MSI診斷檢測的方法和應(yīng)用ppt課件

1、整理課件整理課件MSI診斷檢測的方法和應(yīng)用診斷檢測的方法和應(yīng)用整理課件整理課件主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容 微衛(wèi)星不穩(wěn)定的相關(guān)背景微衛(wèi)星不穩(wěn)定的相關(guān)背景MSI的檢測意義的檢測意義MSI檢測方法檢測方法MSI檢測試劑盒檢測試劑盒整理課件整理課件背背 景景 介介 紹紹 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, (microsatellite instability, MSI)MSI)是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度的任何改變，出現(xiàn)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度的任

2、何改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。 主要機制：主要機制： DNADNA多聚酶的滑動導致重復(fù)序列中多聚酶的滑動導致重復(fù)序列中1 1個或多個堿基的個或多個堿基的錯配錯配 MSMS同源重組導致堿基對的丟失和插入同源重組導致堿基對的丟失和插入整理課件整理課件 19931993年，年，AltonenAltonen等首次發(fā)現(xiàn)，在等首次發(fā)現(xiàn)，在HNPCCHNPCC細胞中存在高頻率細胞中存在高頻率的的MSIMSI。目前已發(fā)現(xiàn)。目前已發(fā)現(xiàn)MSIMSI的腫瘤主要有的腫瘤主要有3 3類：類： 一類為一類為HNPCCHNPCC病人發(fā)生的結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌以及卵巢病人發(fā)生的結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜

3、癌以及卵巢癌癌, ,這一類腫瘤幾乎都表現(xiàn)為這一類腫瘤幾乎都表現(xiàn)為MSIMSI； 另一類為散發(fā)性結(jié)直腸癌另一類為散發(fā)性結(jié)直腸癌, ,這一類腫瘤發(fā)生這一類腫瘤發(fā)生MSIMSI概率約概率約15 30； 第三類為包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在內(nèi)的其它腫瘤第三類為包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在內(nèi)的其它腫瘤, ,這這一類腫瘤一類腫瘤MSIMSI發(fā)生頻率相對較低。發(fā)生頻率相對較低。背背 景景 介介 紹紹整理課件整理課件結(jié)直腸癌是是常見的消化道惡性腫瘤，我們每結(jié)直腸癌是是常見的消化道惡性腫瘤，我們每年有年有1313萬萬-16-16萬人罹患結(jié)直腸癌，其發(fā)病率占腫瘤萬人罹患結(jié)直腸癌，其發(fā)病率占腫瘤發(fā)病率的第三位，僅次于肺

4、癌和胃癌。發(fā)病率的第三位，僅次于肺癌和胃癌。 HNPCCHNPCC是常見的遺傳性腫瘤綜合癥，遺傳性結(jié)是常見的遺傳性腫瘤綜合癥，遺傳性結(jié)直腸癌是一個常染色體遺傳疾病直腸癌是一個常染色體遺傳疾病, ,目前研究表明微目前研究表明微衛(wèi)星不穩(wěn)定性可能是遺傳性結(jié)直腸癌發(fā)生的重要衛(wèi)星不穩(wěn)定性可能是遺傳性結(jié)直腸癌發(fā)生的重要機制。機制。背背 景景 介介 紹紹整理課件整理課件具有具有MSI的散發(fā)性結(jié)直腸癌的散發(fā)性結(jié)直腸癌,具有不同的臨床病理、具有不同的臨床病理、分子生物學特征分子生物學特征,表現(xiàn)為表現(xiàn)為:發(fā)病年齡較??；對某些化療發(fā)病年齡較??；對某些化療藥物藥物(如如5-FU、順鉑等、順鉑等)有原發(fā)性耐藥有原發(fā)性耐

5、藥; 生物學行為較生物學行為較好。好。MSI-H是是期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個標志物，也期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個標志物，也是患者不能從氟尿嘧啶單藥輔助化療獲益的療效預(yù)是患者不能從氟尿嘧啶單藥輔助化療獲益的療效預(yù)測指標。測指標。背背 景景 介介 紹紹整理課件整理課件微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義1. 1. 檢測檢測MSIMSI可以用于檢測是否為可以用于檢測是否為LynchLynch綜合征綜合征結(jié)直腸癌的遺傳易感性包括一些研究較清楚的遺傳性結(jié)直腸癌的遺傳易感性包括一些研究較清楚的遺傳性綜合征，例如綜合征，例如LynchLynch綜合征（又稱之為遺傳性非息肉病綜合征（又稱之為遺傳性非息肉病性

