué)八、基因工程八、基因工程1、普通生物學(xué)階段：以個(gè)體、群體、博物、描述為特、普通生物學(xué)階段：以個(gè)體、群體、博物、描述為特 征的生物學(xué)征的生物學(xué)2、細(xì)胞生物學(xué)階段：在細(xì)胞水平上揭示生命活動(dòng)規(guī)律、細(xì)

2、胞生物學(xué)階段：在細(xì)胞水平上揭示生命活動(dòng)規(guī)律3、分子生物學(xué)階段：在生物大分子水平上研究生命活、分子生物學(xué)階段：在生物大分子水平上研究生命活 動(dòng)規(guī)律動(dòng)規(guī)律 4、反向生物學(xué)階段反向生物學(xué)階段: 由基因型到表型，由序列到功能由基因型到表型，由序列到功能 的，與傳統(tǒng)生物學(xué)研究思路反向的，與傳統(tǒng)生物學(xué)研究思路反向 而行的生物學(xué)，從理論上探討生而行的生物學(xué)，從理論上探討生 命的本質(zhì)和生命運(yùn)動(dòng)的邏輯。命的本質(zhì)和生命運(yùn)動(dòng)的邏輯。1944. Avery證明證明DNA為遺傳物質(zhì)（轉(zhuǎn)化試驗(yàn)）為遺傳物質(zhì)（轉(zhuǎn)化試驗(yàn)）1953. Waston&Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)1958. Crick提出遺傳中心

3、法則提出遺傳中心法則1961. Monas&Jacob 乳糖操縱子模型乳糖操縱子模型1966. Neriberg等等 破譯全部遺傳密碼破譯全部遺傳密碼1970. Arber等等 DNA限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶 Khorana 體外合成體外合成tRNA，發(fā)現(xiàn)連接酶發(fā)現(xiàn)連接酶 Baltimore&Temin 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 1972. Berg 噬菌體與噬菌體與SV40DNA體外重組體外重組1973. Boyer&Cohen 重組質(zhì)粒表達(dá)成功重組質(zhì)粒表達(dá)成功1975. Southern 發(fā)明雜交技術(shù)發(fā)明雜交技術(shù) Bishop等發(fā)現(xiàn)第一個(gè)癌基因等發(fā)現(xiàn)第一個(gè)癌基因Src197

4、7. Sanger.Maxman&Gilbert 快速測(cè)序快速測(cè)序1978. Miniatis 建立人類(lèi)基因文庫(kù)建立人類(lèi)基因文庫(kù)1981. Cech&Altman 發(fā)現(xiàn)核酶發(fā)現(xiàn)核酶1983. McClintock 發(fā)現(xiàn)的跳躍基因獲獎(jiǎng)發(fā)現(xiàn)的跳躍基因獲獎(jiǎng)1984. Kohler 單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)1985. Mullis 首創(chuàng)首創(chuàng)PCR技術(shù)技術(shù)1990. 人類(lèi)基因組計(jì)劃正式啟動(dòng)人類(lèi)基因組計(jì)劃正式啟動(dòng)1993. Roberts&Sharp 發(fā)現(xiàn)斷裂基因發(fā)現(xiàn)斷裂基因 Smith進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變1994. Gilman&Bodbell G蛋白

5、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)1995. Lewis等發(fā)現(xiàn)果蠅體節(jié)發(fā)育基因等發(fā)現(xiàn)果蠅體節(jié)發(fā)育基因1997. Stanley 發(fā)現(xiàn)朊病毒發(fā)現(xiàn)朊病毒1999. Gunter.Blobel 闡明胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸機(jī)理闡明胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸機(jī)理2000. Carlsson等神經(jīng)多巴胺在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用等神經(jīng)多巴胺在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用2001. Hartwell等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控因子等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK激酶等激酶等1 1、概念：、概念： 廣義：所有生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能、重要性、規(guī)律性及相互關(guān)系廣義：所有生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能、重要性、規(guī)律性及相互關(guān)系 狹義：分子遺傳學(xué)狹義：分子遺傳學(xué)2、內(nèi)容：、內(nèi)容：生物大分子的結(jié)構(gòu)

6、與功能生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能 或或 蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)基因工程基因工程 核酸的分子生物學(xué)核酸的分子生物學(xué)基因表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)3、三條基本原理：、三條基本原理： 所有生物體大分子的構(gòu)成單位相同所有生物體大分子的構(gòu)成單位相同大分子建成規(guī)則相同大分子建成規(guī)則相同生物體的特異性由其大分子的特異性所規(guī)定生物體的特異性由其大分子的特異性所規(guī)定1、DNA雙螺旋模板學(xué)說(shuō)雙螺旋模板學(xué)說(shuō)2、遺傳中心法則、遺傳中心法則3、基因表達(dá)調(diào)控理論、基因表達(dá)調(diào)控理論 （操縱子模型）（操縱子模型）4、基因?qū)W說(shuō)的豐富和發(fā)展、基因?qū)W說(shuō)的豐富和發(fā)展 （基因現(xiàn)代概念的確立

7、）（基因現(xiàn)代概念的確立）5、基因突變理論、基因突變理論6、基因作圖理論、基因作圖理論7、分子進(jìn)化學(xué)說(shuō)、分子進(jìn)化學(xué)說(shuō)8、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)說(shuō)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)學(xué)說(shuō)9、細(xì)胞周期調(diào)控理論、細(xì)胞周期調(diào)控理論10、癌變的分子機(jī)制、癌變的分子機(jī)制11、通用遺傳密碼字典與、通用遺傳密碼字典與 非通用遺傳密碼字典非通用遺傳密碼字典12、生物信息學(xué)、生物信息學(xué)13、基因組學(xué)與比較基因、基因組學(xué)與比較基因 組學(xué)組學(xué)14、“RNA世界世界”假說(shuō)假說(shuō)15、細(xì)胞衰老和程序化死、細(xì)胞衰老和程序化死 亡機(jī)理亡機(jī)理 （1）已用基因工程的技術(shù)研制出了一批珍貴的基因工程藥物：已用基因工程的技術(shù)研制出了一批珍貴的基因工程藥物： 人生長(zhǎng)抑素人生長(zhǎng)抑

8、素 生產(chǎn)胰島素生產(chǎn)胰島素 生產(chǎn)生長(zhǎng)激素生產(chǎn)生長(zhǎng)激素 生產(chǎn)組織型血纖維蛋白溶酶原激活因子生產(chǎn)組織型血纖維蛋白溶酶原激活因子 抗血友病因子抗血友病因子 制備乙型肝炎疫苗制備乙型肝炎疫苗 生產(chǎn)多種細(xì)胞因子生產(chǎn)多種細(xì)胞因子 制備基因工程抗體制備基因工程抗體（2）基因診斷與基因治療）基因診斷與基因治療 疾病診斷：遺傳病、腫瘤、病毒感染的診斷，具有特異疾病診斷：遺傳病、腫瘤、病毒感染的診斷，具有特異 性高，適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，常用方法有核酸雜交、性高，適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，常用方法有核酸雜交、RFLP、 PCR、DNA指紋圖譜指紋圖譜 法醫(yī)診斷、親子鑒定法醫(yī)診斷、親子鑒定 基因治療：方法有將目的基因與逆轉(zhuǎn)錄病毒重組

