重組狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介導(dǎo)體外表達(dá)的研究

1、重組狗凝血因子的慢病毒介導(dǎo)體外表達(dá)的研究 作者：孫海英，程海，李振宇，杜冰，曾令宇，鹿群先，何徐彭，潘秀英，徐開林【摘要】 本研究的目的是制備攜帶狗凝血因子（cF）基因的慢病毒載體，探討慢病毒載體能否介導(dǎo)cF在體外的有效表達(dá)。用構(gòu)建攜帶cF基因的慢病毒載體pTK161（含PUB啟動子）和pTK162（含2OH1啟動子），同時構(gòu)建含綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒載體pTK161（含PUB啟動子）和pTK162（含2OH1啟動子）的方法，分別與包裝質(zhì)粒NRF、包膜蛋白質(zhì)粒VSVG共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，將包裝好的病毒顆粒再感染293T細(xì)胞，檢測病毒滴度和培養(yǎng)細(xì)胞上清中cF活性。結(jié)果顯示：經(jīng)限制性酶

2、切鑒定，成功構(gòu)建了pTK161、pTK162、pTK161和pTK162正向連接載體；pTK161和pTK162的病毒滴度分別為1.54×106 U/ml和2.83×106 U/ml；pTK161、pTK162感染靶細(xì)胞后24小時細(xì)胞上清中即可檢測到cF的表達(dá)，72小時表達(dá)量達(dá)高峰。pTK162載體cF表達(dá)活性接近正常狗血漿F活性，而且明顯高于pTK161(p<0.05)，6周后cF表達(dá)活性仍達(dá)最高值的1/4。結(jié)論：構(gòu)建的自身失活慢病毒載體可攜帶較大片段的cF基因，并在體外可獲得有效表達(dá)；本研究為慢病毒載體介導(dǎo)的血友病A的基因治療研究提供實驗依據(jù)。 1 / 2

3、0【關(guān)鍵詞】 慢病毒 Expression of Recombinated Canine Factor In Vitro Mediated by Lentiviral Vector Abstract The study was purposed to prepare the recombinant lentiviral vector pTK161 and pTK162 carrying Bdomaindeleted canine factor (BDDcF) gene, and to investigate whether the canine F(c) can be expressed in

4、 vitro. The BDDcF gene was ligated behind PUB and 2OH1 promotors to create lentiviral vectors pTK161 and pTK162. Meantime lentiviral vectors pTK161 and pTK162 were produced by cloning a green fluorescent protein (GFP) into pTK151 and pTK152, which was driven by PUB and 2OH1 promotors respectively. V

5、ector supernatant were prepared by using transfer calcium phosphate mediatedcotransfection of 293T cells. The virus vector, NRF packagingplasmid, and VSVG envelopeplasmid was assayed by titers and cF activity in cell culture supernatant after infection into 293T cells. pTK161, pTK162, pTK161 and pTK

6、162were identified by restriction enzyme analyzing. The results showed that the lentiviral vectors pTK161,pTK162, pTK161 and pTK162 were successfully constructed, and the titers of pTK161and pTK162 reached to 1.54×106 U/ml and 2.83×106 U/ml; the activity of cF could be detected at 24 hours

7、 after infection of 293T cells by pTK161 and pTK162, and achieved the highest level at 72 hours later. The higher level of cF activity was achieved by transfected with pTK162 than that of pTK161 (p<0.05), which closed to the cF activity in normal dog plasma. 1/4 of the highest level could be

8、detected 6 weeks later. It is concluded that the prepared HIV1based lentiviral vectors can infect 293T cells to express cF effectively. The results provide the basis for further studying HIV1based lentiviral vector gene therapy for hemophilia A. Key words lentiviral vector；canine factor ；hemophilia

9、A；gene therapy 血友病A是凝血因子（F）基因缺陷導(dǎo)致凝血因子缺乏的X隱性連鎖的出血性疾病。目前該病的治療方法主要是輸注血漿源性F制品或基因重組F產(chǎn)品，這種蛋白替代療法療效肯定，但存在費用昂貴、血源性病毒感染、反復(fù)輸注會產(chǎn)生抑制性抗體等許多棘手的問題1-3。由于血友病A是一種單基因遺傳病，基因治療可望成為一種有效治療手段4。 本研究分別構(gòu)建了含有 PUB 啟動子和2OH1啟動子cF的慢病毒表達(dá)載體pTK161和pTK162，采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，檢測感染細(xì)胞上清中的cF活性，為血友病A慢病毒載體介導(dǎo)基因治療尋求有價值的實驗依據(jù)。 主要試劑 各種工具酶、1 kb DNA Ladder、

