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文檔簡(jiǎn)介
1、HIVHIV在人體內(nèi)的復(fù)制在人體內(nèi)的復(fù)制 1.1.吸附及穿入:吸附及穿入:gp120+CCR5 GP41gp120+CCR5 GP41和膜融合和膜融合核衣殼核衣殼穿入宿主細(xì)胞穿入宿主細(xì)胞 2.2.脫衣殼和逆轉(zhuǎn)錄:脫衣殼和逆轉(zhuǎn)錄:P24+P24+親環(huán)素親環(huán)素出殼出殼RNARNA依賴(lài)的依賴(lài)的DNADNA聚合酶聚合酶逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄cDNAcDNA 3.3.環(huán)化:環(huán)化:cDNA 雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNADNA 4.4.整合:雙股整合:雙股DNADNA整合入宿主細(xì)胞染色體整合入宿主細(xì)胞染色體DNADNA中中前病前病毒毒 5.5.轉(zhuǎn)錄:前病毒轉(zhuǎn)錄:前病毒DNA RNA mRNA DNA RNA mRNA 6.
2、6.翻譯與裝配:翻譯與裝配:GagGag蛋白與病毒的蛋白與病毒的RNARNA結(jié)合裝配成核殼結(jié)合裝配成核殼體。體。 7.7.病毒成熟、出芽:芽生方式釋放病毒成熟、出芽:芽生方式釋放AIDS發(fā)病機(jī)理 HIV侵入人體后主要攻擊的是一種帶CD4抗原的淋巴細(xì)胞(T4淋巴細(xì)胞)。這種細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的基本組成部分,HIV通過(guò)大量、不斷地復(fù)制與釋放,導(dǎo)致T4淋巴細(xì)胞進(jìn)行性下降,感染者免疫功能遭到嚴(yán)重破壞,造成免疫缺陷。臨床表現(xiàn)為各種各樣機(jī)會(huì)性感染與腫瘤。AIDSAIDS發(fā)病機(jī)理發(fā)病機(jī)理 HIVHIV進(jìn)入人體后能選擇性地侵犯有進(jìn)入人體后能選擇性地侵犯有CD4CD4受體受體的淋巴細(xì)胞,當(dāng)病毒顆粒釋放出來(lái)后,繼的淋
3、巴細(xì)胞,當(dāng)病毒顆粒釋放出來(lái)后,繼續(xù)攻擊其他續(xù)攻擊其他CD4TCD4T淋巴細(xì)胞。大量的淋巴細(xì)胞。大量的CD4+TCD4+T淋淋巴細(xì)胞被巴細(xì)胞被HIVHIV攻擊后,首先引起細(xì)胞功能的攻擊后,首先引起細(xì)胞功能的障礙。障礙。 HIVHIV病毒在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖,導(dǎo)致細(xì)胞的溶病毒在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖,導(dǎo)致細(xì)胞的溶解和破裂。解和破裂。AIDSAIDS發(fā)病機(jī)理發(fā)病機(jī)理3. HIV3. HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后,以芽生方式釋出時(shí)可在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后,以芽生方式釋出時(shí)可引起細(xì)胞膜的損傷。由于引起細(xì)胞膜的損傷。由于HIVHIV可抑制細(xì)胞膜磷可抑制細(xì)胞膜磷脂的合成從而影響細(xì)胞膜的功能,導(dǎo)致細(xì)胞脂的合成從而影響細(xì)胞膜的功能,導(dǎo)致細(xì)
4、胞病變。病變。4. HIV4. HIV還可以感染骨髓干細(xì)胞導(dǎo)致還可以感染骨髓干細(xì)胞導(dǎo)致CD4+TCD4+T淋巴淋巴細(xì)胞減少。細(xì)胞減少。AIDSAIDS發(fā)病機(jī)理發(fā)病機(jī)理5. 5. 當(dāng)受當(dāng)受HIVHIV感染的感染的CD4+TCD4+T淋巴細(xì)胞表面存在的淋巴細(xì)胞表面存在的gp120gp120發(fā)生表達(dá)后,它可以與未感染的發(fā)生表達(dá)后,它可以與未感染的CD4+TCD4+T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞CD4CD4分子結(jié)合,形成融合細(xì)胞,從而改變細(xì)胞膜分子結(jié)合,形成融合細(xì)胞,從而改變細(xì)胞膜的通透性,引起細(xì)胞的溶解和破壞。的通透性,引起細(xì)胞的溶解和破壞。6. 6. 游離的游離的gp120gp120也可以與未感染的也可以與未
