六、克隆基因的表達(dá)

1、Genetic Engineering1.1.基因工程概述基因工程概述2.2.基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)與基本技術(shù)基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)與基本技術(shù)3.3.基因工程所需基本條件基因工程所需基本條件4.4.基因工程的操作過程基因工程的操作過程5.5.目的基因的獲取目的基因的獲取6.6.克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá)7.7.轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)6.克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)-酵母菌、昆蟲細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、動(dòng)酵母菌、昆蟲細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞物培養(yǎng)細(xì)胞遺傳信息從遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的

2、傳遞到蛋白質(zhì)的傳遞過程過程中心法中心法則（則（central dogma）。）。 基因表達(dá)：基因表達(dá)：克隆基因的表達(dá)：克隆基因的表達(dá)：外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因外源基因表達(dá)載體表達(dá)載體重組載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中在宿主細(xì)胞中 表達(dá)出蛋白質(zhì)表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白提取蛋白宿主細(xì)胞：宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。A dividing E. coli 第一節(jié)第一節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核或噬菌體啟動(dòng)子原核或噬菌體啟動(dòng)子MCSSD序列序列終止子終止子識(shí)別原核細(xì)胞的識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子啟動(dòng)子，催化

3、所有的，催化所有的RNA合成。合成。數(shù)個(gè)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一數(shù)個(gè)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個(gè)表達(dá)的協(xié)同單位。個(gè)表達(dá)的協(xié)同單位。一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)2. 以操縱子為單位以操縱子為單位1. 只有一種只有一種RNA多聚酶多聚酶有意義鏈有意義鏈5 反意義鏈反意義鏈3 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄mRNA5 3 翻譯翻譯蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)NC5 3 3. 轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行。4. 不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5. 調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。 同核糖體同核糖體16SRNA3末端堿基互補(bǔ)的序

4、列，叫末端堿基互補(bǔ)的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列）序列5 AGGAGG 3。6. mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)Shine-Dalgarno（S-D）sequence:二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)1. 外源基因不能帶有內(nèi)含子。外源基因不能帶有內(nèi)含子。2. 不能直接用真核基因組不能直接用真核基因組DNA,必須用必須用cDNA3. 必須利用原核細(xì)胞的調(diào)控原件（啟動(dòng)子等）必須利用原核細(xì)胞的調(diào)控原件（啟動(dòng)子等）4. 防止外源基因產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒害。防止外源基因產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒害。是是DNA上的能與上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始聚合酶結(jié)合并能

5、起始mRNA合成的序列。具序列特異性、方向性、位置特異合成的序列。具序列特異性、方向性、位置特異性、種屬特異性。性、種屬特異性。 大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensus sequence）。 三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控1. 啟動(dòng)子啟動(dòng)子-35 Box 和和 -10 Box（1） 啟動(dòng)子序列啟動(dòng)子序列 consensus sequencesSextama框5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACA TATAAT 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5 核糖體結(jié)合位點(diǎn)

6、核糖體結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶聚合酶 亞基的識(shí)別位點(diǎn)亞基的識(shí)別位點(diǎn) 。 -35box（2）翻譯的起始位點(diǎn)）翻譯的起始位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上與核糖體上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。結(jié)合的序列。ribosome binding siteSDmRNA 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCAAUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）位于位于SD序列下游。序列下游。起始密碼：起始密碼：SDSD序列距離序列距離AUGAUG的距離，最佳的距離，最佳7bp;7bp;SDSD序列與核糖體序列與核糖體

7、16SrRNA316SrRNA3 堿基的互補(bǔ)性；堿基的互補(bǔ)性；SDSD序列與序列與AUGAUG之間的堿基組成也很重要，之間的堿基組成也很重要， AAAAAAAA、GGGGGGGG時(shí)效率最高時(shí)效率最高SD序列影響翻譯效率：序列影響翻譯效率：全酶是一個(gè)全酶是一個(gè)5 5聚體，含有兩個(gè)聚體，含有兩個(gè)小亞基小亞基，和，和2 2兩個(gè)兩個(gè)大亞基（大亞基（和和），一個(gè)），一個(gè)亞基。亞基。 2. RNA多聚酶多聚酶 大腸桿菌只有一種類型的大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和和mRNA。（1 1）結(jié)構(gòu)）結(jié)構(gòu)3. 轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子內(nèi)終止子內(nèi)終止子 intrinsic termin

8、ator：E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段位置有一段反反向回文順序向回文順序，其后緊接一串，其后緊接一串U，稱為內(nèi)終止，稱為內(nèi)終止子，或本征終止子，形成終止信號。子，或本征終止子，形成終止信號。不需要其他蛋白輔助因子參與不需要其他蛋白輔助因子參與在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游一般設(shè)計(jì)一段轉(zhuǎn)錄在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游一般設(shè)計(jì)一段轉(zhuǎn)錄終止子。終止子。啟動(dòng)子啟動(dòng)子操縱子操縱子S-D序列序列目的基因目的基因終止子終止子由于莖環(huán)由于莖環(huán)3段緊接一串段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。延續(xù)。 原因：

9、原因：反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個(gè)莖反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個(gè)減弱了數(shù)降低，整個(gè)減弱了RNA 與與DNA的互作的互作 莖環(huán)結(jié)構(gòu)莖環(huán)結(jié)構(gòu) 多聚多聚A/UA/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折疊折疊mRNAmRNA折疊折疊

10、U CU CC C U GU GG GC CA AUUC CG GC CG GG GC CC CG GC CG GG GC CA A A A CCCAC UUUUCCCAC UUUU3 3 DNARNA聚合酶聚合酶脫落脫落大腸桿菌偏愛大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上。一般安置上全部的三個(gè)終止全部的三個(gè)終止密碼密碼防止核糖體跳躍（防止核糖體跳躍（skipping）。）。Translation enhancer能夠顯著增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的能夠顯著增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，序列，由多個(gè)元件組成，每一元件可與一種或多種由多個(gè)元件組成，每一元件可與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合。具雙向性、特異性，其轉(zhuǎn)