10、質(zhì)粒小量提取試劑盒WizardTM Plus SV Minipreps DNA Purification Systerm、目的基因純化試劑盒WizardTM PCR DNA Purification System、線性化載體純化試劑盒WizardTM DNA CleanUp System均購自Promega 公司，凝血因子F活性檢測試劑盒CoamaticR Factor 購自Chromogenix公司。 質(zhì)粒、菌種、包裝細(xì)胞 慢病毒載體pTK151（含有PUB啟動子）、慢病毒載體pTK152（含有2OH1啟動子）由本室構(gòu)建，pBKCMV（含B區(qū)缺失型FcDNA，BDDFcDNA）由北卡大學(xué)基因

11、治療中心晁恒軍博士惠贈，包裝質(zhì)粒NRF、包膜質(zhì)粒VSVG、感受態(tài)大腸桿菌、包裝細(xì)胞293T等均由本室制備或保存。 載體的構(gòu)建及鑒定 用Xba I和EcoR V雙酶切pBKCMV，得到4 400 bp的BDDFcDNA片段,用低熔點凝膠進(jìn)行電泳，WizardTM PCR DNA Purification System 純化后作為插入片段。用Xba I和Hpa I雙酶切pTK151，與純化后的BDDFcDNA片段進(jìn)行連接反應(yīng)，連接后的載體用BamH酶切鑒定，將正確的載體命名為pTK161。用Afe I單酶切pTK152，CIAP去5P，WizardTM DNA CleanUp System純化后，

12、將插入片段BDDFcDNA插入到pTK152的Afe I酶切位點上，連接后載體用BamH鑒定，將正確的載體命名為pTK162（圖 1）。 Figure 1. Construction map of Lentiviral vector including BDDFcDNA. 重組慢病毒的包裝 采用磷酸鈣共沉淀法5將重組質(zhì)粒pTK161、pTK162（各15 g）分別與包裝質(zhì)粒NRF（10 g）、包膜蛋白質(zhì)粒VSVG（5 g）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)過夜，12小時后更換 無血清培養(yǎng)液，于37、5% CO2條件下 繼續(xù)培養(yǎng)。60小時后收集病毒上清，過濾后-80保存。此外，

13、在pTK151的PUB后插入綠色熒光蛋白（GFP）基因（pTK161）和在pTK152的2OH1后插入GFP后（pTK162），觀察GFP表達(dá)情況。 病毒滴度的測定 將293T細(xì)胞按照2×105/孔接種于6孔板上，吸附6小時后，將所收集的含pTK161和pTK162病毒上清分別按對數(shù)級稀釋，將1 ml稀釋后的病毒上清分別加入到相應(yīng)的孔中，過夜培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)液，48小時后，于熒光顯微鏡下計數(shù)熒光陽性細(xì)胞個數(shù)，用下面的公式計算病毒滴度，并用流式細(xì)胞儀（FACS）檢測GFP陽性細(xì)胞百分率。 病毒滴度（U/ml）=GFP陽性細(xì)胞數(shù)× 相應(yīng)的稀釋倍數(shù)6 狗的凝血因子F活性測定 用p

14、TK161和pTK162感染293T細(xì)胞后在不同時間點收集細(xì)胞上清，按照CoamaticR Factor 試劑盒操作說明，用發(fā)色底物法檢測細(xì)胞上清中cF的活性，以感染前的細(xì)胞上清作為空白對照，并以正常狗的混合血漿作為參比血漿，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（選擇0-1.5 U/ml范圍），將測得的分光光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀數(shù)。 結(jié) 果 重組載體的鑒定 用BamH I酶切鑒定慢病毒載體pTK161，正確連接的載體酶切片段應(yīng)為974、2 574、10 000 bp，第1、3、7泳道的片段與期望值相符，是連接正確的pTK161（圖2A），保存正確克隆。用BamH I酶切鑒定慢病毒載體pTK162，正向連接載體的酶切片段

15、為974、2 539、9 400 bp、反向片段為900、974、10 000 bp。第1、4、5、6、7泳道為正向連接的載體,第2泳道為反向連接（圖2B），保存正向克隆。 轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白表達(dá)情況 采用磷酸鈣共沉淀法將pTK161和pTK162分別與Figure 2. Electrophoretogram of pTK161、pTK162. NRF、VSVG共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，24小時后即可觀察到GFP的表達(dá)，72小時后GFP熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，72小時后慢病毒載體pTK162的綠色熒光蛋白表達(dá)見圖3。將293T細(xì)胞作為靶細(xì)胞，感染后72小時，用FACS分析GFP表達(dá)情況。結(jié)果顯示，pT