6、結(jié)直腸癌，性結(jié)直腸癌，HNPCCHNPCC）和家族性息肉?。ǎ┖图易逍韵⑷獠。‵APFAP）。）。在在HNPCC HNPCC 和散發(fā)性直腸癌中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是遍布整和散發(fā)性直腸癌中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是遍布整個基因組的現(xiàn)象，并且可能是導致癌癥發(fā)生的普遍機個基因組的現(xiàn)象，并且可能是導致癌癥發(fā)生的普遍機制。制。 整理課件整理課件 專家組推薦，專家組推薦， MMRMMR蛋白檢測應(yīng)強烈建議在所蛋白檢測應(yīng)強烈建議在所有有5050歲以下的結(jié)腸癌患者中開展，原因在于該歲以下的結(jié)腸癌患者中開展，原因在于該群體中患群體中患LynchLynch綜合征的可能性增加。而且，在綜合征的可能性增加。而且，在一些中心，現(xiàn)在對

7、所有的結(jié)直腸腫瘤組織進行一些中心，現(xiàn)在對所有的結(jié)直腸腫瘤組織進行免疫組化檢測（有時分析免疫組化檢測（有時分析MSIMSI）以來決定哪些患）以來決定哪些患者需要進行者需要進行LynchLynch綜合征相關(guān)的基因檢測綜合征相關(guān)的基因檢測. .微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義義整理課件整理課件 2. 檢測檢測MSI可以用于判斷患者預(yù)后可以用于判斷患者預(yù)后高危高危期患者，定義為預(yù)后較差者，包括：期患者，定義為預(yù)后較差者，包括：T4（B、C期）、組織學分化差（期）、組織學分化差（3/4級，不包級，不包括括MSI-H者），已經(jīng)有大量證據(jù)表明者），已經(jīng)有大量證據(jù)表明MMR蛋白蛋白表達缺失或表達缺失

8、或MSI-H是是期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個標志物。具有標志物。具有MSI-H腫瘤的腫瘤的期結(jié)腸癌患者，期結(jié)腸癌患者，3/4級分化（低分化）不再認為是高危因素。級分化（低分化）不再認為是高危因素。微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義整理課件整理課件3. 3. 檢測檢測MSIMSI以判斷是否需要輔助化療以判斷是否需要輔助化療對于對于期結(jié)腸癌是否需要輔助化療，在做臨床決期結(jié)腸癌是否需要輔助化療，在做臨床決策時需要考量的一個重要信息就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定策時需要考量的一個重要信息就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（性（MSIMSI）。）。研究認為研究認為MMR MMR 基因為基因為MSI-HMSI

9、-H（高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定）（高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定）會對順鉑、卡培他濱及會對順鉑、卡培他濱及5-FU 5-FU 產(chǎn)生耐藥性，相反產(chǎn)生耐藥性，相反MSI-LMSI-L、MSS MSS 的患者不會產(chǎn)生耐藥。的患者不會產(chǎn)生耐藥。微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義整理課件整理課件 一項研究長期隨訪了一項研究長期隨訪了/期結(jié)腸癌期結(jié)腸癌患者后發(fā)現(xiàn)，患者后發(fā)現(xiàn)，MSI-LMSI-L或或MSSMSS者通過者通過5-FU5-FU輔助輔助化療確實改善了預(yù)后；然而，化療確實改善了預(yù)后；然而，MSI-HMSI-H者卻者卻不能從術(shù)后不能從術(shù)后5-FU5-FU輔助化療中顯著獲益，與輔助化療中顯著獲益，與單純手術(shù)相比，

10、單純手術(shù)相比，5-5-年生存率反而更低。年生存率反而更低。微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義整理課件整理課件MSI 檢檢 測測 方方 法法1. 免疫組化方法免疫組化方法(IHC) 免疫組化方法僅用于與腫瘤細胞中的免疫組化方法僅用于與腫瘤細胞中的MLH1, MSH2, MSH6和和PMS2蛋白結(jié)蛋白結(jié)合。如果沒有結(jié)合任何的蛋白，就證明發(fā)生了合。如果沒有結(jié)合任何的蛋白，就證明發(fā)生了MSI。2. 直接測序法直接測序法 對對MMR基因各區(qū)域（基因各區(qū)域（MLH1、MSH2、MSH6等）的擴增產(chǎn)物直接測序。等）的擴增產(chǎn)物直接測序。3. 多重熒光多重熒光PCR 采用多重熒光采用多重熒光PCR的方