5、感染的CD4+TCD4+T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞結(jié)合,作為抗體介導(dǎo)依賴(lài)性細(xì)胞毒作用的抗原,結(jié)合,作為抗體介導(dǎo)依賴(lài)性細(xì)胞毒作用的抗原,使使CD4+TCD4+T淋巴細(xì)胞成為靶細(xì)胞,受淋巴細(xì)胞成為靶細(xì)胞,受K K細(xì)胞攻擊而細(xì)胞攻擊而損傷。損傷。 AIDSAIDS發(fā)病機(jī)理發(fā)病機(jī)理 HIV HIV感染后一般首先出現(xiàn)感染后一般首先出現(xiàn)CD4TCD4T淋巴細(xì)胞輕度至淋巴細(xì)胞輕度至中度降低,該細(xì)胞總數(shù)可持續(xù)數(shù)年不變,反應(yīng)中度降低,該細(xì)胞總數(shù)可持續(xù)數(shù)年不變,反應(yīng)病毒為免疫應(yīng)答所抑制。歷經(jīng)一段時(shí)間后,病毒為免疫應(yīng)答所抑制。歷經(jīng)一段時(shí)間后, CD4+TCD4+T細(xì)胞逐漸進(jìn)行性下降,表明病毒逐漸逃細(xì)胞逐漸進(jìn)行性下降,表明病
6、毒逐漸逃脫了免疫應(yīng)答的控制。當(dāng)脫了免疫應(yīng)答的控制。當(dāng)CD4+TCD4+T淋巴細(xì)胞一旦淋巴細(xì)胞一旦下降至下降至200200細(xì)胞細(xì)胞/l/l或更低時(shí),則就可出現(xiàn)機(jī)或更低時(shí),則就可出現(xiàn)機(jī)會(huì)性感染。會(huì)性感染。HIVHIV感染的三種結(jié)局感染的三種結(jié)局 典型進(jìn)展者:典型進(jìn)展者:8-10年內(nèi)免疫功能逐漸下降,最后發(fā)展成為艾滋病。 快速進(jìn)展者:快速進(jìn)展者:CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)在2-5年內(nèi)迅速下降,抗HIV抗體水平很低,HIV感染后有較高的病毒載量。 長(zhǎng)期存活者(長(zhǎng)期不進(jìn)展者)長(zhǎng)期存活者(長(zhǎng)期不進(jìn)展者):感染后維持健康狀態(tài)12年以上,且CD4+計(jì)數(shù)維持正常。 HIVinfectionJ. Coffin, XI In
7、ternational Conf. on AIDS, Vancouver, 1996HIV感染者(更危險(xiǎn))AIDS病人傳染源從 HIV感染發(fā)展到艾滋病 HIV一旦進(jìn)入人體,這個(gè)人就成為HIV感染者。經(jīng)過(guò)急性感染期潛伏期,以后逐漸發(fā)展成艾滋病病人。處于潛伏期的感染者免疫功能沒(méi)有受到嚴(yán)重破壞,因而沒(méi)有明顯的臨床癥狀。從感染者到艾滋病病人這段潛伏期時(shí)間的長(zhǎng)短與感染途徑感染病毒的數(shù)量感染者的年齡、生活條件、心理、生理狀況等多種因素有關(guān),短則幾年,長(zhǎng)則20年。發(fā)達(dá)國(guó)家較長(zhǎng),發(fā)展中國(guó)家短些。資料表明,經(jīng)輸血傳播的潛伏期較短,經(jīng)性接觸傳播的潛伏期較長(zhǎng)。檢測(cè)檢測(cè)CD4CD4、CD8TCD8T淋巴細(xì)胞的意義淋巴
8、細(xì)胞的意義 淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的一群細(xì)胞,在正常機(jī)體內(nèi)各淋巴細(xì)胞亞群相互作用,維持機(jī)體正常免疫功能。當(dāng)不同淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí),可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂并發(fā)生一系列病理變化。因此,T淋巴細(xì)胞亞群的免疫分型能夠提供有關(guān)患者免疫狀態(tài)的重要信息。AIDS是由HIV引起的一組綜合癥,HIV主要侵犯人CD4T淋巴細(xì)胞,導(dǎo)致其數(shù)量上的減少和功能缺陷,使機(jī)體免疫平衡被打破造成免疫功能低下,最終導(dǎo)致各種機(jī)會(huì)感染和腫瘤檢測(cè)檢測(cè)CD4CD4、CD8TCD8T淋巴細(xì)胞的意義淋巴細(xì)胞的意義( (續(xù)續(xù)) ) CD4T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值的檢測(cè)在HIV感染和艾滋病病人治療以及病毒治療療效方面發(fā)揮了重