9、、轉(zhuǎn)染基因治療：方法有將目的基因與逆轉(zhuǎn)錄病毒重組、轉(zhuǎn)染 受體細(xì)胞，使之表達(dá)以彌補(bǔ)缺陷；將目的基因?qū)θ旧w受體細(xì)胞，使之表達(dá)以彌補(bǔ)缺陷；將目的基因?qū)θ旧w 進(jìn)行定位整合，即基因打靶；裸進(jìn)行定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射直接注射。 至至1997年，美國(guó)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物有近年，美國(guó)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物有近20種，它們是：胰島素、人生長(zhǎng)激素、干擾素、白細(xì)胞介種，它們是：胰島素、人生長(zhǎng)激素、干擾素、白細(xì)胞介素素2、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、紅細(xì)胞生成素、組織溶纖原激活劑、生長(zhǎng)激素、因子、紅細(xì)胞生成素、組織溶纖原激活劑、

10、生長(zhǎng)激素、促生長(zhǎng)素、抗血友病因子促生長(zhǎng)素、抗血友病因子、葡糖腦苷脂酶、脫氧核糖、葡糖腦苷脂酶、脫氧核糖核酸酶、乙型肝炎疫苗、甲型肝炎疫苗、體內(nèi)用單克隆核酸酶、乙型肝炎疫苗、甲型肝炎疫苗、體內(nèi)用單克隆抗體、鼠單克隆抗體?？贵w、鼠單克隆抗體。 至至1998年，我國(guó)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物亦有年，我國(guó)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物亦有10余種，如：干擾素、白細(xì)胞介素、粒細(xì)胞集落刺激因子、余種，如：干擾素、白細(xì)胞介素、粒細(xì)胞集落刺激因子、鏈激酶、紅細(xì)胞生成素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。鏈激酶、紅細(xì)胞生成素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等?；蚬こ谭椒ㄉa(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的優(yōu)勢(shì)是非常明顯的已投入使用（含臨床試驗(yàn)）的基因工程疫苗轉(zhuǎn)

11、基因植物：已克隆了轉(zhuǎn)基因植物：已克隆了100多個(gè)植物基因，使作物獲得高多個(gè)植物基因，使作物獲得高 產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗蟲(chóng)、抗逆等多種優(yōu)良性狀，下表列出產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗蟲(chóng)、抗逆等多種優(yōu)良性狀，下表列出 了各國(guó)轉(zhuǎn)基因作物的大田釋放情況了各國(guó)轉(zhuǎn)基因作物的大田釋放情況：轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因作物性狀基因作物性狀 批準(zhǔn)項(xiàng)數(shù)批準(zhǔn)項(xiàng)數(shù) 所占比例（所占比例（%） 抗除草劑抗除草劑 1297 29.6 抗蟲(chóng)抗蟲(chóng) 1046 23.8 優(yōu)質(zhì)優(yōu)質(zhì) 886 20.2 抗病毒抗病毒 436 9.9 農(nóng)學(xué)性狀優(yōu)農(nóng)學(xué)性狀優(yōu) 211 4.8 抗真菌抗真菌 208 4.7 其它其它 303 6.9 作物 性狀批準(zhǔn)數(shù) 馬鈴薯 抗病、抗逆、品種5

12、，1，1 水稻 抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑1，4，1 棉花 抗蟲(chóng) 9 玉米 抗蟲(chóng) 3 大豆 抗除草劑 1 小麥 抗除草劑、品質(zhì) 1，1 廣藿香 抗病 1 煙草 抗病毒、抗蟲(chóng) 2 ，2 楊樹(shù) 抗蟲(chóng) 1 微生物 提高固氮效率 6我國(guó)獲準(zhǔn)進(jìn)入大田的轉(zhuǎn)基因植物（我國(guó)獲準(zhǔn)進(jìn)入大田的轉(zhuǎn)基因植物（1998）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：相繼培育成功的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括，鼠、豬、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：相繼培育成功的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括，鼠、豬、 羊、雞、兔、鯉魚(yú)、鯰魚(yú)、金魚(yú)等。羊、雞、兔、鯉魚(yú)、鯰魚(yú)、金魚(yú)等?？寺?dòng)物：克隆動(dòng)物：1997年，英國(guó)科學(xué)家克隆成功年，英國(guó)科學(xué)家克隆成功“多莉多莉”綿羊綿羊 （由成年乳腺細(xì)胞發(fā)育而來(lái)）和（由成年乳腺細(xì)胞發(fā)育而來(lái)

13、）和“波莉波莉”綿羊，它的乳綿羊，它的乳汁汁 中含有人類(lèi)基因的蛋白產(chǎn)物。中含有人類(lèi)基因的蛋白產(chǎn)物。分子輔助育種：改選育性狀為選育標(biāo)記。分子輔助育種：改選育性狀為選育標(biāo)記。利用超級(jí)工程菌以植物秸桿作材料生產(chǎn)有利用超級(jí)工程菌以植物秸桿作材料生產(chǎn)有 “綠色石油綠色石油”之稱(chēng)的新型能源之稱(chēng)的新型能源酒精。酒精。構(gòu)建超級(jí)工程菌迅速清除海洋中的石油污構(gòu)建超級(jí)工程菌迅速清除海洋中的石油污 染及其它環(huán)境污染。染及其它環(huán)境污染。4、在采礦工業(yè)中的應(yīng)用、在采礦工業(yè)中的應(yīng)用用工程菌浸礦，浸出銅、鈾、鈷、錳、鋅、用工程菌浸礦，浸出銅、鈾、鈷、錳、鋅、鋁等金屬加拿大用細(xì)菌浸出的鈾已達(dá)鋁等金屬加拿大用細(xì)菌浸出的鈾已達(dá)23

14、0萬(wàn)萬(wàn)噸。噸。人類(lèi)基因組計(jì)劃人類(lèi)基因組計(jì)劃水稻基因組計(jì)劃水稻基因組計(jì)劃模式生物基因組研究：已闡明基因組序列的生物有模式生物基因組研究：已闡明基因組序列的生物有19種種 （均為單細(xì)胞生物），此外小鼠、果蠅、家蠶、擬南芥等（均為單細(xì)胞生物），此外小鼠、果蠅、家蠶、擬南芥等 模式生物的基因組序列也將很快闡明。模式生物的基因組序列也將很快闡明。建立了世界共享的三大分子數(shù)據(jù)庫(kù)建立了世界共享的三大分子數(shù)據(jù)庫(kù)1.超離技術(shù)超離技術(shù)2.電泳技術(shù)電泳技術(shù)3.電鏡技術(shù)電鏡技術(shù)4.X衍射與核磁共振衍射與核磁共振5.分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基