11、法對的方法對NCI建議的位點進行擴增，以確定建議的位點進行擴增，以確定MSI狀態(tài)。狀態(tài)。整理課件整理課件檢檢 測測 MSI 方方 法法 比比 較較 方法方法靈敏度靈敏度特異特異性性重現(xiàn)重現(xiàn)性性時間時間成本成本操作操作IHC90%低低低低3-5天天5001000復(fù)雜復(fù)雜直接測序直接測序法法80100%高高高高5-7天天10002000 簡便簡便多重熒光多重熒光PCR100%高高高高2-3天天5001000 簡便簡便整理課件整理課件Microread MSI 檢檢 測測 試試 劑劑 盒盒 閱微基因根據(jù)閱微基因根據(jù)NCCNNCCN指南，針對結(jié)直腸癌基因診斷領(lǐng)域研發(fā)了指南，針對結(jié)直腸癌基因診斷領(lǐng)域研發(fā)

12、了MSIMSI檢測檢測的試劑盒。的試劑盒。 微衛(wèi)星不穩(wěn)定（微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instabilitymicrosatellite instability，MSIMSI）檢測試劑盒）檢測試劑盒是一款以多重熒光是一款以多重熒光PCRPCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因突變檢測系統(tǒng)，一次擴增檢技術(shù)為基礎(chǔ)的基因突變檢測系統(tǒng)，一次擴增檢測測6 6個個MSIMSI位點，操作簡便、快速。位點，操作簡便、快速。整理課件整理課件擴擴 增增 檢檢 測測 位位 點點位點位點GenBankNumber重復(fù)序列重復(fù)序列產(chǎn)物范圍產(chǎn)物范圍1標記熒光類型標記熒光類型NR-27AF070674(A)2770-91HE

13、XNR-21XM_033393(A)2192-113FAMBAT-26U41210(A)26160-185FAMBAT-25L04143(A)25105-125HEXNR-24X60152(A)24119-139TMRMONO-27AC007684(A)27155-177TMRPenta CAL138752(AAAAG)3-15190-250FAMPenta DAC000014(AAAAG)2-17151-224HEXAmel-107/113TMR整理課件整理課件MSI 檢檢 測測 送送 樣樣 要要 求求 若客戶提供石蠟切片，則要求厚度若客戶提供石蠟切片，則要求厚度5-20m的石蠟切片（切片的

14、石蠟切片（切片中確保含有中確保含有9mm2以上大小的組織塊）以上大小的組織塊）10片或以上，注明石蠟片或以上，注明石蠟包埋組織的保存年限，組織類型和包埋前處理方式等。包埋組織的保存年限，組織類型和包埋前處理方式等。若客戶提供若客戶提供DNA樣品，則從新鮮組織提取的樣品，則從新鮮組織提取的DNA最佳，最佳，20ng/l以上的以上的DNA 20l即可（需提供即可（需提供DNA濃度）；若為石蠟濃度）；若為石蠟包埋組織提取的包埋組織提取的DNA，除了提供，除了提供DNA的濃度（的濃度（20ng/l以上的以上的DNA至少至少20l）外，還需提供瓊脂糖凝膠電泳圖）外，還需提供瓊脂糖凝膠電泳圖整理課件整理課

15、件MSI 檢檢 測測 試試 劑劑 盒盒 使使 用用 方方 法法 DNA提?。焊鶕?jù)樣本不同，采用二甲苯或提?。焊鶕?jù)樣本不同，采用二甲苯或Chelex 100的方法提取的方法提取DNA； PCR擴增：擴增： 毛細管電泳檢測：按照毛細管電泳檢測：按照（0.5lROX500）樣品數(shù)樣品數(shù)+（8.5l甲酰甲酰胺）胺）樣品數(shù)樣品數(shù)制備好樣品，制備好樣品，RUN 3130 xl遺傳分析儀。遺傳分析儀。組分組分20 l體系體系(l)Master Mix無核酸酶超純水無核酸酶超純水6.02.5PCR Mix8.05MSI引物混合引物混合物物4.0模板模板DNA2.0反應(yīng)總體積反應(yīng)總體積20.0整理課件整理課件操