11、錄調(diào)控因子結(jié)合。具雙向性、特異性，其發(fā)揮功能與所處位置無關(guān)。發(fā)揮功能與所處位置無關(guān)。4. 翻譯終止密碼翻譯終止密碼5. 翻譯增強(qiáng)子翻譯增強(qiáng)子 必須是一種強(qiáng)啟動(dòng)子必須是一種強(qiáng)啟動(dòng)子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的白的10%-30%以上。以上。 應(yīng)呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄應(yīng)呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄便于表達(dá)毒性蛋白等。便于表達(dá)毒性蛋白等。 應(yīng)是可誘導(dǎo)型的應(yīng)是可誘導(dǎo)型的用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。（1）最佳啟動(dòng)子必須具備的條件）最佳啟動(dòng)子必須具備的條件 基因工程常用的原核啟動(dòng)子基因工程常用的原核啟動(dòng)子 來自大腸桿菌的乳來自大腸桿菌的乳糖操縱子。糖操縱子。

12、用乳糖或其類似物用乳糖或其類似物IPTG充當(dāng)誘導(dǎo)物，充當(dāng)誘導(dǎo)物，與阻遏蛋白結(jié)合，與阻遏蛋白結(jié)合，解除抑制。解除抑制。Plac O目的基因目的基因（2） 乳糖啟動(dòng)子乳糖啟動(dòng)子lac四聚體的四聚體的阻遏物阻遏物IPTGIPTG有毒、昂有毒、昂貴，不理想。貴，不理想。IPTG =異丙基硫異丙基硫代代-D半乳糖半乳糖 （3）色氨酸啟動(dòng)子）色氨酸啟動(dòng)子trptrpRP1O trpEtrpDtrpCtrpB trpAtrpR阻遏蛋白基因；阻遏蛋白基因；P1啟動(dòng)子；啟動(dòng)子；O操縱基因；操縱基因； 衰減子衰減子來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。L L 前導(dǎo)區(qū)前導(dǎo)區(qū)色氨酸操縱子色氨酸操縱子

13、trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA鄰氨基苯甲鄰氨基苯甲 酸合成酶酸合成酶吲哚甘油吲哚甘油 硼酸合成酶硼酸合成酶色氨酸色氨酸 合成酶合成酶 鏈鏈 鏈鏈 分支酸分支酸鄰氨基鄰氨基 苯甲酸苯甲酸磷酸核糖基磷酸核糖基 鄰氨基苯甲酸鄰氨基苯甲酸CDRP吲哚甘吲哚甘 油油-磷酸磷酸色氨酸色氨酸阻遏物阻遏物轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄（P1P1是主要啟動(dòng)子，是主要啟動(dòng)子，P2P2的作用只有的作用只有3%3%。）。）沒有色氨酸時(shí)，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，沒有色氨酸時(shí)，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。trpRP1O trpEtrpDP2trpCtr

14、pB trpA阻遏物阻遏物色氨酸色氨酸結(jié)合結(jié)合不轉(zhuǎn)錄不轉(zhuǎn)錄用于表達(dá)載體的用于表達(dá)載體的trp啟動(dòng)子一般只包含啟動(dòng)基因、啟動(dòng)子一般只包含啟動(dòng)基因、操縱基因、和部分操縱基因、和部分trpE基因?；?。P1OtrpE目的基因目的基因有色氨酸時(shí)，阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合后才能與操有色氨酸時(shí)，阻遏蛋白與色氨酸結(jié)合后才能與操縱基因結(jié)合，從而阻止色氨酸合成酶類的轉(zhuǎn)錄縱基因結(jié)合，從而阻止色氨酸合成酶類的轉(zhuǎn)錄（稱為（稱為corepressor）。）。（4）PL和和PR啟動(dòng)子啟動(dòng)子是從是從 噬菌體中得到的一類啟動(dòng)子，比噬菌體中得到的一類啟動(dòng)子，比lac啟動(dòng)子啟動(dòng)子的活性高的活性高8-10倍，比倍，比trp啟動(dòng)子活性高

15、。啟動(dòng)子活性高。 cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcIIN:抗終止蛋白；抗終止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白抗阻遏蛋白(裂解必需的）；裂解必需的）；cI, cII, cIII: 阻遏蛋白；阻遏蛋白； P:啟動(dòng)子；啟動(dòng)子；O:操縱子。操縱子。R:右；右；L:左左cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcII阻遏物阻遏物轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄當(dāng)當(dāng)cI合成后，與合成后，與OL和和OR結(jié)合阻止結(jié)合阻止RNA聚合酶，聚合酶，則左右基因都受到抑制。但促進(jìn)則左右基因都受到抑制。但促進(jìn)PM使使cI進(jìn)一步轉(zhuǎn)進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄。進(jìn)入溶原期。錄。進(jìn)入溶原期。 早期左邊早期左邊早期右邊

16、早期右邊表達(dá)載體常用的噬菌體啟動(dòng)子是表達(dá)載體常用的噬菌體啟動(dòng)子是PL調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因cI 則是選擇了一個(gè)溫度敏感性的突變則是選擇了一個(gè)溫度敏感性的突變基因基因cI857。 整合在宿主基因組里，或克隆到載體上。整合在宿主基因組里，或克隆到載體上。42oC時(shí)阻遏蛋白失活，外源基因大量轉(zhuǎn)錄時(shí)阻遏蛋白失活，外源基因大量轉(zhuǎn)錄PL外源基因外源基因28oC時(shí)阻遏時(shí)阻遏PL，外源基因不轉(zhuǎn)錄。，外源基因不轉(zhuǎn)錄。OL包涵體（包涵體（inclusion body）是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物, 主要由外主要由外源蛋白組成。源蛋白