15、因文庫(kù)基因克隆、基因文庫(kù)7.PCR8.DNA測(cè)序測(cè)序9.DNA化學(xué)合成化學(xué)合成10.載體構(gòu)建載體構(gòu)建11.染色體步查染色體步查12.基因定點(diǎn)誘變基因定點(diǎn)誘變13.基因打靶基因打靶14.基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移15.動(dòng)物克隆動(dòng)物克隆16.單克隆抗體單克隆抗體17.基因工程抗體基因工程抗體18.基因診斷基因診斷19.基因治療基因治療20.基因作圖基因作圖21.差異顯示差異顯示22.分子進(jìn)化工程分子進(jìn)化工程23.分子輔助育種分子輔助育種24.生物芯片生物芯片25.DNA指紋指紋26.酵母雙雜交酵母雙雜交27.基因捕獲基因捕獲28.RNAi29.基因敲除基因敲除法：法：PCR（polymerase chain

16、 reaction)技術(shù)是Mullis于1986年發(fā)明的一項(xiàng)體外快速大量擴(kuò)增片段的方法（獲1994年諾貝爾獎(jiǎng)）。其基本原理就是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入欲被擴(kuò)增的DNA片段，作為模板；人工合成的寡聚核苷酸，作為引物；耐熱的DNA聚合酶（Taq）以及四種核苷酸三磷酸。反應(yīng)時(shí)，先加熱至約92，使模板變性。降溫至約50使引物與模板結(jié)合（退火），加溫至，在Taq酶作用下，使新鏈延伸。重復(fù)92（變性）、50（復(fù)性）、72（延伸）的過(guò)程使片段得到不斷的擴(kuò)增，可以重復(fù)幾十個(gè)周期。片段將2n（為反應(yīng)周期數(shù)）的倍數(shù)增加。研究?jī)?nèi)容：研究?jī)?nèi)容：（1）各種生物數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和管理）各種生物數(shù)據(jù)庫(kù)的

17、建立和管理。這是一切生物信息學(xué)工作的基礎(chǔ)，通常要有計(jì)算機(jī)科學(xué)背景的專(zhuān)業(yè)人員與生物學(xué)家密切合作。（2）數(shù)據(jù)庫(kù)接口和檢索工具的研制）數(shù)據(jù)庫(kù)接口和檢索工具的研制。數(shù)據(jù)庫(kù)的內(nèi)容來(lái)自萬(wàn)千生物學(xué)者的日積月累，最終又為生物學(xué)者們所用。但不能要求一般生物學(xué)工作者具有高深的計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)知識(shí)，因此，必須發(fā)展查詢(xún)數(shù)據(jù)庫(kù)和向庫(kù)里提供數(shù)據(jù)的方便接口。這是專(zhuān)業(yè)人員才能勝任的工作，通常在生物信息中心里進(jìn)行。（3）人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施）人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施，配合大規(guī)模的DNA自動(dòng)測(cè)序，對(duì)信息的采集和處理提出了空前的要求。從各種圖譜的分析，大量序列片段的拼接組裝，尋找基因和預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)與功能，到數(shù)據(jù)和研究結(jié)果的視像化，無(wú)不需要高效

18、率的算法和程序。研究新算法、發(fā)展方便適用的程序，是生物信息學(xué)的日常任務(wù)。（4）生物信息學(xué)最重要的任務(wù)）生物信息學(xué)最重要的任務(wù)，是從海量數(shù)據(jù)中提取新知識(shí)。這首先是從DNA序列中識(shí)別編碼蛋白質(zhì)的基因，以及調(diào)控基因表達(dá)的各種信號(hào)。其次，從基因組編碼序列翻譯出的蛋白質(zhì)序列的數(shù)目急劇增加，根本不可能用實(shí)驗(yàn)方法一一確定它們的結(jié)構(gòu)和功能。從已經(jīng)積累的數(shù)據(jù)和知識(shí)出發(fā)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，成為常規(guī)的研究任務(wù)。（5）DNA芯片和微陣列的發(fā)展芯片和微陣列的發(fā)展，把一定組織或生物體內(nèi)萬(wàn)千基因時(shí)空表達(dá)的研究提上日程研究基因表達(dá)過(guò)程中的聚群關(guān)系，從中提取調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑的知識(shí)，進(jìn)而從整體上模擬細(xì)胞內(nèi)的全部互相輔合的

19、生化反應(yīng)，在亞細(xì)胞層次理解生命活動(dòng)。只有掌握已有數(shù)據(jù)、發(fā)展嶄新算法，才能創(chuàng)造新的知識(shí)。這是生物信息學(xué)剛剛掀開(kāi)的新篇章。2、在基因組計(jì)劃中的作用、在基因組計(jì)劃中的作用1）高度自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得、）高度自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得、 加工和整理加工和整理2）序列片段的拼接）序列片段的拼接3）基因區(qū)域的預(yù)測(cè)）基因區(qū)域的預(yù)測(cè)4）基因功能預(yù)測(cè)）基因功能預(yù)測(cè)5）分子進(jìn)化的研究）分子進(jìn)化的研究l基因的化學(xué)基礎(chǔ)是什么？遺傳的染色體理論認(rèn)為：基因位于細(xì)胞核內(nèi)染色體上；染色體的主要化學(xué)成份蛋白質(zhì)和核酸何者為基因的化學(xué)基礎(chǔ)？l*“蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì)”觀點(diǎn)及其主要論據(jù)。l基因化學(xué)本質(zhì)的條件：具有三種功能(p31)。遺傳功

20、能(復(fù)制與世代傳遞)；表型功能(具有適當(dāng)?shù)目刂菩誀畹谋磉_(dá)機(jī)制)；進(jìn)化功能(能夠產(chǎn)生變異滿(mǎn)足生物進(jìn)化的要求)。lE. Schrdinger(1945)(薛丁格)：What is life?l二十世紀(jì)，由于物理學(xué)、化學(xué)和數(shù)學(xué)研究工作者的加入，在生物學(xué)與遺傳學(xué)研究領(lǐng)域形成了三個(gè)學(xué)派：物理學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)學(xué)派；化學(xué)生化生化學(xué)派；數(shù)學(xué)信息信息學(xué)派。一、 DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù)二、 DNA是遺傳物質(zhì)的直接證據(jù)(一)、 細(xì)菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(二)、 噬菌體侵染與繁殖試驗(yàn)(三)、 煙草花葉病毒拆合實(shí)驗(yàn)*三、非核酸類(lèi)的遺傳物質(zhì)1. DNA含量的恒定性；2. DNA代謝的穩(wěn)定性；3. 基因突變與紫外線誘變波長(zhǎng)的關(guān)系。1.