16、操 作作 流流 程程 示示 意意 圖圖整理課件整理課件數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 分分 析析n 目的峰：目的峰：A. 單核苷酸標記的位點單核苷酸標記的位點NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27的峰型均為類似五指的手掌峰，見圖的峰型均為類似五指的手掌峰，見圖2； 圖圖2 單核苷酸標記位點峰型示意圖單核苷酸標記位點峰型示意圖整理課件整理課件B. 五核苷酸重復(fù)的位點五核苷酸重復(fù)的位點Penta C、Penta D和性別位點和性別位點Amelogenin的峰型均為單峰型，見圖的峰型均為單峰型，見圖3。 圖圖3 五核苷酸標記和性別位點峰型示意圖五核苷酸標記和性別位點峰型示意圖n 非目的峰：非

17、目的峰：pull-up峰、峰、stutter峰、染料峰、加峰、染料峰、加A不完全峰等。不完全峰等。數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 分分 析析整理課件整理課件MSI 判判 定定 結(jié)結(jié) 果果微衛(wèi)星不穩(wěn)定MSI-H型 根據(jù)根據(jù)NCI建議，與正常樣本比較，有建議，與正常樣本比較，有2個發(fā)生改變可稱定為個發(fā)生改變可稱定為MSI-H型，型，只有只有1個出現(xiàn)不穩(wěn)定的為個出現(xiàn)不穩(wěn)定的為MSI-L型，沒有出現(xiàn)突變的情況為型，沒有出現(xiàn)突變的情況為MSS型。型。整理課件整理課件微衛(wèi)星不穩(wěn)定MSI-L型MSI 判判 定定 結(jié)結(jié) 果果整理課件整理課件微衛(wèi)星穩(wěn)定MSS型MSI 判判 定定 結(jié)結(jié) 果果整理課件整理課件MSI 檢檢 測測 試試

18、劑劑 盒盒 優(yōu)優(yōu) 點點 基于基于MSIMSI的的NCI panelNCI panel標準開發(fā)了適合中國人群的標準開發(fā)了適合中國人群的MSIMSI檢測系統(tǒng)；檢測系統(tǒng)； 采用多重熒光采用多重熒光PCRPCR技術(shù)，一次擴增和檢測技術(shù)，一次擴增和檢測6 6個準單態(tài)性單核苷酸個準單態(tài)性單核苷酸微衛(wèi)星基因座，其中微衛(wèi)星基因座，其中5 5個與國外檢測相吻合，另外增加了一個適合個與國外檢測相吻合，另外增加了一個適合中國人群的位點；中國人群的位點； 基于測序儀的基因分型研究領(lǐng)域擁有多年的經(jīng)驗和多項成果，基于測序儀的基因分型研究領(lǐng)域擁有多年的經(jīng)驗和多項成果，已經(jīng)做了超過已經(jīng)做了超過10001000例病例樣本，積累

19、了豐富的經(jīng)驗和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。例病例樣本，積累了豐富的經(jīng)驗和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。整理課件整理課件MSI 檢檢 測測 案案 例例XBH-XXBH-1* 接收委托方兩份樣本，正常組織接收委托方兩份樣本，正常組織XBH-X和腫瘤組織和腫瘤組織XBH-1，要求鑒定腫瘤組織的，要求鑒定腫瘤組織的MSI狀態(tài)，狀態(tài)，正常對照樣本分型正確，腫瘤組織樣品在正常對照樣本分型正確，腫瘤組織樣品在BAT-26、NR-27、BAT-25、NR-24和和MONO-27等等5個位點出現(xiàn)雙峰。該腫瘤組織為個位點出現(xiàn)雙峰。該腫瘤組織為MSI-H型。型。整理課件整理課件13MS6E13MS6C* 接收委托方兩份檢材，分別為腫瘤組織接收委托方兩份檢材，分別為腫瘤組織13MS6C和正常組織和正常組織13MS6E，要求檢測該腫瘤組，要求檢測該腫瘤組織的織的MSI狀態(tài)，狀態(tài)，6個單核苷酸位點均未出現(xiàn)個單核苷酸位點均未出現(xiàn)MSI，鑒定結(jié)果為，鑒定結(jié)果為MSS穩(wěn)定狀態(tài)。穩(wěn)定狀態(tài)。MSI 檢檢 測測 案案 例例整理課件整理課件閱閱