17、組成。形成原理未知。形成原理未知。1. 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)例：例：使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞。不損害寄主細(xì)胞。有正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)象是有正確的氨基酸序列，但空間構(gòu)象是錯(cuò)誤的，回收的蛋白生物活性差。錯(cuò)誤的，回收的蛋白生物活性差。 缺點(diǎn)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)（1）周質(zhì)（）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于細(xì)胞內(nèi)膜和外膜之間格蘭氏陰性大腸桿菌位于細(xì)胞內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)的復(fù)雜蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)的復(fù)雜機(jī)理目前不完全清楚機(jī)理目前不完全清楚優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 容易被濃縮和純化、

18、有利于正確折疊、容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。被降解的少。2. 周質(zhì)中表達(dá)周質(zhì)中表達(dá)-內(nèi)酰胺酶（內(nèi)酰胺酶（lactamase）、）、 腸毒素（腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等等 （3）常用的原核信號肽）常用的原核信號肽大腸桿菌的信號肽：大腸桿菌的信號肽：能帶領(lǐng)蛋白穿過膜到達(dá)周質(zhì)。但以后需要正確能帶領(lǐng)蛋白穿過膜到達(dá)周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。切割掉。（2）信號肽（）信號肽（signal peptide）一般位于一般位于N N端。端。鼠源鼠源RNase、人生長激素信號肽。、人生長激素信號肽。也能在細(xì)菌中起作用。也能在細(xì)菌中起作用。（4 4）真核信號肽真核信號肽

19、胡蘿卜歐氏桿菌的胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白。蛋白。金黃色葡萄球菌的蛋白金黃色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶 （endoglucanase）。）。由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。太理想。用溶血素（用溶血素（hemolysin）基因構(gòu)建分泌性融合）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白；蛋白；使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白分泌到分泌到細(xì)胞外細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。也需信號肽的培養(yǎng)基中。也需信號肽或與細(xì)菌素釋放蛋白（或與細(xì)菌素釋放蛋白（

20、bacteriocin release protein)共表達(dá)。共表達(dá)。3. 胞外表達(dá)胞外表達(dá)載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列序列 ATG-外源基因外源基因-TAG優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：五、幾種類型的原核表達(dá)載體五、幾種類型的原核表達(dá)載體產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。1. 非融合型表達(dá)載體非融合型表達(dá)載體哈佛大學(xué)的哈佛大學(xué)的Gilbert實(shí)驗(yàn)室建立的，表達(dá)能力強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)室建立的，表達(dá)能力強(qiáng)。pKK

21、223-3 載體載體組成結(jié)構(gòu)：組成結(jié)構(gòu)： 強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子: tac（trp-lac）:trp的的-35區(qū)區(qū)lacUV5的的-10區(qū)區(qū)lac操縱基因操縱基因操縱基因：操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。乳糖操縱子系統(tǒng)。終止子：終止子：調(diào)節(jié)基因：調(diào)節(jié)基因：Lac I宿主菌染色體上宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。的乳糖操縱子系統(tǒng)。 如如JM105菌。菌。rrnB的強(qiáng)終止子的強(qiáng)終止子rrnB強(qiáng)終止子強(qiáng)終止子S-D插入位點(diǎn)區(qū)插入位點(diǎn)區(qū)S-D序列和插入位點(diǎn)區(qū)：序列和插入位點(diǎn)區(qū)：tac PLac O S-D 插入位點(diǎn)區(qū)插入位點(diǎn)區(qū)rrnB T宿主宿主lac I載體的其余部分：載體的其余部分：來自來自pBR322質(zhì)粒。

22、質(zhì)粒。表達(dá)誘導(dǎo)物：表達(dá)誘導(dǎo)物： IPTG（乳糖的類似物，不會(huì)被降解）（乳糖的類似物，不會(huì)被降解）阻遏物阻遏物IPTG必須選擇一個(gè)有必須選擇一個(gè)有l(wèi)acI的宿主菌。的宿主菌。條件：條件：載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號肽載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。如：如：pIN III系列：系列： pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,2. 分泌型表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體細(xì)菌蛋白分泌的條件：細(xì)菌蛋白分泌的條件：位于位于N端，一般為端，一般為15-30aa 。真核與原。真核

23、與原核的結(jié)構(gòu)相似核的結(jié)構(gòu)相似, 功能相似，可以互換。功能相似，可以互換。 堿性氨基酸堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)疏水氨基酸核心區(qū)切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號肽酶信號肽酶外源蛋白外源蛋白 有信號肽。有信號肽。 細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。真核細(xì)胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中真核細(xì)胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達(dá)；很好地分泌表達(dá)； 但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。信號肽酶信號肽酶I、信號肽酶、信號肽酶II等近等近20多種多種蛋白質(zhì)的參與。蛋白質(zhì)的參與。 蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的aaaa 序

24、列。序列。 為蛋白指明目的地。為蛋白指明目的地。Ipplac Plac OS-D/ATGompa插入位點(diǎn)插入位點(diǎn)Ipp（脂蛋白基因啟動(dòng)子）和（脂蛋白基因啟動(dòng)子）和lacUV5啟動(dòng)子。啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)基因：調(diào)節(jié)基因：lac I S-D序列和起始密碼序列和起始密碼ATG。 分泌信號肽：分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因大腸桿菌外膜蛋白基因ompa插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn)）插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn)） 強(qiáng)啟動(dòng)子：強(qiáng)啟動(dòng)子：（1）組成結(jié)構(gòu)）組成結(jié)構(gòu)pIN III系列：系列： pIN III-comA1以以pBR322為基礎(chǔ)為基礎(chǔ)構(gòu)建的。構(gòu)建的。 調(diào)節(jié)基因不必借調(diào)節(jié)基因不必借助于宿主的助于宿主的lacI.表達(dá)出的外

25、源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。菌體蛋白連接在一起的。啟動(dòng)子：啟動(dòng)子：tac 操縱基因：操縱基因：lacO 調(diào)節(jié)基因：調(diào)節(jié)基因：lacI S-D序列序列（1）優(yōu)點(diǎn)）優(yōu)點(diǎn)（2）組成結(jié)構(gòu)）組成結(jié)構(gòu)便于融合蛋白的分離和純化。便于融合蛋白的分離和純化。3. 融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)-pGEX系列系列l(wèi)acItac lac O S-D/ATG GST 插入位點(diǎn)插入位點(diǎn) TGAlacPori：pBR322 ori 融合肽：融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Se