16、K162的感染效率較高,達(dá)25%；pTK161的感染效率較低，為15%，兩者比較有顯著性差異(p<0.05)（圖4）。 病毒滴度 將293T細(xì)胞按照2×105/孔接種于6孔板上，培養(yǎng)6小時后加入病毒上清，72小時后測定病毒滴度, pTK161為1.54×106 U/ml，pTK162為2.83×106 U/ml。 細(xì)胞上清中cF活性 將包裝好的病毒顆粒感染293T細(xì)胞，24小時后細(xì)胞上清中即可檢測到cF表達(dá)，72小時表達(dá)量達(dá)高峰。含2OH1啟動子的pTK162表達(dá)量最高為1.46±0.01 U/ml，含PUB啟動子的pTK161表達(dá)量為1.

17、15±0.06 U/ml（圖5），兩者比較有顯著性差異(p<0.05)。含正常狗F血漿的檢測濃度為1.50 U/ml。將感染的293T細(xì)胞傳代培養(yǎng)，每周分離2次，6周后仍可測定到cF活性，約為72小時的1/4。 討 論 基因治療是將正?；蚧蛘哂兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定的方式導(dǎo)入靶細(xì)胞，并使其表達(dá)具有生物活性的物質(zhì)，從而達(dá)到治療疾病的目的。血友病A具有許多有利于基因治療的優(yōu)勢，是實施基因治療的首選病例之一1-3。目前國內(nèi)外血友病A基因治療主要采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體及腺相關(guān)病毒載體，然而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體存在宿主范圍窄、僅能感染分裂細(xì)胞、容納外源性目的基因的DNA片段長

18、度一般不超過8 kb等缺陷，腺病毒載體存在不能整合到染色體上、在體內(nèi)不能穩(wěn)定長期表達(dá)、反復(fù)應(yīng)用容易引起免疫反應(yīng)等不足，腺相關(guān)病毒雖然能夠攜帶較大的基因片段，但是存在著感染效率低等問題7。這些缺陷在一定程度上限制了基因治療的臨床應(yīng)用。來源于人類免疫缺陷病毒1（HIV1）的慢病毒載體由于具有感染效率高，載體容量大，靶細(xì)胞范圍廣等特點，在基因治療中逐漸受到人們的重視8,9，但慢病毒載體的安全性仍是不可忽視的問題。我們在實驗中將慢病毒載體進(jìn)行了改造和優(yōu)化，建立了新一代自身失活的慢病毒載體，采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)6，大大提高了病毒的安全性，減少了產(chǎn)生自我復(fù)制能力的病毒顆粒的機(jī)會。 我們成功構(gòu)建了慢病毒載體p

19、TK161、pTK162，重組載體與包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24小時后即可觀察到熒光蛋白表達(dá)，72小時后GFP熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。Xu等10報道,經(jīng)過超速離心后，病毒滴度可達(dá)到109 U/ml，能夠滿足臨床治療的需要。我們構(gòu)建的pTK161、pTK162均獲得了較高活性的cF表達(dá)，表達(dá)高峰與正常狗血漿cF活性相近，達(dá)到了有效治療濃度，傳代靶細(xì)胞42天后cF活性仍維持在初始濃度的1/4，這為進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。 以病毒載體為基礎(chǔ)的治療方案中，載體的轉(zhuǎn)染效率、病毒感染靶細(xì)胞的能力、目的基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)水平和持續(xù)時間等都是基因治療中值得關(guān)注的問題11。本研究構(gòu)建的攜帶cF的

20、慢病毒載體pTK161、pTK162是由不同的啟動子驅(qū)動目的基因表達(dá)的。檢測結(jié)果顯示，含2OH1啟動子的pTK162表達(dá)量高于含PUB啟動子的pTK161，提示不同啟動子對目的基因的表達(dá)強(qiáng)度有著重要的影響，今后仍要加強(qiáng)對內(nèi)部啟動子的篩選。 綜上所述，我們成功構(gòu)建了攜帶cF的慢病毒載體，經(jīng)過三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝后，感染靶細(xì)胞可獲得cF有效表達(dá)，為慢病毒載體介導(dǎo)血友病A的基因治療提供有價值的實驗依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Ponder KP. Novel therapies for hemophilia A. Blood 2003; 12: 3857-38582Ramia S, Klayme S, Nam

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