21、背景知識(shí)l噬菌體侵染與繁殖基本過(guò)程：T2噬菌體浸染大腸桿菌后，遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞；利用大腸桿菌的遺傳復(fù)制系統(tǒng)復(fù)制噬菌體遺傳物質(zhì)；利用大腸桿菌的遺傳信息表達(dá)系統(tǒng)合成噬菌體組件；最后組裝形成完整的T2噬菌體。l因此只要弄清侵染時(shí)進(jìn)入細(xì)菌的是噬菌體的哪一部分，就可能證明哪種物質(zhì)是遺傳信息的載體。l另外：P是DNA的組成部分，但不存在于蛋白質(zhì)中；S存在于蛋白質(zhì)中，但DNA中沒(méi)有。l試驗(yàn)結(jié)果表明：主要是由于DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才產(chǎn)生完整的噬菌體；l結(jié)論：DNA才是(噬菌體的)遺傳物質(zhì)。l題外話(huà)：與Avery等人研究比較，本試驗(yàn)的精度低得多。但是由于放射性標(biāo)記法(也稱(chēng)為示蹤原子法)，當(dāng)時(shí)為人們普遍采用；同時(shí)

22、由于核酸研究及其它相關(guān)的成果，本試驗(yàn)結(jié)果很快得到人們的廣泛認(rèn)同。l煙草花葉病毒(TMV)是由RNA與蛋白質(zhì)構(gòu)成的管狀微粒：中心是單鏈螺旋RNA、外部是蛋白質(zhì)外殼。1. 拆分感染試驗(yàn)：將TMV的RNA與蛋白質(zhì)分離、提純；分別接種煙葉，發(fā)現(xiàn)RNA能使煙葉致病，而蛋白質(zhì)不能；用RNA酶處理RNA后接種煙葉也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遺傳物質(zhì)。lFrankel-Conrat, Singer (1956)進(jìn)行了圖示試驗(yàn)：l綜上所述：到上世紀(jì)中期，多方面證據(jù)都直接或間接地表明DNA是主要的遺傳物質(zhì)，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遺傳物質(zhì)。*一、早期對(duì)核酸化學(xué)性質(zhì)的研究二、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)三

23、、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)*四、RNA的分子結(jié)構(gòu)*五、DNA的復(fù)制l雖然上世紀(jì)中才認(rèn)識(shí)到DNA的生物學(xué)功能，核酸研究卻已有一百多年歷史：lF.Mischer(1869)從外科繃帶上膿細(xì)胞核中分離出一種不同于蛋白質(zhì)的物質(zhì)，含磷量高、并具有很強(qiáng)的酸性。他將這種物質(zhì)稱(chēng)核質(zhì)(素)(nuclein)；lA.Kossel(1879)發(fā)現(xiàn)酵母等核質(zhì)具有A、G、T、C四種堿基；lR.Altamm(1889)將核素命名為核酸(nucleic acid)。lKossel(1901)又發(fā)現(xiàn)核酸中具有碳水化合物(糖)；lP.A.T.Levene(1909)研究表明：酵母核酸含有五碳糖核糖；lFisher(1914)人工合成核

24、苷酸；lP.A.T.Levene(1929)又發(fā)現(xiàn)動(dòng)物胸腺細(xì)胞核酸含有脫氧核糖.lLevene將前者命名為核糖核酸(ribonucleicacid, RNA)，后者命名為脫氧核糖核酸(deoxy-ribonucleicacid, DNA)。并指出動(dòng)、植物中均存在這兩種核酸。l關(guān)于堿基的種類(lèi)、分子式、核苷酸的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)等內(nèi)容是生物化學(xué)中討論的內(nèi)容，請(qǐng)課后復(fù)習(xí)。l在此談三個(gè)關(guān)于核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)容：(一)、 “四核苷酸”假說(shuō)；(二)、 查伽夫定則及其意義；*(三)、 核苷酸序列及其測(cè)定。lP.A.T.Levene(1930)提出“四核苷酸”假說(shuō)，認(rèn)為：核苷酸是核酸的基本組成單位；核酸是“磷酸核糖(堿

25、基)磷酸”的核苷多聚體。l四核苷酸假說(shuō)奠定了核酸化學(xué)基礎(chǔ)。但同時(shí)認(rèn)為：核酸多聚體是由“四核苷酸結(jié)構(gòu)”重復(fù)形成；每個(gè)四核苷酸結(jié)構(gòu)包含四種堿基各一個(gè)；所以事實(shí)上認(rèn)為在任何DNA中，四種堿基是等量的，DNA是四核苷酸結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單重復(fù)。這種觀念影響了人們對(duì)核酸生物學(xué)功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。lE.Chargaff于1946-1950年根據(jù)紙層析、離子交換層析和紫外分光光度試驗(yàn)結(jié)果提出查伽夫定則：四種堿基的數(shù)量不是等量的；同一物種DNA堿基組成不變，而物種間則有很大不同；嘌呤堿基總量與嘧啶堿基的總量(克分子總量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。l查伽夫定則表明：核酸并不是四核苷酸結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單重復(fù)，核酸的堿

26、基序列信息可能具有重要意義。l以后的研究表明：堿基序列正是核酸生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，是遺傳信息的內(nèi)在形式。lDNA及RNA分子序列分析技術(shù)也是最重要的分子遺傳學(xué)研究技術(shù)：Sanger雙脫氧法；Maxam&Gillbert化學(xué)法；基于化學(xué)法的DNA序列自動(dòng)分析儀已成為常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備。*(一)、DNA分子結(jié)構(gòu)的研究1. 鮑林研究小組2. 威爾金斯、富蘭克林研究小組3. 沃生、克里克研究小組(二)、 DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的意義3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性l在“四核苷酸結(jié)構(gòu)”理論的誤導(dǎo)下，人們普遍認(rèn)為核酸的組成、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可能不具有重要

27、功能，一度忽略了對(duì)核酸的研究。l上世紀(jì)中期，眾多研究表明：核酸是遺傳信息的載體，顯然DNA的結(jié)構(gòu)研究是進(jìn)一步研究其功能和作用方式的基礎(chǔ)。l也由此激發(fā)了科學(xué)家從事核酸結(jié)構(gòu)研究的興趣，當(dāng)時(shí)進(jìn)行DNA結(jié)構(gòu)研究的科學(xué)家很多，最重要有：l主要工作：鮑林(Pauling)等1951年(提出蛋白質(zhì)-螺旋模型后)開(kāi)始研究DNA分子結(jié)構(gòu)。根據(jù)阿斯伯利Astbury等1938年獲得的DNA分子晶體X射線衍射圖像(顯示DNA分子晶體呈螺旋結(jié)構(gòu))進(jìn)行研究。提出DNA分子三鏈螺旋結(jié)構(gòu)模型：引入多鏈、螺旋和氫鏈等概念。l評(píng)價(jià)：雖然他們提出的模型并不正確，但是其研究方向和所采用的方法卻為DNA分子結(jié)構(gòu)模型研究確立了方向。l

28、注：1954年鮑林因研究物質(zhì)聚合力而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。l主要工作成就：Wilkins和Franklin改進(jìn)了DNA分子晶體X射線衍射圖譜技術(shù)；于1951年獲得了更為清晰的圖像；結(jié)果表明：堿基位于螺旋內(nèi)側(cè)而磷酸基團(tuán)在外側(cè)，同時(shí)測(cè)得了DNA螺旋的直徑和螺距。Waston、Crick(1951-1953)：l研究手段非常簡(jiǎn)單：用紙板等做磷酸、核糖和堿基模型，拼湊DNA分子的三維結(jié)構(gòu)。l理論知識(shí)深厚、富于創(chuàng)造性；視野廣闊、收集信息全面并善于分析利用。l主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三個(gè)方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他們的第三個(gè)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。l