26、pharose親親和層析柱和層析柱分離純化。分離純化。（3）產(chǎn)物提純）產(chǎn)物提純（4）產(chǎn)物分離）產(chǎn)物分離用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從因子可以把外源蛋白從GST上切下來。上切下來。柱（柱（column） GST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶 外源蛋白外源蛋白柱（柱（column） GSTGST洗脫洗脫柱（柱（column）可再利用可再利用pGEX插入?yún)^(qū)：插入?yún)^(qū)：pGEX-1 TCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val T

27、hr AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶 CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶凝血酶ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGACIle Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBamH IXa因子因子pGEX-2X的插入?yún)^(qū)：的插入?yún)^(qū)：pGEX-3X的插入?yún)^(qū)：的插入?yún)^(qū)：

28、Sma ISma I（5）其他融合蛋白系統(tǒng)）其他融合蛋白系統(tǒng)His-tag（組氨酸標(biāo)簽）：（組氨酸標(biāo)簽）： 利用利用pET-28a表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，該表達(dá)載體的多克隆位表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，該表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)后帶有點(diǎn)后帶有6個(gè)組氨酸，因此表達(dá)的蛋白為融合蛋白。組氨酸能個(gè)組氨酸，因此表達(dá)的蛋白為融合蛋白。組氨酸能與多種過渡金屬離子與多種過渡金屬離子Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe3+發(fā)生發(fā)生特殊的相互作用，且與特殊的相互作用，且與Ni2+具高度親和力，利用這個(gè)原理可具高度親和力，利用這個(gè)原理可以把富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)吸附，從而達(dá)到分離的目的。由以把富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)吸附，從而達(dá)

29、到分離的目的。由于這個(gè)原因，偶聯(lián)于這個(gè)原因，偶聯(lián)Ni離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個(gè)組氨酸的蛋白以及對金屬離子有吸附作用的多肽、這些含有多個(gè)組氨酸的蛋白以及對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。而咪唑與蛋白和核苷酸。而咪唑與Ni離子的親和力大于組氨酸，用含咪離子的親和力大于組氨酸，用含咪唑的洗脫液洗脫就可將凝膠上的泛素融合蛋白交換下來，這就唑的洗脫液洗脫就可將凝膠上的泛素融合蛋白交換下來，這就是是Ni-瓊脂糖親和層析柱的作用原理。瓊脂糖親和層析柱的作用原理。 人胰島素人胰島素在大腸桿在大腸桿菌中的表菌中的表達(dá)達(dá)溴化氰溴化氰Cyanogen

30、 bromide：5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）六、影響外源基因表達(dá)效率的因素六、影響外源基因表達(dá)效率的因素1. 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響RNA聚合酶聚合酶 亞基的識(shí)別位點(diǎn)亞基的識(shí)別位點(diǎn)（1）一致順序）一致順序（2）-35區(qū)與區(qū)與-10區(qū)之間的距離區(qū)之間的距離間隔為間隔為17bp時(shí)，啟動(dòng)子最強(qiáng)。時(shí)，啟動(dòng)子最強(qiáng)。（3） -35區(qū)和區(qū)和-10區(qū)的堿基順序區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動(dòng)子越強(qiáng)。越接近一致順序，啟動(dòng)子越強(qiáng)。5-TTGACA TATAAT 一致順序一致順序lactrp PL recAtac

31、 Itac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT -35box-10box5-AGGAGGU-3 S-D序列后面的序列后面的4個(gè)堿基：個(gè)堿基： 如果是如果是A（T）, 翻譯效率最高；翻譯效率最高； 如果是如果是G（C）,效率只有效率只有50%或或25%。2. 轉(zhuǎn)譯起始序列對表達(dá)效率的影響轉(zhuǎn)譯起始序列對表達(dá)效率的影響（1）S-D序列序列？（2）起始密碼）起始密碼AUGAUG左側(cè)的三個(gè)堿基也有影響。左側(cè)的三個(gè)堿基也有影響。 -半乳糖苷酶的半乳

32、糖苷酶的mRNA中：中： AUG左側(cè)如果是左側(cè)如果是UAU或或CUU時(shí)，最為有效；時(shí)，最為有效； 如果是如果是UUC、UCA或或AGG時(shí)下降時(shí)下降20倍。倍。3. 啟動(dòng)子與外源基因之間的距離啟動(dòng)子與外源基因之間的距離轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費(fèi)源量和能量、不會(huì)干擾正常的表達(dá)。不必浪費(fèi)源量和能量、不會(huì)干擾正常的表達(dá)。增加載體的拷貝數(shù)會(huì)增加轉(zhuǎn)錄出的增加載體的拷貝數(shù)會(huì)增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。數(shù)目。增加表達(dá)效率。增加表達(dá)效率。4. 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對表達(dá)效率的影響轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對表達(dá)效率的影響5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響載體拷貝數(shù)及穩(wěn)

33、定性對表達(dá)效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響但過度的外源基因的表達(dá)會(huì)影響宿主的正常生長。但過度的外源基因的表達(dá)會(huì)影響宿主的正常生長。1. 選擇強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如選擇強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如tac 等等七、提高表達(dá)水平常用的方法七、提高表達(dá)水平常用的方法2. 調(diào)整調(diào)整S-D序列與序列與AUG堿的距離堿的距離距離過長或過短都影響真核基因的表達(dá)。距離過長或過短都影響真核基因的表達(dá)。根據(jù)不同的啟動(dòng)子選擇不同的距離。根據(jù)不同的啟動(dòng)子選擇不同的距離。3. 改變起始密碼下面的幾組密碼子改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為一般為5-9bp。能提高翻譯的起始效率。