9、要的作用 1.了解機(jī)體的免役狀態(tài)以確定疾病分期 2.監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)程 3.評(píng)估疾病預(yù)后 4.制定抗病毒治療及機(jī)會(huì)性感染預(yù)防性治療方案 評(píng)估抗病毒藥物療效檢測(cè)檢測(cè)CD4CD4、CD8TCD8T淋巴細(xì)胞的意義淋巴細(xì)胞的意義( (續(xù)續(xù)) ) 因而,對(duì)HIV感染者和AIDS病人定期進(jìn)行CD4、CD8T淋巴細(xì)胞檢測(cè)具有十分重要的意義。 美國(guó)疾病預(yù)防控制中心就是以此為基礎(chǔ)制訂了HIV感染者/AIDS病人的診斷和分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),目前國(guó)內(nèi)外仍被采納應(yīng)用。規(guī)范的AIDS治療 目前我國(guó)目前我國(guó)HIVHIV治療范圍逐漸擴(kuò)大,國(guó)家示范區(qū)治療范圍逐漸擴(kuò)大,國(guó)家示范區(qū)大批的治療已經(jīng)開(kāi)始。我省也于大批的治療已經(jīng)開(kāi)始。我省也于2004
10、2004年啟動(dòng)了年啟動(dòng)了對(duì)對(duì)AIDSAIDS的治療。但是由于檢測(cè)費(fèi)用昂貴,大批的治療。但是由于檢測(cè)費(fèi)用昂貴,大批治療中治療中50%50%以上病人不進(jìn)行規(guī)范檢測(cè)以上病人不進(jìn)行規(guī)范檢測(cè). .一旦出現(xiàn)一旦出現(xiàn)耐藥病人,后果將不堪設(shè)想。所以規(guī)范的實(shí)驗(yàn)?zāi)退幉∪?,后果將不堪設(shè)想。所以規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。室檢測(cè)是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 室室 條條 件件 1.人員 進(jìn)行HIV感染者和病人CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)的人員須具有艾滋病實(shí)驗(yàn)室的上崗資格,并接受過(guò)省級(jí)以上艾滋病實(shí)驗(yàn)室安全及實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)培訓(xùn)。實(shí) 驗(yàn) 室 條 件(續(xù)) 設(shè)施和設(shè)備樣品處理區(qū):生物安全柜、離心機(jī)、冰箱、水浴箱
11、、旋轉(zhuǎn)震蕩器、精確移液器(5ul50u1、20u1200u1、 200u11000u1)。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)區(qū):流式細(xì)胞儀實(shí) 驗(yàn) 室 條 件(續(xù)) 功能分區(qū) 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為樣品處理區(qū)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)區(qū),各區(qū)的功能是: 樣品處理區(qū)應(yīng)達(dá)到生物安全級(jí)實(shí)驗(yàn)室要求,用于樣品處理、流式檢測(cè)樣品制備。流式細(xì)胞儀檢測(cè)區(qū)用于制備好的樣品上機(jī)檢測(cè)。方方 法法 目前用于CD4和CD8T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的檢測(cè)方法分為自動(dòng)檢測(cè)方法和手工操作法。自動(dòng)檢測(cè)方法包括流式細(xì)胞儀(主要有多平臺(tái)三級(jí)程序法和單平臺(tái)一步法)和專(zhuān)門(mén)的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。手工操作法包括幾種手工操縱試驗(yàn),需要顯微鏡或酶聯(lián)免疫試驗(yàn)設(shè)備。方方 法法 檢測(cè)CD4T淋巴細(xì)胞數(shù)的標(biāo)