29、現(xiàn)在人們公認(rèn)這是分子遺傳學(xué)建立的標(biāo)志。l為此Waston，Crick和Wilkins于1962年獲得了諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。lDNA雙螺旋模型結(jié)構(gòu)同時(shí)表明：DNA復(fù)制的明顯方式半保留復(fù)制。Waston和Crick在1953年就指出：DNA可以按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行半保留復(fù)制。而在此之前對(duì)復(fù)制方式人們對(duì)一無(wú)所知?；蚝投嚯某删€性對(duì)應(yīng)的一個(gè)可能的理由：DNA核苷酸順序規(guī)定該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸順序；DNA中的遺傳信息就是堿基序列；并存在某種遺傳密碼(genetic code)，將核苷酸序列譯成蛋白質(zhì)氨基酸順序。l在其后的幾十年中，科學(xué)家們沿著這兩條途徑前進(jìn)，探明了DNA復(fù)制、遺傳信息表達(dá)與中心法

30、則等內(nèi)容。1.DNA復(fù)制的起點(diǎn)(單起始點(diǎn)與多起始點(diǎn))；2.復(fù)制的方向(單向與雙向)；3.復(fù)制的拓?fù)鋵W(xué)；4.鏈的延伸(半不連續(xù))；5.復(fù)制的終止；6.單鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制；7.復(fù)制的忠實(shí)性(準(zhǔn)確性)；8.復(fù)制的酶學(xué)；9.復(fù)制的調(diào)控。一、中心法則及其發(fā)展二、遺傳信息的轉(zhuǎn)錄(RNA的合成) 與RNA的加工三、遺傳密碼及其特性四、遺傳信息的翻譯五、基因表達(dá)調(diào)控l中心法則(central dogma)闡述生物世代、個(gè)體以及從遺傳物質(zhì)到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質(zhì)復(fù)制、性狀表現(xiàn)過(guò)程中的信息流向。l最初由Crick提出，并經(jīng)過(guò)了多次修正。l反轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄)：反轉(zhuǎn)錄酶；cDNA。lRNA的自我復(fù)制

31、。lDNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。l遺傳密碼的基本特性：三聯(lián)性；非重疊性；連續(xù)性；簡(jiǎn)并性；有序性；通用性。l起始密碼子與終止密碼子：起始密碼子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；終止密碼子(無(wú)義密碼子)：UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(乳白)。l通用性的另外情況：一、經(jīng)典遺傳學(xué)中基因的概念二、生化遺傳和早期分子遺傳學(xué)對(duì)基因概念的發(fā)展三、基因的微細(xì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)四、現(xiàn)代分子遺傳學(xué)關(guān)于基因的概念l生化遺傳及早期分子遺傳研究在兩個(gè)重要方面發(fā)展了基因的概念：基因是DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區(qū)段，并且在染色體上位置固定、序列連續(xù)；遺傳信息就存在于核苷酸(堿基)序列中?！耙粋€(gè)基因一個(gè)酶”，基因表

32、達(dá)為蛋白質(zhì)；基因的核苷酸序列決定蛋白質(zhì)氨基酸序列。lSeymour Benzer(1955)用E. Coli烈性噬菌體T4突變型遺傳研究證明：擬等位基因的說(shuō)法是不正確的。T4野生型在E. Coli菌苔上產(chǎn)生小而不規(guī)則噬菌斑。T4突變品系按表型可分為：rI、rII、rIII三類(lèi)。其中rII在E.Coli B上產(chǎn)生快速溶菌現(xiàn)象，形成大而圓噬菌斑，在E.Coli K()上不能生長(zhǎng)。l試驗(yàn)方法：最初得到8個(gè)不同的r突變型品系，8個(gè)突變基因均定位于T4DNA的一個(gè)區(qū)段內(nèi)(rII區(qū)段)；將8種突變型兩兩組合混和感染E. Coli B菌株(雙重感染, double infection)；從混和培養(yǎng)物中提取噬

33、菌體顆粒感染E. coli K()。l試驗(yàn)結(jié)果：在菌苔上獲得了許多小而粗糙的野生型噬菌斑。l結(jié)果分析：回復(fù)突變的頻率很小，不會(huì)產(chǎn)生如此高頻率的野生型噬菌體(斑)；所以野生型只能由重組產(chǎn)生。用擬等位基因可以解釋試驗(yàn)結(jié)果；但同時(shí)意味著：rII區(qū)段內(nèi)至少存在8個(gè)擬等位基因。Benzer先后分離到400多個(gè)不同的rII突變。在rII區(qū)段內(nèi)存在如此多的基因顯然是不可能的。l結(jié)論：這些基因并不是所謂的擬等位基因，而就是rII區(qū)段突變形成的復(fù)等位基因?；蚴怯筛〉闹亟M單位構(gòu)成，野生型產(chǎn)生于基因內(nèi)重組，從而推翻了經(jīng)典遺傳學(xué)基因不可分性的性質(zhì)。l操作方法：用兩種rII突變型雙重感染B品系，收集溶菌液；分別接種

34、到B品系、K()品系菌苔上；考察兩個(gè)品系菌苔上的噬菌斑數(shù)目，就可以計(jì)算兩個(gè)突變位點(diǎn)間的重組值；繪制連鎖遺傳圖。l由于采用了條件致死選擇系統(tǒng)(即在E. Coli K()上rII不能生長(zhǎng))，分辨率極高，可以檢測(cè)到十萬(wàn)分之一的重組值。l重組值檢測(cè)精度可達(dá)十萬(wàn)分之一，但實(shí)際結(jié)果不會(huì)低于0.01%；可推斷基因內(nèi)存在最小重組單位，本澤爾將最小重組單位定義為重組子(recon)。lrII區(qū)段存在多種突變的結(jié)構(gòu)表明：基因也并非最小突變單位。Benzer提出用突變子(muton)來(lái)描述基因突變的最小單位。l理論上講突變子不必等于重組子。但以后研究顯示：突變子和重組子都是一個(gè)核苷酸對(duì)或者堿基對(duì)(bp)。所以基因內(nèi)

35、每個(gè)堿基均可能發(fā)生突變，任意兩個(gè)堿基間均能發(fā)生交換重組。l假定有兩個(gè)獨(dú)立起源的隱性突變，具有類(lèi)似的表型，如何判定是屬于同一基因(功能單位)的突變還是分別屬于兩個(gè)基因(功能單位)的突變呢？l在二倍體生物中，可以建立雙突變雜合體。雙突變體雜合體有兩種形式，即順式(cis)和反式(trans)，如圖所示：l根據(jù)兩突變反式雙雜合體有無(wú)互補(bǔ)作用可以判斷它們是否為同一個(gè)功能單位的突變：突變型無(wú)互補(bǔ)作用為同一功能單位的突變；野生型有互補(bǔ)作用為不同功能單位的突變。l這種測(cè)驗(yàn)稱(chēng)為互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)，也稱(chēng)為順?lè)礈y(cè)驗(yàn)(cis-trans test)。Benzer將順?lè)礈y(cè)驗(yàn)所確定的最小遺傳功能單位稱(chēng)為順?lè)醋?cistron)，