34、能提高翻譯的起始效率。4. 增加增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性在外源基因的下游插入在外源基因的下游插入“重復(fù)性基因外回文重復(fù)性基因外回文序列序列”能防止能防止mRNA受到受到35外切酶的攻外切酶的攻擊。擊。5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系。關(guān)系。將宿主生長代謝與外源基因表達(dá)分開。將宿主生長代謝與外源基因表達(dá)分開。（1）誘導(dǎo)表達(dá)）誘導(dǎo)表達(dá) 一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。cI857阻遏物有活性，抑制阻遏物有活性，抑制 PL啟動(dòng)子，啟動(dòng)子，外源基因不表達(dá)，宿主大量

35、生長。外源基因不表達(dá)，宿主大量生長。32C:42C:cI857阻遏物失活，阻遏物失活，PL啟動(dòng)子啟動(dòng)，外啟動(dòng)子啟動(dòng)，外源基因高水平表達(dá)，宿主生長受到限源基因高水平表達(dá)，宿主生長受到限制。制。cI857PL外源基因外源基因PO PL啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因lac I（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。生阻遏物。無無IPTG:阻遏物與阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。有有IPTG:阻遏物與阻遏物與IPTG結(jié)合，結(jié)合，lac操縱基因解放，操縱基因解放，外源基因

36、大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。tac啟動(dòng)子是藥物誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是藥物誘導(dǎo)型（2）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制 將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。當(dāng)宿主大量當(dāng)宿主大量生長后生長后，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。增加拷貝數(shù)。當(dāng)需要宿主大量當(dāng)需要宿主大量生長時(shí)生長時(shí)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。制。N末端：由原核基因編碼一段多肽，末端：由原核基因編碼一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。末端：是完整的真核外源基因。（1）設(shè)計(jì)成融合蛋白）設(shè)計(jì)成融合蛋白 這是避免被降解的最好措施。這是避免被降解的最好措施

37、。質(zhì)?；虍a(chǎn)物質(zhì)?；虍a(chǎn)物 目的基因產(chǎn)物目的基因產(chǎn)物NC切割切割6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的蛋白水解酶降解。防止被宿主的蛋白水解酶降解。使用次黃嘌呤核苷（使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。主菌的蛋白酶合成。 大腸桿菌的大腸桿菌的htp R基因突變也減少蛋白酶的降解基因突變也減少蛋白酶的降解作用。作用。 T4噬菌體的噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶?；虍a(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶。可把可把pin增加到載體上。增加到載體上。（2） 使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解 減少宿主菌本身的

38、蛋白酶的表達(dá)。減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。（3）表達(dá)分泌蛋白）表達(dá)分泌蛋白 細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)外膜外膜內(nèi)膜內(nèi)膜周間質(zhì)周間質(zhì)質(zhì)粒質(zhì)粒染色體染色體“外排外排”： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。 “分泌分泌”： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。八、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾八、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵，二硫鍵異構(gòu)酶催分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵，二硫鍵異構(gòu)酶催化，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊?；?，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。1. 形成正確的二硫鍵形成正確的二硫鍵 人胰島素分子人胰島素分子抗體分子抗體分子人血紅蛋白分

39、子人血紅蛋白分子如信號肽、內(nèi)含肽（如信號肽、內(nèi)含肽（intein）等序列的切割。）等序列的切割。2. 前體切割前體切割 （1 1）O-糖基化（糖基化（Ser, Thr）增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì)。增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì)。3. 蛋白質(zhì)糖基化蛋白質(zhì)糖基化 （2）N-糖基化（糖基化（Asn）4. 氨基酸殘基的修飾氨基酸殘基的修飾 磷酸化、乙?；⒘蛩峄?、丙烯酸化、磷酸化、乙?；?、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、軟脂化羰基化、豆冠酸化、軟脂化缺乏蛋白質(zhì)的加缺乏蛋白質(zhì)的加工。工。 （如糖基化、氨（如糖基化、氨基酸修飾等）。基酸修飾等）。九、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷九、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷酵母

40、菌、植物原生質(zhì)體、動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞等。酵母菌、植物原生質(zhì)體、動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞等。第二節(jié)第二節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)真核或病毒啟動(dòng)子真核或病毒啟動(dòng)子 MCS PolyA信號信號 終止子終止子外源基因外源基因 能在能在E.coli中克隆和擴(kuò)增。中克隆和擴(kuò)增。1. 酵母克隆載體酵母克隆載體一、在酵母中表達(dá)一、在酵母中表達(dá)Leu2+ +、His+ +、Ura3+ +、Trp1+ +; 有合適的克隆位點(diǎn)。有合適的克隆位點(diǎn)。 有酵母的選擇標(biāo)記有酵母的選擇標(biāo)記Ori 有有大腸桿菌的選擇標(biāo)記大腸桿菌的選擇標(biāo)記Ampr、Tetr。Dividing Saccharomyces cerevi

41、siae (bakers yeast) cells由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片斷（選擇標(biāo)記）片斷（選擇標(biāo)記）構(gòu)成。構(gòu)成。ColE1 酵母酵母Leu 2+ +如如 PYeleu10:（1）整合型載體）整合型載體(YIp) 轉(zhuǎn)化率低（轉(zhuǎn)化率低（1-10轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/微克微克DNA）。）。特點(diǎn)：特點(diǎn)：載體上只有細(xì)菌的復(fù)制區(qū)，沒有酵母的載體上只有細(xì)菌的復(fù)制區(qū)，沒有酵母的自主復(fù)制區(qū)。自主復(fù)制區(qū)?？膳c受體細(xì)胞的染色體可與受體細(xì)胞的染色體DNA同源重組，隨同源重組，隨染色體一起復(fù)制。染色體一起復(fù)制。不能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制不能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制整合到酵母的染色體上整合到酵母的染色體

42、上不能從酵母細(xì)胞中提取載體。不能從酵母細(xì)胞中提取載體。由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片斷片斷(選擇標(biāo)記和酵選擇標(biāo)記和酵母母DNA自主復(fù)制順序自主復(fù)制順序ARS）構(gòu)成。）構(gòu)成。大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒 酵母酵母ARS （2）復(fù)制型載體）復(fù)制型載體(YRp) 酵母選擇標(biāo)記酵母選擇標(biāo)記 ARS（automously replicating sequence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守區(qū)保守區(qū)特點(diǎn)：特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高（轉(zhuǎn)化率高（102-103轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/微克微克DNA) 。不穩(wěn)定，容易丟失。不穩(wěn)定，容易丟失?？蓮拇竽c桿菌和酵母中提取質(zhì)粒?？蓮拇竽c桿菌和酵母中提

