最全的G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié)44頁

1、（一）篩選結(jié)果鑒定：（1）基因組DNA提取PCR鑒定外源基因（2）SHG-44-重組pcDNA3陽性細(xì)胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫印跡鑒定P16蛋白表達(dá)（Western-blot）。（3）測定外源性基因?qū)HG-44細(xì)胞增殖的影響流式細(xì)胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3單細(xì)胞懸液70%酒精固定裂解細(xì)胞核糖核酸酶消化碘化丙啶染色上機分析G1期和G2/M、S期比例。細(xì)胞生長曲線測定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA35×104/孔接種24孔培養(yǎng)板24hr后各自用苔盼藍(lán)染色計數(shù)細(xì)胞計算細(xì)胞

2、生長抑制百分率。軟瓊脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3104 細(xì)胞0.3%低熔點瓊脂糖培養(yǎng)1-2周后計數(shù)不可少于50個細(xì)胞的克隆數(shù)計算克隆形成率抑制率。三、注意事項1、    優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件（脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間）每種細(xì)胞和質(zhì)粒均須進(jìn)行。用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應(yīng)在無菌條件下，這是細(xì)胞慣常的做法。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無需濾過除菌。2、    預(yù)備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無血

3、清下進(jìn)行。但是在隨后的脂質(zhì)體/ DNA與被轉(zhuǎn)染細(xì)胞共孵育的過程中，血清又是培養(yǎng)基的一部分。3、    在轉(zhuǎn)染之前更換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率，但所用培養(yǎng)基必須37預(yù)溫。4、    脂質(zhì)體/ DNA混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。常見問題和解答：Q：我覺得套環(huán)法操作不如96孔辦法效率高。A：也不一定.依據(jù)實驗?zāi)康呐c要求而定. 如果克隆效率較低的細(xì)胞,套環(huán)可能更好.用96孔板法,如果不是每孔單個細(xì)胞,就不能保證是單克隆.即使是增加到每孔十幾個細(xì)胞或上百個,一個96

4、孔板也只能培養(yǎng)一萬個細(xì)胞,十萬個細(xì)胞就至少需要10個板,100萬個細(xì)胞就需要100個板,對于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選或基因打靶,工作量就太大了.且細(xì)胞在單獨生長條件下,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如千萬個細(xì)胞共同培養(yǎng)活力好. 因此還得看這位朋友使用的是什么細(xì)胞,有限細(xì)胞系還是無限細(xì)胞系,轉(zhuǎn)基因還是非轉(zhuǎn)基因,篩選還是不篩選,需要的單細(xì)胞克隆株數(shù)量多少?Q：請問一種細(xì)胞如果轉(zhuǎn)染了穩(wěn)定表達(dá)的，含neo抗性基因的質(zhì)粒后，如何用G418篩選？我查看了國內(nèi)、外50幾篇文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)沒有一個定論的說法。即使對于同一種細(xì)胞其篩選劑量和篩選時間也不一樣。我自己認(rèn)為，從理論上講，如果穩(wěn)定表達(dá)最好要一直篩選到細(xì)胞傳代后。不知這種觀點對不對。然而開始篩

5、選的劑量、維持劑量以及篩選持續(xù)時間又該如何確定？維持劑量與開始篩選時的劑量是否有一定關(guān)系？A：1. G418篩選要做預(yù)試驗確定最佳濃度，將細(xì)胞稀釋至1000cell/ml，每孔100ul加入有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等2個級別, 培養(yǎng)10-14天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400-左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選濃度的一半。 。我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因為有時候抗性基因會丟失，如果沒有G418，很快會形成優(yōu)勢的。 。