12、準(zhǔn)方法為流式細(xì)胞儀,可得出CD4,CD8等淋巴細(xì)胞及比值。為確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性,應(yīng)建立內(nèi)部質(zhì)量控制及參加國(guó)家室間評(píng)價(jià)。流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 (FACS Calibur, BD)簡(jiǎn)易流式細(xì)胞儀器(簡(jiǎn)易流式細(xì)胞儀器(FACSCount, BD)FACSCount, BD)免疫指標(biāo)的檢測(cè)免疫指標(biāo)的檢測(cè) CD4/CD3 CD8/CD3 CD3 CD4/CD8全省CD4流氏細(xì)胞儀分布 山西省艾滋病確證中心實(shí)驗(yàn)室 運(yùn)城市艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室 臨汾市艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室 太原市艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室 大同市艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)治市艾滋病初篩中心實(shí)驗(yàn)室CD4CD4細(xì)胞樣本采集細(xì)胞樣本采集運(yùn)送運(yùn)送檢測(cè)要求檢測(cè)要求1.成功的臨床
13、治療效果評(píng)定依賴(lài)于有保障成功的臨床治療效果評(píng)定依賴(lài)于有保障的標(biāo)本采集、保存、檢測(cè),以及數(shù)據(jù)處理的標(biāo)本采集、保存、檢測(cè),以及數(shù)據(jù)處理等等。在研究前期就要有計(jì)劃的設(shè)計(jì)研究等等。在研究前期就要有計(jì)劃的設(shè)計(jì)研究項(xiàng)目,確定所需要的標(biāo)本類(lèi)型。比如:所項(xiàng)目,確定所需要的標(biāo)本類(lèi)型。比如:所有的血液標(biāo)本是否需要抗凝處理、是否需有的血液標(biāo)本是否需要抗凝處理、是否需要無(wú)菌等要無(wú)菌等 標(biāo)標(biāo) 本本 采采 集集 的的 要要 求求標(biāo)本采集的要求標(biāo)本采集的要求( (續(xù)續(xù)) )2.2.采集的標(biāo)本應(yīng)該長(zhǎng)期保存,至少要求保采集的標(biāo)本應(yīng)該長(zhǎng)期保存,至少要求保存至此項(xiàng)目完成。血液標(biāo)本可用于存至此項(xiàng)目完成。血液標(biāo)本可用于CD4TCD4T
14、淋淋巴細(xì)胞巴細(xì)胞 、抗原、抗體檢測(cè),病毒分離,、抗原、抗體檢測(cè),病毒分離,PCRPCR檢測(cè)檢測(cè). .3.3.血液標(biāo)本應(yīng)盡量在血液標(biāo)本應(yīng)盡量在2424小時(shí)內(nèi)處理,尤其小時(shí)內(nèi)處理,尤其是是CD4TCD4T淋巴細(xì)胞檢測(cè)、病毒分離,淋巴細(xì)胞檢測(cè)、病毒分離,PCRPCR檢檢測(cè)測(cè). .標(biāo) 本 的 采 集(續(xù)) 選擇合適的抗凝劑,分別用于血液學(xué)檢測(cè)和流式細(xì)胞儀的免疫表型檢測(cè)。 用于血液學(xué)檢測(cè)的抗凝劑 K3EDTA (1.50.15mg/ml血液)。 枸櫞酸鈉 (3)肝素 在血球分析儀生產(chǎn)商允許的時(shí)間范圍內(nèi)檢測(cè),不超過(guò)30h,不檢測(cè)超出抗凝時(shí)間范圍的樣品。 用于流式細(xì)胞儀的抗凝劑主要是K3EDTA 標(biāo)本的采集
15、標(biāo)本的采集 標(biāo)標(biāo) 本本 的的 采采 集集采集用品采集用品采血管采血管 真空、負(fù)壓真空、負(fù)壓 抗凝(抗凝(EDTAEDTA或枸櫞酸鈉)或枸櫞酸鈉) 無(wú)菌無(wú)菌針頭針頭 蝶形針頭蝶形針頭注意:切勿將采血針頭的套管回套!注意:切勿將采血針頭的套管回套!注意采血后器具的放置、消毒、處理注意采血后器具的放置、消毒、處理 標(biāo)標(biāo) 本本 的的 采采 集集(續(xù)續(xù))標(biāo)本的采集標(biāo)本的采集( (續(xù)續(xù)) ) 采血后應(yīng)立即握住試管兩端,顛倒混勻多次,將血液與抗凝劑混勻,以防止凝固。 準(zhǔn)備適當(dāng)數(shù)量的樣品管 當(dāng)同一樣品的血球檢測(cè)和流式細(xì)胞儀免疫表型檢測(cè)在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行時(shí),用一個(gè)裝有K3EDTA的試管即可。 對(duì)所有樣品編號(hào),并