43、取質(zhì)粒。既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制。細(xì)胞中自主復(fù)制。穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector）在在YRp質(zhì)粒中插入酵母染色體的質(zhì)粒中插入酵母染色體的著絲粒區(qū)著絲粒區(qū)。特點(diǎn)：特點(diǎn)：YRp質(zhì)粒質(zhì)粒 酵母著絲粒酵母著絲粒（3）著絲粒質(zhì)粒）著絲粒質(zhì)粒(YCp) 不易從細(xì)胞中提取。不易從細(xì)胞中提取。行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。 單拷貝存在。單拷貝存在。由大腸桿菌質(zhì)粒、由大腸桿菌質(zhì)粒、2 m質(zhì)粒質(zhì)粒及酵母染色體及酵母染色體DNA選選擇標(biāo)記構(gòu)成。擇標(biāo)記構(gòu)成。 大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒酵母選擇標(biāo)記酵母選擇標(biāo)記 2 m質(zhì)粒質(zhì)粒如

44、如pYF92:pBR3222 m酵母酵母his 3+ +（4）附加體型載體）附加體型載體(YEp) 2 m質(zhì)粒：質(zhì)粒：釀酒酵母的內(nèi)源質(zhì)粒，長度是釀酒酵母的內(nèi)源質(zhì)粒，長度是2 m 。含有自主復(fù)制起。含有自主復(fù)制起始區(qū)始區(qū)ori和和STB序列（使質(zhì)粒在供體中維持穩(wěn)定）。序列（使質(zhì)粒在供體中維持穩(wěn)定）。特點(diǎn)：特點(diǎn)：很高的轉(zhuǎn)化活性（很高的轉(zhuǎn)化活性（103-105轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/微克微克DNA）. 拷貝數(shù)多（拷貝數(shù)多（25-100分子分子/細(xì)細(xì)胞）。胞）。 比比YRp穩(wěn)定。穩(wěn)定。YEp24Leu- - 酵母酵母原生質(zhì)體原生質(zhì)體感受態(tài)感受態(tài)酶去壁酶去壁CaCl2、 PEG整合到染色體上，整合到染色體上， 或

45、獨(dú)立在酵母細(xì)胞內(nèi)或獨(dú)立在酵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化Leu營養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型缺陷型 培養(yǎng)基培養(yǎng)基篩選篩選轉(zhuǎn)化子克隆生長轉(zhuǎn)化子克隆生長酵母載體酵母載體大腸桿菌大腸桿菌提取提取插入外源基因插入外源基因鑒定克隆鑒定克隆發(fā)酵表達(dá)發(fā)酵表達(dá)外源基因產(chǎn)物外源基因產(chǎn)物分離、純化分離、純化2. 酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過程酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過程 （1）優(yōu)點(diǎn)）優(yōu)點(diǎn) 對其遺傳學(xué)和生理學(xué)的研究比較深入。對其遺傳學(xué)和生理學(xué)的研究比較深入。 小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應(yīng)器中都能生長。小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應(yīng)器中都能生長。 已經(jīng)分離出很強(qiáng)的啟動(dòng)子。已經(jīng)分離出很強(qiáng)的啟動(dòng)子。 有有翻譯后的加工。翻譯后的加工。 本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的純本身自然分

46、泌很少，便于胞外蛋白的純 化?；?。 安全性高（安全性高（FDA確認(rèn)的安全生物），不確認(rèn)的安全生物），不 需要宿主的安全性檢驗(yàn)。需要宿主的安全性檢驗(yàn)。3. 酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 常常發(fā)生質(zhì)粒丟失。常常發(fā)生質(zhì)粒丟失。 重組蛋白常常超糖基化重組蛋白常常超糖基化表達(dá)量普遍低。表達(dá)量普遍低。（2）缺點(diǎn)）缺點(diǎn)每個(gè)每個(gè)N-寡糖鏈上含有寡糖鏈上含有100多個(gè)甘露糖，多個(gè)甘露糖，分泌困難。分泌困難。正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有8-138-13個(gè)甘露糖。個(gè)甘露糖。分泌型蛋白有時(shí)會(huì)留在分泌型蛋白有時(shí)會(huì)留在壁膜壁膜間隙，間隙，4. 在啤酒酵母中表達(dá)的重組蛋白在啤酒酵母中表達(dá)的重

47、組蛋白（1）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá) 例：人例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表達(dá)：在酵母中表達(dá)：5. 在啤酒酵母中表達(dá)外源蛋白的方式在啤酒酵母中表達(dá)外源蛋白的方式超氧化物超氧化物H+ +H2O2H2O過氧化物酶過氧化物酶表達(dá)出的表達(dá)出的SOD修飾正確：修飾正確：起始氨基酸被切掉，起始氨基酸被切掉， 第二個(gè)氨基酸丙氨酸也被乙?；５诙€(gè)氨基酸丙氨酸也被乙?；?。SOD(SOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶) )宿主：宿主： 亮氨酸合亮氨酸合成缺陷型成缺陷型酵母。酵母。GAPD： 甘油醛磷甘油醛磷酸脫氫酶酸脫氫酶（2）表達(dá)分泌型蛋白）表達(dá)分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被在啤酒酵母中

48、，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被糖基化。糖基化。 需要糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。需要糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。方法：方法：構(gòu)建載體構(gòu)建載體在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交配類型因子配類型因子a1的前導(dǎo)肽，與重組蛋白的的前導(dǎo)肽，與重組蛋白的N端通過端通過Lys-Arg相連。相連。前導(dǎo)肽（前導(dǎo)肽（leader peptide）：）：蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時(shí)，酵母菌的蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時(shí)，酵母菌的內(nèi)切蛋白酶內(nèi)切蛋白酶識(shí)別這個(gè)切點(diǎn)信號，把重識(shí)別這個(gè)切點(diǎn)信號，把重組蛋白正確切下來。組蛋白正確切下來。信號肽的切割：信號肽的切割：前導(dǎo)肽前導(dǎo)肽 Lys-Arg 重組蛋