36、順?lè)醋觾?nèi)發(fā)生的突變間不能互補(bǔ)。lrII區(qū)段突變的性質(zhì)：rII突變具有共同性狀，按經(jīng)典遺傳學(xué)理論，rII區(qū)段為一個(gè)基因；如果基因是最小的功能單位，它也是一個(gè)順?lè)醋?。lBenzer通過(guò)順?lè)礈y(cè)驗(yàn)表明：100多個(gè)rII突變型可以分為A、B兩組，組間突變型間能夠突變，而組內(nèi)的突變型間不能互補(bǔ)；與rII區(qū)段連鎖圖對(duì)照發(fā)現(xiàn)：兩組突變分別位于rII區(qū)段的兩端| A | B |。l經(jīng)典遺傳學(xué)意義上的一個(gè)基因(rII區(qū)段)實(shí)際上有兩個(gè)順?lè)醋?功能單位)。l因此基因也很可能不是遺傳的最小功能單位。l有些基因具有一個(gè)順?lè)醋?，有些基因具有多個(gè)順?lè)醋印在多順?lè)醋忧闆r下，基因是幾個(gè)功能單位的復(fù)合體。lBenzer提出“一

37、個(gè)順?lè)醋右粭l多肽鏈”。(一)、 現(xiàn)代基因概念l基因是DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區(qū)段。l基因由重組子、突變子序列構(gòu)成的。重組子是DNA重組的最小可交換單位；突變子是產(chǎn)生突變的最小單位；重組子和突變子都是一個(gè)核苷酸對(duì)或堿基對(duì)(bp)。l基因可以包含多個(gè)功能單位(順?lè)醋?。l根據(jù)基因的原初功能可以將基因分為：1. 編碼蛋白質(zhì)的基因，即有翻譯產(chǎn)物的基因。如結(jié)構(gòu)蛋白、酶等結(jié)構(gòu)基因和產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)基因。2. 沒(méi)有翻譯產(chǎn)物，不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA不翻譯，如編碼tRNA、rRNA。3. 不轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)段。如啟動(dòng)基因、操縱基因。啟動(dòng)基因是轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA多聚酶與DNA結(jié)合的部位。操縱

38、基因是阻遏蛋白、激活蛋白與DNA結(jié)合的部位。l1. 重復(fù)基因：指在染色體組上存在多份拷貝的基因。重復(fù)基因往往是生命活動(dòng)中最基本、最重要的功能相關(guān)的基因。最典型的重復(fù)基因是rRNA、tRNA和組蛋白基因等。l2. 重疊基因：同一段DNA序列，由于閱讀框架(轉(zhuǎn)錄范圍)不同，同時(shí)成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。因此基因在染色體上可能有重疊，甚至一個(gè)基因完全存在于另一個(gè)基因內(nèi)部。l生物遺傳和早期分子遺傳認(rèn)為基因是一個(gè)連續(xù)的、完整的結(jié)構(gòu)。1977年Doel研究表明：卵清蛋白基因中間存在不表達(dá)的堿基序列，表明基因的DNA序列可能是不連續(xù)的。外顯子：參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段；內(nèi)含子：不參加蛋白質(zhì)編碼的D

39、NA片段。l真核生物基因可能是不同外顯子的組合斷裂基因。l又稱(chēng)為轉(zhuǎn)座子(transposon)、轉(zhuǎn)座因子、轉(zhuǎn)位因子(transposable element)。生化遺傳和早期分子遺傳學(xué)還認(rèn)為基因在染色體上的相對(duì)位置是固定的。后來(lái)發(fā)現(xiàn)某些DNA序列可以在染色體上轉(zhuǎn)變位置。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位的過(guò)程也是一個(gè)遺傳重組過(guò)程；轉(zhuǎn)座子在染色體上轉(zhuǎn)位可能會(huì)引起插入位置基因功能喪失(突變)，再次轉(zhuǎn)位離開(kāi)插入點(diǎn)時(shí)便會(huì)發(fā)生基因功能的恢復(fù)。一、locus與site二、基因突變的類(lèi)型三、DNA的防護(hù)機(jī)制四、DNA修復(fù)與突變的產(chǎn)生五、化學(xué)因素誘變的分子機(jī)制l經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為：基因是染色體上的一個(gè)點(diǎn)，稱(chēng)位點(diǎn)(site)。l現(xiàn)代基因概

40、念認(rèn)為：基因是DNA分子帶有遺傳信息的堿基序列區(qū)段；基因是由眾多堿基對(duì)構(gòu)成，此時(shí)將一個(gè)堿基對(duì)稱(chēng)為基因的一個(gè)位點(diǎn)(site)；而將基因在染色體上的位置則稱(chēng)為座位(locus)。1. 根據(jù)突變所引起的表型改變分為：形態(tài)突變型；生化突變型；致死突變型；條件致死突變型。2. 根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的改變方式：堿基替換突變；堿基倒位；移碼(插入與缺失)突變。3. 從DNA堿基序列改變的多少：?jiǎn)吸c(diǎn)突變(替換)；與經(jīng)典遺傳學(xué)的點(diǎn)突變point mutation比較.多點(diǎn)突變(移碼)。4. 從突變所引起的遺傳信息意義的改變：同義突變；錯(cuò)義突變；無(wú)義突變。一、 遺傳工程概述*二、 染色體工程*三、 細(xì)胞工程四、 基因工程

41、l遺傳研究要闡明遺傳與變異的現(xiàn)象和基本規(guī)律，探索遺傳與變異的原因及其物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上：解釋、研究生物進(jìn)化的原因、過(guò)程和規(guī)律(遺傳與進(jìn)化)。改善動(dòng)、植物和微生物的遺傳特性按照人類(lèi)的意愿，創(chuàng)造、培育各種生物的新類(lèi)型、新品種的人工進(jìn)化過(guò)程(育種學(xué))。育種工作的理論和技術(shù)水平在很大程度上取決于遺傳學(xué)所取得的成就。l訖今為止，動(dòng)、植物育種的絕大部分成就都是以經(jīng)典遺傳、細(xì)胞遺傳和數(shù)量遺傳理論為基礎(chǔ)所取得的。六、七十年代的綠色革命；育種工作面臨的問(wèn)題。(一)、 遺傳工程的基礎(chǔ)l人類(lèi)對(duì)自然改造的能力取決于對(duì)自然規(guī)律的認(rèn)識(shí)水平。分子遺傳、生物化學(xué)及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的理論和技術(shù)發(fā)展使生物遺傳操作的能力正

42、在不斷提高。l遺傳工程的理論與技術(shù)基礎(chǔ)主要來(lái)自于：1. 分子遺傳學(xué)的理論；2. 生物化學(xué)及分子生物學(xué)的成就；3. 細(xì)胞生物學(xué)理論和技術(shù)。l生物技術(shù)l生物工程：遺傳工程；蛋白質(zhì)工程、酶工程；微生物工程；l遺傳工程：在分子遺傳理論、技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)工程設(shè)計(jì)與施工方式，從細(xì)胞、分子水平改造生物遺傳特性。l作為一個(gè)綜合性的技術(shù)群體系，廣義的遺傳工程包含許多相關(guān)的組成部分，其主要的部分有三個(gè)：1. 染色體工程；2. 細(xì)胞工程；3. 基因工程。l狹義的遺傳工程指的是基因工程。l細(xì)胞工程的主要技術(shù)和研究領(lǐng)域包括：細(xì)胞、原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)；細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生；體細(xì)胞無(wú)性系變異的誘導(dǎo)、篩選與應(yīng)用；以細(xì)胞