6、即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重要的。Q：請問：能談一談單克隆化操作的步驟以及其與目的基因表達(dá)的關(guān)系嗎？A：轉(zhuǎn)染后，每個細(xì)胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的，目的蛋白表達(dá)有的多，有的少，外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞由于代謝負(fù)荷較小，所以生長較快，在生長若干代之后，表達(dá)少的細(xì)胞會形成優(yōu)勢，長期之后，表達(dá)最弱的細(xì)胞會由于競爭優(yōu)勢占主要，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因后，表達(dá)越來越暗就是這個道理。所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致，也是對高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。操作用96孔板法，每代細(xì)胞長滿后，大多數(shù)凍存，留cell左右就可以進(jìn)行該操作了，該方法在很多關(guān)

7、于單克隆抗體和細(xì)胞原代培養(yǎng)書中均有講述，我就不贅述了。必須指出，單克隆化要做幾遍，一遍是不夠的，我前十代都是這樣的，結(jié)果綠色熒光蛋白不但沒減弱，反而增強了很多?，F(xiàn)在很多代了，很穩(wěn)定。Q：1。我的質(zhì)粒中含有SV40與neo基因，好像就不存在外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞形成優(yōu)勢這個問題了吧。 2。按您的講法，篩選要進(jìn)行10代，那么維持劑量要進(jìn)行多長時間？如果我使用對照組,在對照組細(xì)胞全部死亡后就用維持劑量進(jìn)行培養(yǎng)行嗎？ 3。在細(xì)胞用胰酶進(jìn)行傳代時，此時細(xì)胞膜受到一定影響，如果培養(yǎng)基中存在G418對細(xì)胞是否有影響？ 4。既然細(xì)胞表達(dá)neo,從理論上講是否無論多大濃度的G418對之都無影響？A：1.可以肯定的

8、是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機的而且不是單拷貝的，這點我們做過FISH驗證過，表達(dá)量與整合數(shù)目，上游序列特性，特定部位DNA立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了SV40只是增加了表達(dá)了數(shù)目，但并不能掩蓋其它因素對表達(dá)的影響。按你的講法，轉(zhuǎn)染完GFP的細(xì)胞應(yīng)該亮度一致，但實際上差別很大。neo基因也是這樣，而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會相同，不同細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會相同，這點可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀點理解。有時，neo表達(dá)了，但目的基因丟失了的情況也是有的。 。那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細(xì)胞內(nèi)隨機含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因基因，那么，一種基因拷貝數(shù)為0的

9、可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。打個比方，一個大口袋，抓個紅球，再抓100個黃球，然后以從中抓若干個，這些球均為紅球的概率有多大呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是neo，黃球就是你的目的基因。我們用neo，實際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的例子來說，如果我們抓著個紅球，另一次抓著個紅球，可以肯定，的二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。因為二者出現(xiàn)的概率比是恒定的。維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持?？梢栽俚托荒軟]有。或者隔一定時間從新使用篩選量壓一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維一下，實際

10、上我們在篩選耐藥株呀。 。neo的產(chǎn)物是酶，過高的G濃度就要有更多的neo酶來支持，否則細(xì)胞也要被毒死的，而此時過多的酶要求會對細(xì)胞代謝造成太大負(fù)擔(dān)，細(xì)胞可能因此無法完成分裂與增殖，我們曾試過，即使在同一轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，在不同濃度的G418液中生長速度也不同，嚴(yán)重形態(tài)也不同。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理解吧。 。胰酶的作用不必理會，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，由幾代之后，不受影響的細(xì)胞會占優(yōu)勢的。    僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理，實在是個人經(jīng)驗，而且在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友，我還是想聽聽諸位專業(yè)人士的理解和經(jīng)驗。Another answer:1.外源基因整合后的基因表達(dá)量與整合的位置高度相關(guān)，如果整合發(fā)生在活性轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)區(qū)，則有利于表達(dá)。通常用的載體是靠非同源重組隨機整合的，所以為了獲得高表達(dá)細(xì)胞株，需要對重組克隆進(jìn)行篩選。某些載體如pcDNA3包含SV40的復(fù)制起始位點