49、白（水蛭素）重組蛋白（水蛭素）內(nèi)切蛋白酶內(nèi)切蛋白酶6.其它酵母表達(dá)系統(tǒng)其它酵母表達(dá)系統(tǒng)（1 1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表達(dá)乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表達(dá)在大型發(fā)酵反應(yīng)器中容易生長；在大型發(fā)酵反應(yīng)器中容易生長； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇時(shí)，表達(dá)的有甲醇時(shí)，表達(dá)的乙醇氧化酶乙醇氧化酶高達(dá)胞高達(dá)胞內(nèi)總蛋白的內(nèi)總蛋白的40%！嗜甲烷酵母（嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特點(diǎn)）的特點(diǎn)HBsAg: 乙肝表面抗原?？梢宰鳛橐呙?。乙肝表面抗原?？梢宰鳛橐呙?。 Aox1：乙醇氧化酶基因：乙醇氧化酶基因1啟動(dòng)子（受甲醇激活調(diào)控）。啟動(dòng)子（受甲醇

50、激活調(diào)控）。 His4：組氨酸合成所需的組氨酸脫氫酶基因。：組氨酸合成所需的組氨酸脫氫酶基因。 3-aox1：整合到特定染色體的位點(diǎn)序列。：整合到特定染色體的位點(diǎn)序列。表達(dá)載體構(gòu)建（整合型）：表達(dá)載體構(gòu)建（整合型）：誘導(dǎo)物：甲醇。誘導(dǎo)物：甲醇。產(chǎn)量：產(chǎn)量： 9106劑疫苗劑疫苗/240L發(fā)酵發(fā)酵罐。罐。整整合合到到染染色色體體中中（2）牛溶菌酶）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表達(dá)在嗜甲醇酵母中的表達(dá)作為飼料作為飼料添加劑促添加劑促進(jìn)反芻動(dòng)進(jìn)反芻動(dòng)物消化。物消化。產(chǎn)量：產(chǎn)量：10L，200h連續(xù)發(fā)連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)出酵產(chǎn)出50g溶溶菌酶。菌酶。二、昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)二、昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1. 桿狀病毒

51、（桿狀病毒（Baculovirus）廣泛侵染包括許多昆蟲在內(nèi)的無脊椎動(dòng)物。廣泛侵染包括許多昆蟲在內(nèi)的無脊椎動(dòng)物。（1）侵染周期：）侵染周期：兩種形式兩種形式單獨(dú)病毒粒子形式單獨(dú)病毒粒子形式病毒病毒 粒子粒子宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞病毒病毒 粒子粒子侵染侵染釋放釋放病毒病毒 粒子粒子宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞侵染侵染宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞侵染侵染合成合成多角體蛋白多角體蛋白裂解裂解釋放釋放多面體溶解多面體溶解一般使用苜蓿銀紋夜蛾細(xì)胞核型多角體病毒一般使用苜蓿銀紋夜蛾細(xì)胞核型多角體病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）多面體

52、形式多面體形式（2）桿狀病毒的表達(dá)特點(diǎn)）桿狀病毒的表達(dá)特點(diǎn)感染后感染后36-48h，病毒開始合成大量的，病毒開始合成大量的 多角蛋白。多角蛋白。多角蛋白的啟動(dòng)子特別強(qiáng)。多角蛋白的啟動(dòng)子特別強(qiáng)。 多角蛋白基因可以被替換掉而不影響多角蛋白基因可以被替換掉而不影響 病毒的繁殖。病毒的繁殖。多角體基因被外源基因取代后，病毒仍然多角體基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面體。成多面體。3. 轉(zhuǎn)化子篩選轉(zhuǎn)化子篩選通過顯微鏡檢查看是否有多面體形成。通過顯微鏡檢查看是否有多面體形成。源自草地夜蛾的細(xì)胞株，在這種細(xì)胞中，源自草地夜蛾的細(xì)胞株，

53、在這種細(xì)胞中，多角蛋白的多角蛋白的啟動(dòng)子特別活躍啟動(dòng)子特別活躍。2. 最普遍應(yīng)用的宿主細(xì)胞株最普遍應(yīng)用的宿主細(xì)胞株（1 1）轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌質(zhì)粒，插入兩段，插入兩段AcMNPV序列以供同源重組。序列以供同源重組。4. 桿狀病毒轉(zhuǎn)化載體桿狀病毒轉(zhuǎn)化載體桿狀病毒的基因組太大（桿狀病毒的基因組太大（13kb環(huán)狀環(huán)狀DNA），），不能直接插入。不能直接插入。必須使用同源重組的辦法。必須使用同源重組的辦法。多角蛋白的啟動(dòng)子和終止子及多角蛋白的啟動(dòng)子和終止子及polyA加加尾信號。尾信號。啟動(dòng)子與終止子之間插入多克隆位點(diǎn)啟動(dòng)子與終止子之間插入多克隆位點(diǎn)（2）桿狀病毒載體轉(zhuǎn)化

54、過程桿狀病毒載體轉(zhuǎn)化過程 轉(zhuǎn)移載體中插入外源基因轉(zhuǎn)移載體中插入外源基因 轉(zhuǎn)移載體與野生型轉(zhuǎn)移載體與野生型AcMNPV DNA共同轉(zhuǎn)共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞染宿主細(xì)胞 轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組發(fā)生雙交換轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組發(fā)生雙交換 外源基因被交換轉(zhuǎn)入病毒基因組中外源基因被交換轉(zhuǎn)入病毒基因組中 重組病毒侵染宿主重組病毒侵染宿主4-5天后即可收獲重天后即可收獲重組蛋白。組蛋白。4.目前已經(jīng)用桿狀病毒在真核生物細(xì)胞中目前已經(jīng)用桿狀病毒在真核生物細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白表達(dá)的外源蛋白5. 桿狀病毒大規(guī)模表達(dá)存在的問題桿狀病毒大規(guī)模表達(dá)存在的問題桿狀病毒侵染昆蟲幼蟲，在幼蟲體內(nèi)表達(dá)外桿狀病毒侵染昆蟲幼蟲，在幼蟲體內(nèi)表達(dá)