43、、原生質(zhì)體作為基因工程受體；細(xì)胞、原生質(zhì)體融合、雜種細(xì)胞篩選、鑒定與應(yīng)用。l采用體細(xì)胞雜交在物種間進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)移與應(yīng)用的必要條件是：細(xì)胞、原生質(zhì)體遺傳全能性能充分實(shí)現(xiàn)，再生成新的生物個(gè)體。l對(duì)植物而言，細(xì)胞和原生質(zhì)體再生技術(shù)已經(jīng)比較成熟。曾經(jīng)是人們公認(rèn)難題的禾本科植物原生質(zhì)體再生在近二十多年來(lái)也已取得巨大進(jìn)展。l對(duì)動(dòng)物而言，克隆羊“多利”的誕生表明：動(dòng)物細(xì)胞(包括人體細(xì)胞)再生成為個(gè)體都是可能，其技術(shù)實(shí)現(xiàn)需要的僅僅是時(shí)間。l最初常用的轉(zhuǎn)基因受體有葉圓片、幼胚、愈傷組織等植物組織器官。l在這些組織、器官中：細(xì)胞壁的存在會(huì)增加操作的難度；產(chǎn)生細(xì)胞嵌合體現(xiàn)象，難以篩選轉(zhuǎn)化子。l因此原生質(zhì)體是最具潛力的

44、植物基因工程受體，轉(zhuǎn)化效率高、篩選方便。l采用細(xì)胞、原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)再生獲得雜種個(gè)體(雙二倍體)，可避免有性雜交障礙。l動(dòng)物細(xì)胞不具有細(xì)胞壁，細(xì)胞融合技術(shù)較植物成熟和成功。當(dāng)然動(dòng)物細(xì)胞融合都局限于獲得雜種細(xì)胞及其無(wú)性細(xì)胞系。可以預(yù)見(jiàn)：用雜種細(xì)胞核代替維爾穆特獲得克隆羊所采用的乳腺細(xì)胞核可以獲得物種間雜種生物個(gè)體。人與小鼠雜種細(xì)胞的無(wú)性細(xì)胞系曾在人類(lèi)基因染色體定位研究上發(fā)揮重要的作用。l植物細(xì)胞融合由于細(xì)胞壁的存在而受到極大的限制。因此，去除細(xì)胞壁分離原生質(zhì)體的技術(shù)是植物細(xì)胞雜交的基礎(chǔ)。獲得雜種細(xì)胞及其再生植株后，即可進(jìn)行物種間細(xì)胞核、染色體以及細(xì)胞器的轉(zhuǎn)移。 所謂的遺傳工程就

45、是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遺傳物質(zhì)，在體外切割、拼接和重新組合。然后通過(guò)載體把重組分子引入受體細(xì)胞，使外源在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。按人們的需要生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。所以基因工程（gene engineering）也稱(chēng)為遺傳工程（genetic engineering）、基因操作（gene manipulation）、重組技術(shù)（recombination DNA techniques）。有時(shí)人們還稱(chēng)它為基因克?。╣ene cloning）或分子克?。╩olecular cloning）。 遺傳工程的基本操作程序大致包括：目的

46、基因的制備，載體的選擇，體外重組，重組引入受體細(xì)胞，克隆轉(zhuǎn)化子的篩選，重組的檢測(cè)等。 第一節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)一、限制性核酸內(nèi)切酸（restriction endonuclease）： 這 類(lèi) 酶 又 簡(jiǎn) 稱(chēng) 為 限 制 性 內(nèi) 切 酶 或 限 制 酶（ restriction enzyme）。限制性?xún)?nèi)切酶本來(lái)是微生物細(xì)胞中用于專(zhuān)門(mén)水解外源的一類(lèi)酶，其功能是避免外源的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割的特點(diǎn)，可以將限制性?xún)?nèi)切酶分為三類(lèi)： 型酶：分子量較大，反應(yīng)需Mg+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。這類(lèi)酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒(méi)有特異

47、的切割位點(diǎn)，所以在基因工程中應(yīng)用不大。型酶：分子量較小（105Da），反應(yīng)只需Mg+的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類(lèi)酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)上。許多型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重組。型酶：這類(lèi)酶可識(shí)別特定順序，并在這一順序的3端2426bp處切開(kāi)，所以它的切割位點(diǎn)也是沒(méi)有特異性的。 同裂酶（isoschizomers)： 指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂、酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。同尾酶（isocaudamer）： 指來(lái)源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)

48、生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個(gè)字母：大寫(xiě)，表示所來(lái)自的微生物的屬名的第一個(gè)字母。第二、三字母：小寫(xiě)，表示所來(lái)自的微生物種名的第一、二個(gè)字母。其它字母：大寫(xiě)或小寫(xiě)，表示所來(lái)自的微生物的菌株號(hào)。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。例：EcoR I: 來(lái)自于Escheria coli RY13的第一個(gè)限制酶。二、末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）該酶全稱(chēng)為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反應(yīng)與DNA pol I 相似，所不同的是

49、它不需要模板，它可以含有的片段為引物，在端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。 平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約1020個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如： CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。 Hpa II Hpa IIBamH I 或Sau3A三、連接酶（DNA ligase） 該酶常從噬菌體的

50、受感細(xì)胞中提取，是由噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是連接酶。它可催化中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)合起來(lái)。 DNA連接酶對(duì)具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對(duì)平末端的DNA分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。 四、反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase） 這類(lèi)酶來(lái)自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以為模板，催化合成。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。五、DNA pol I及Klenow片段 該酶常用于制備放射性比度比活體標(biāo)記高得多的探針，探針的制備方法是采用所謂的缺口平移（nick translati

51、on）法制備的。 該酶還用于裂口（gap）修補(bǔ)、反轉(zhuǎn)錄第二條鏈的合成（ Klenow ）、隱蔽末端的填平反應(yīng)（ Klenow ）等。Klenow片段：DNA pol I 用枯草桿菌蛋白酶水解成兩個(gè)片段，小片段（36KD）具有5 3 核酸外切酶活性，大片段（76KD）稱(chēng)為Klenow片段，具有DNA鏈聚合及3 5核酸外切酶的活性。 Klenow第二節(jié)第二節(jié) 目的基因的制備目的基因的制備一、化學(xué)合成法： 1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。 在體外，可以合成一系列長(zhǎng)約幾百的寡聚核苷酸鏈，然后按照基因的順序?qū)⑦@些短的核苷酸鏈連接起來(lái)。 化學(xué)合成的不足之處在于：（）要已知基因的核苷酸