16、寫(xiě)明日期和時(shí)間。 標(biāo)標(biāo) 本本 的的 運(yùn)運(yùn) 輸輸在標(biāo)本運(yùn)輸過(guò)程中,應(yīng)確保標(biāo)本能夠及時(shí)、在標(biāo)本運(yùn)輸過(guò)程中,應(yīng)確保標(biāo)本能夠及時(shí)、準(zhǔn)確運(yùn)輸?shù)街付ǖ攸c(diǎn)。要求提前與對(duì)方聯(lián)系,準(zhǔn)確運(yùn)輸?shù)街付ǖ攸c(diǎn)。要求提前與對(duì)方聯(lián)系,確定時(shí)間,對(duì)方應(yīng)提前做好相關(guān)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備確定時(shí)間,對(duì)方應(yīng)提前做好相關(guān)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作,盡快進(jìn)行標(biāo)本處理工作,盡快進(jìn)行標(biāo)本處理運(yùn)輸?shù)乃袠?biāo)本都應(yīng)有送檢單給接受樣品運(yùn)輸?shù)乃袠?biāo)本都應(yīng)有送檢單給接受樣品的實(shí)驗(yàn)室。每張送檢單都應(yīng)詳細(xì)填寫(xiě)所要求的實(shí)驗(yàn)室。每張送檢單都應(yīng)詳細(xì)填寫(xiě)所要求的內(nèi)容的內(nèi)容. .樣 品 的 運(yùn) 輸 運(yùn) 送(續(xù)) 盡可能快地將樣品送至免疫表型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。 如需運(yùn)送樣品到其它地點(diǎn)時(shí),應(yīng)將裝樣品
17、的試管放于一個(gè)防漏的容器中,并將此容器放于一個(gè)裝有吸水性物質(zhì)的指罐中,以防止震動(dòng)并可吸收所有試管破裂漏出的血液。蓋緊指罐,用橡皮帶系緊。 應(yīng)選擇特定的方案,并且安排合適的時(shí)間和運(yùn)輸樣品。樣樣 品品 的的 接接 收收 樣品到達(dá)以后立即檢查試管及其所裝的血樣。 不可檢測(cè)溶血或結(jié)冰樣品。 不可檢測(cè)凝血和乳糜的樣品。 如果樣品的采集時(shí)間已超過(guò)48H,不于接收. 標(biāo)標(biāo) 本本 的的 處處 理理一般采集一般采集HIV-1HIV-1感染者全血感染者全血10 - 20ml10 - 20ml 血漿(含有血小板)血漿(含有血小板)淋巴細(xì)胞層淋巴細(xì)胞層紅細(xì)胞層紅細(xì)胞層1 抗抗 凝凝 2 無(wú)無(wú) 菌菌3 室室 溫溫4 2
18、4h 內(nèi)處理內(nèi)處理實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn) CD4, CD8 , CD3 絕對(duì)計(jì)數(shù)絕對(duì)計(jì)數(shù)FACSCount結(jié)果可信度:結(jié)果可信度:絕對(duì)計(jì)數(shù)絕對(duì)計(jì)數(shù)質(zhì)控質(zhì)控內(nèi)置錯(cuò)誤自動(dòng)報(bào)警內(nèi)置錯(cuò)誤自動(dòng)報(bào)警FACSCountFACSCount內(nèi)置微處理器實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)自動(dòng)分析自動(dòng)打印質(zhì)控與病人的檢測(cè)結(jié)果簡(jiǎn)單易用的系統(tǒng)控制面板配套的樣本制備工作臺(tái)樣本制備方法簡(jiǎn)捷,避免細(xì)胞損失FACSCount 試劑與對(duì)照試劑與對(duì)照FACSCount 工作臺(tái)工作臺(tái)FACSCount 完善的系統(tǒng)完善的系統(tǒng)每管加入 50ml 全血加入,混勻,室溫避光孵育1h無(wú)需溶血1每管加入 50ml 固定液,混 勻 , 室 溫 避 光 孵 育30min無(wú)需離心洗滌2FACSCount上機(jī)檢測(cè).無(wú)需血球計(jì)數(shù)儀,直接得到絕對(duì)值結(jié)果33步測(cè)定步測(cè)定CD4, CD8 ,CD3 絕對(duì)計(jì)數(shù)絕對(duì)計(jì)數(shù)預(yù)配試劑預(yù)配試劑FACSCount 完善的系統(tǒng)完善的系統(tǒng)FACSCount 完善的系統(tǒng)完善的系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒組成(50人份/盒) 熒光試劑 2個(gè)組合/人份 CD4PE/CD3PE-CY5 CD8PE/CD3PE-CY5 固定液 效期 28 0C儲(chǔ)存6個(gè)月FACSCount 完善的系統(tǒng)完善的系統(tǒng) 質(zhì)控試劑盒(50人份/盒) 零,低,中,高 4種靶值微球 效期 28 0C儲(chǔ)存1個(gè)月FACSCount3步測(cè)定步測(cè)定CD4, CD
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