55、外源蛋白，成為源蛋白，成為“低成本蛋白工廠低成本蛋白工廠”。 2222只粉只粉蚊夜蛾幼蟲蚊夜蛾幼蟲4 4天后表達(dá)的人腺苷酸脫氫酶占幼天后表達(dá)的人腺苷酸脫氫酶占幼蟲總蛋白的蟲總蛋白的2%-5%2%-5%。共產(chǎn)出。共產(chǎn)出9mg9mg很純的產(chǎn)物。很純的產(chǎn)物。（1）壽命短）壽命短感染感染4-5天后宿主細(xì)胞裂解或幼蟲死亡。天后宿主細(xì)胞裂解或幼蟲死亡。（2）共同轉(zhuǎn)染率低）共同轉(zhuǎn)染率低重組率更低。重組率更低。0.1%-1%。6. 6. 構(gòu)建可持續(xù)表達(dá)的載體構(gòu)建可持續(xù)表達(dá)的載體利用利用AcMNPV的一個(gè)早期基因的一個(gè)早期基因IE1的啟動(dòng)子。的啟動(dòng)子。 IE1基因的轉(zhuǎn)錄不依賴與病毒的其他基因產(chǎn)物，而且基因的轉(zhuǎn)錄

56、不依賴與病毒的其他基因產(chǎn)物，而且在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)正常。在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)正常。 把外源基因插入到把外源基因插入到IE1啟動(dòng)子和啟動(dòng)子和IE1終止子之間。構(gòu)成整合型載體。終止子之間。構(gòu)成整合型載體。 載載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后隨即整合到宿主染色體上，實(shí)體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后隨即整合到宿主染色體上，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的持續(xù)表達(dá)?，F(xiàn)外源蛋白的持續(xù)表達(dá)。載體載體IE1啟動(dòng)子啟動(dòng)子外源基因外源基因IE1終止子終止子載體載體三、外源基因在植物中表達(dá)三、外源基因在植物中表達(dá)根瘤存在于能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)存在于能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導(dǎo)冠癭瘤形成，又稱腫瘤誘桿菌中，誘導(dǎo)冠癭瘤形成，又稱腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒（導(dǎo)質(zhì)粒（

57、tumor inducing plasmid）。）。1. Ti質(zhì)粒質(zhì)粒:Ti plasmid環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相當(dāng)于細(xì)菌染色體的相當(dāng)于細(xì)菌染色體的3%-5%）。）。（1）Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移DNA，編碼冠癭堿的合成，能隨機(jī)整，編碼冠癭堿的合成，能隨機(jī)整合到植物的染色體上。長度一般為合到植物的染色體上。長度一般為12-24kb，是是Ti質(zhì)粒最重要的部分。質(zhì)粒最重要的部分。左邊界左邊界右邊界右邊界生長素生長素 基因基因細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂 素基因素基因冠癭堿冠癭堿 合成合成T-DNA（transfer-DNA）生長素基因生長素基因:ia

58、aM（tms1）和）和iaaH（tms2）編碼合成）編碼合成吲哚吲哚乙酸乙酸（植物生長激素）的酶（植物生長激素）的酶iaaM: 色氨酸色氨酸-2-單加氧酶單加氧酶色氨酸色氨酸-2-單加氧酶單加氧酶色氨酸色氨酸吲哚吲哚-3-乙酰胺乙酰胺iaaH:吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲哚吲哚-3-乙酰胺乙酰胺吲哚乙酸吲哚乙酸細(xì)胞分裂素基因細(xì)胞分裂素基因tmr（ipt）：異戊烯轉(zhuǎn)移酶）：異戊烯轉(zhuǎn)移酶, 催化：催化：二磷酸異戊烯（二磷酸異戊烯（IPP）異戊烯酰嘌呤單異戊烯酰嘌呤單磷酸（磷酸（IPA）5-AMP章魚堿（章魚堿（octopine)胭脂堿（胭脂堿（no

59、paline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg與丙酮酸縮合成與丙酮酸縮合成Arg與與 酮戊二醛縮合成酮戊二醛縮合成冠癭堿（冠癭堿（opine）的）的類型和類型和化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)結(jié)構(gòu)農(nóng)桿堿（農(nóng)桿堿（agropine）冠癭堿（冠癭堿（opine）的作用）的作用 冠癭堿是在冠癭瘤內(nèi)合成并分泌出來的，冠癭堿是在冠癭瘤內(nèi)合成并分泌出來的，是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他土壤是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠癭堿。微生物都不能利用冠癭堿。Glu的二環(huán)糖衍

60、生物。的二環(huán)糖衍生物。毒性基因（毒性基因（vir）決定土壤農(nóng)桿菌對植物的感染和決定土壤農(nóng)桿菌對植物的感染和T-DNA的的轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移， 進(jìn)入和整合進(jìn)入和整合。vir的產(chǎn)物能誘導(dǎo)的產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生質(zhì)粒產(chǎn)生T-DNA區(qū)域的區(qū)域的單鏈拷貝。單鏈拷貝從單鏈拷貝。單鏈拷貝從Ti質(zhì)粒脫離后，可質(zhì)粒脫離后，可與與vir的產(chǎn)物的產(chǎn)物VIR D2蛋白結(jié)合，并在蛋白結(jié)合，并在VIR D4和和VIR B蛋白的幫助下穿過濃桿菌內(nèi)膜、蛋白的幫助下穿過濃桿菌內(nèi)膜、外膜、壁和植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及核膜，外膜、壁和植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及核膜，最后整合到植物染色體上。最后整合到植物染色體上。單鏈的單鏈的5端是右邊界區(qū)域，含有端