52、順序；（）基因不能太大，這一方面是測(cè)定核苷酸（或氨基酸）順序比較困難，另一方面是因?yàn)槊看蝺H能合成幾百的短片段，短片段越多，要連接成正確的基因順序就越困難，得率越低；（）價(jià)格昂貴。 化學(xué)合成的最大優(yōu)點(diǎn)是可以合成一些分離較困難的基因。同時(shí)，所合成的基因不含內(nèi)含子。在原核生物中由于不能進(jìn)行內(nèi)含子剪接，所以一旦將含有內(nèi)含子的基因引入原核生物中表達(dá)，其產(chǎn)物往往是沒(méi)有活性的。 由于化學(xué)合成法有上述一些優(yōu)缺點(diǎn)，所以這種方法較多地用于合成一些比較小的基因，如某些激素基因。并也取得一些成功的例子，例如胰島素基因，生長(zhǎng)激素釋放抑制激素基因等。 由于技術(shù)的進(jìn)步，目前已極少利用化學(xué)合成法制備目的基因，而是利用DNA的

53、化學(xué)合成法合成一些短的DNA片段作為探針（probe）或PCR的引物。 二、從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中分離cDNA文庫(kù)及基因組文庫(kù)的構(gòu)造我們將在后面討論，如果制備好了cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)，那么用原位雜交法來(lái)篩選（screening）所需要的目的基因所在的克隆子。將這一克隆子大量繁殖，提取，便可獲得所需的目的基因。 必要的時(shí)候還可以建立差示文庫(kù)（differential library）。三、法：PCR（polymerase chain reaction)技術(shù)是Mullis于1986年發(fā)明的一項(xiàng)體外快速大量擴(kuò)增片段的方法（獲1994年諾貝爾獎(jiǎng)）。其基本原理就是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程

54、，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入欲被擴(kuò)增的DNA片段，作為模板；人工合成的寡聚核苷酸，作為引物；耐熱的DNA聚合酶（Taq）以及四種核苷酸三磷酸。反應(yīng)時(shí)，先加熱至約92，使模板變性。降溫至約50使引物與模板結(jié)合（退火），加溫至，在Taq酶作用下，使新鏈延伸。重復(fù)92（變性）、50（復(fù)性）、72（延伸）的過(guò)程使片段得到不斷的擴(kuò)增，可以重復(fù)幾十個(gè)周期。片段將2n（為反應(yīng)周期數(shù)）的倍數(shù)增加。四、mRNA差別顯示分離目的基因 根據(jù)表達(dá)特征，真核細(xì)胞的基因可以分為兩類(lèi)：一是所謂的看家基因（house-keeping gene），另一類(lèi)是發(fā)育調(diào)控基因（developmental regulated gene）。 在不同

55、的生長(zhǎng)時(shí)期、在個(gè)體的發(fā)育與分化的不同階段、在生物體對(duì)外界環(huán)境的壓力的反應(yīng)、在個(gè)體的衰老與死亡等不同的環(huán)境下發(fā)育調(diào)控基因的表達(dá)是不同的，這就是基因的差別表達(dá)（differential expression）。mRNA的差別顯示技術(shù)就是用來(lái)分離這些差別表達(dá)的基因的一項(xiàng)有用的技術(shù)。 該技術(shù)是P.Liang & A.D.Pardee 1992年建立的，全稱(chēng)為mRNA差別顯示PCR(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR)原理：該技術(shù)是利用兩組特殊的引物對(duì)差別表達(dá)的基因進(jìn)行擴(kuò)增。3端引物：利

56、用mRNA的poly A尾巴設(shè)計(jì)。根據(jù)mRNA結(jié)構(gòu)分析知道，poly A尾巴之前的兩個(gè)堿基只有12種可能的排列組合：根據(jù)這12種排列組合，設(shè)計(jì)12種不同的引物，這樣就將所有mRNA分成了12組。這些引物由1112個(gè)T及兩個(gè)其它的堿基組成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱(chēng)錨定引物。5端引物：5端為10個(gè)堿基（10-mer）組成的隨機(jī)引物。每一個(gè)隨機(jī)引物都可能與總mRNA中的某一些分子發(fā)生雜交，雜交位點(diǎn)也可能在mRNA的不同位點(diǎn)上。用一種3錨定引物和一種5隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得50100條100500bp的DNA擴(kuò)增帶。為了

57、要尋找更多的DNA差異帶，應(yīng)使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5隨機(jī)引物。第三節(jié)第三節(jié) 基因工程載體基因工程載體 載體（）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段可使其它的片段連接在它的上面，而進(jìn)行復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個(gè)性能：分子較小，可攜帶比較大的片段。能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)。有適合的標(biāo)記，易于選擇。有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。 一、質(zhì)粒

58、（plasmid）載體 質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體外的小分子環(huán)狀，一般大小約106108D，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過(guò)適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。 作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。以Ampr和Tetr為選擇性標(biāo)記，克隆位點(diǎn)在這兩個(gè)選擇性標(biāo)記的單酶切位點(diǎn)上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp）pUC系列： 是目前最常用的E.coli質(zhì)粒載體。包括pUC7、 pUC8、 pUC9、 pUC12、 pUC13、 pUC18、 pUC19、pUC118、pUC119等。優(yōu)點(diǎn)

59、：分子量更小，拷貝數(shù)更高：分子量在3KB左右，拷貝數(shù)可達(dá)每細(xì)胞500700個(gè)，因此不需要氯酶素?cái)U(kuò)增。引入多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites, MCS）方便操作。引入lacZ基因方便篩選。篩選原理互補(bǔ)蘭白篩選： Lac Z是lac Z基因的突變型，編碼半乳糖苷酶N端的146個(gè)氨基酸（全長(zhǎng)1201氨基酸）。MCS也在這個(gè)區(qū)域內(nèi)。這類(lèi)載體的適合宿主細(xì)胞必須是Z基因突變型，只具有Z基因C端的序列。當(dāng)兩個(gè)Z基因的突變產(chǎn)物在一起時(shí)可產(chǎn)生蛋白質(zhì)間的互補(bǔ)，稱(chēng)互補(bǔ)。 具有互補(bǔ)的細(xì)菌培養(yǎng)在含IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）的培養(yǎng)基上會(huì)

60、形成的蘭色菌落。相反，不互補(bǔ)則產(chǎn)生白色的菌落。X-gal本身是無(wú)色的，在半乳糖苷酶的水解下產(chǎn)生蘭色的物質(zhì)（被水解為無(wú)色的半乳糖及深蘭色的5-溴-4-氯靛蘭），因此菌落為蘭色。如果在MCS位點(diǎn)上插入DNA片段導(dǎo)致插入突變，則不能產(chǎn)生互補(bǔ)，因此菌落是白色的。 IPTG起誘導(dǎo)表達(dá)的作用，相當(dāng)于乳糖，但它的誘導(dǎo)效率遠(yuǎn)高于乳糖。原核表達(dá)載體：pGEM系列包括pGEM-3、 pGEM-3Z、 pGEM-3Zf（-）、 pGEM-4、 pGEM-4Z等。帶有噬菌體編碼的RNA聚合酶啟動(dòng)子SP6及T7啟動(dòng)子，可用于外源基因的表達(dá)。pGEX系列： 包括pGEX-1、 pGEX-1T、 pGEX-2T、 pGEX-3X等。該系列是一類(lèi)融合表達(dá)載體，在克隆位點(diǎn)上游有一個(gè)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移