HRM應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

1、1會(huì)計(jì)學(xué)HRM應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析nHRM分析過程原始曲線隨著DNA熔解，插入DNA雙鏈中的染料被釋放，熒光信號(hào)驟降導(dǎo)數(shù)圖“速率”曲線的最高峰是分離速率最大的點(diǎn)，即等于熔解溫度對(duì)PCR的擴(kuò)增子進(jìn)行加熱，溫度 從50逐漸上升到95。擴(kuò)增子逐漸解鏈，到達(dá)熔解溫度（Tm）時(shí)，DNA雙鏈完全分開。初期，熒光強(qiáng)度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強(qiáng)度下降。通過檢測(cè)器，記錄熒光變化的過程。對(duì)數(shù)據(jù)作圖，就生成了熔解曲線 。HRM發(fā)明者Carl Wittwer博士nHRM應(yīng)用主要基于兩種技術(shù)的進(jìn)步：雙鏈DNA嵌入型飽和熒光染料如LC Green具有精確控溫裝置和高密度數(shù)據(jù)采集

2、的儀器n嵌入型染料-非飽和染料SYBR Green InSYBR Green I 對(duì)PCR有抑制作用，必需使用低濃度；即使是高濃度，也不能飽和插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝n非飽和態(tài)結(jié)合使染料在熔解過程中發(fā)生重排，染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點(diǎn)，造成熒光信號(hào)沒有變化，特異性下降 n嵌入型染料-飽和染料LC Greenn飽和染料在飽和濃度（熒光最大）下，也不會(huì)抑制PCR；高濃度的染料飽和插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA解鏈過程中就不會(huì)發(fā)生重排，熔解曲線有更高的分辨率n飽和染料主要有LC Green、LC Green Plus、CYTO 9等 n目前市場(chǎng)上HRM分析儀器的供應(yīng)商，有專用

3、于HRM的儀器，還有附帶HRM功能的Real Time PCR儀，包括：Idaho TechnologyQIAGENRocheHRM對(duì)檢測(cè)儀器的要求n擴(kuò)增子的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。只要一個(gè)堿基發(fā)生了突變，就會(huì)改變DNA鏈的解鏈溫度。n解鏈溫度差異極小，零點(diǎn)幾攝氏度，使用高分辨率的儀器才可以檢測(cè)。 孔間溫度差異（溫度均一性：Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020-0.264），孔間溫度均一性要達(dá)到0.264 以內(nèi)才能保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。大多數(shù)Real Time PCR儀的孔間溫度差在0.3-0.5，決定了無法勝任HRM 熔解速率（最低要求：0.1/秒） 數(shù)據(jù)密度（最低要求：10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)/

4、）n可以區(qū)分單堿基差異nHRM基因分型不需要設(shè)計(jì)特異性的TaqMan探針，只是通過溶解曲線的分析來區(qū)分等位基因，從而大大降低了檢測(cè)成本。n使用兩種不同的等位基因特異性正向引物，正向引物3 端的最后一個(gè)堿基對(duì)應(yīng)于SNP位點(diǎn)的二等位基因，反向引物都一樣，并使用熒光染料（SYBR Green I）來檢測(cè)PCR產(chǎn)物。純合子基因組DNA只能被與其完全匹配的正向引物擴(kuò)增，而雜合子基因組DNA能同時(shí)和兩種正向引物結(jié)合擴(kuò)增出兩種PCR產(chǎn)物。HRM應(yīng)用nHRM區(qū)分單堿基差異n同源雙鏈（Homoduplex）n純合子通過Tm值（CT）容易區(qū)分HRM應(yīng)用T ACGT ACGnHRM區(qū)分單堿基差異n同源雙鏈（Homo

5、duplex）n雜合子形成異源雙鏈（heteroduplexes），雜合子的熔解曲線是由4種配對(duì)方式混合而成+T ACG+T GCAHRM應(yīng)用n1. 突變發(fā)現(xiàn)/篩查/掃描n2. SNP 基因分型/等位基因區(qū)分n3. 物種鑒定n4. 表觀遺傳學(xué)/DNA甲基化n5. 微衛(wèi)星分析 HRM應(yīng)用HRM的本質(zhì)二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)熔解曲線異?？赡苡梢韵乱蛩匾穑喝劢馇€異?？赡苡梢韵乱蛩匾穑鹤⒁庾⒁?260 nm 時(shí)1OD等于 50 g/mL的雙鏈DNA純的其260 nm/280 nm 應(yīng)為 2第一步：確定正確的周邊序列第二步：鑒定其它序列特性第三步：拷貝含有目標(biāo)位點(diǎn)的序列，避免那些藍(lán)色位點(diǎn)第四步：將

6、目標(biāo)序列粘貼到擴(kuò)增子設(shè)計(jì)軟件第五步：建立引物設(shè)計(jì)參數(shù)第六步：選擇引物第七步：檢查二級(jí)結(jié)構(gòu)第八步：將引物序列與該物種基因組序列相BLAST，以確定其特異性ComponentConcentrationDiluent (Mol. Biol. Grade water)-PCR Buffer1XMgCl21.5 mMdNTPs0.2 mMForward primer300 nMReverse primer300 nMSYTO91.5 MEvaGreen1-2XTaq DNA polymerase1.25 UDNA Template3 x 109copies/L熱啟動(dòng)TaqPlatinum Taq DNA

7、 polymerase (Invitrogen)Hotstart Taq (Qiagen)10X PCR 緩沖液隨Taq酶50 mM MgCl2隨Taq酶100 mM dNTP溶液Invitrogene, NEB等飽和內(nèi)摻染料SYTO 9 (Invitrogen)EvaGreen (Biotium)LC Green (Idaho Technology)Eco platesEco Adhesive SealsReagentStorage Temp.Storage StateTaq DNA polymerase20oCNot Critical10X PCR Buffer20oCNot Critic

8、al50 mM MgCl21824oCNot Critical100 mM dATP Solution20oCNot Critical內(nèi)摻染料20oCDark標(biāo)準(zhǔn)視圖：差異視圖：謝 謝 ！謝 謝 ！專才服務(wù)專家專才服務(wù)專家專才服務(wù)專家T ACGnHRM區(qū)分單堿基差異n同源雙鏈（Homoduplex）n雜合子形成異源雙鏈（heteroduplexes），雜合子的熔解曲線是由4種配對(duì)方式混合而成+T ACG+T GCAHRM應(yīng)用n1. 突變發(fā)現(xiàn)/篩查/掃描n2. SNP 基因分型/等位基因區(qū)分n3. 物種鑒定n4. 表觀遺傳學(xué)/DNA甲基化n5. 微衛(wèi)星分析 HRM應(yīng)用注意注意:260 nm 時(shí)1OD等于 50 g/mL的雙鏈DNA純的其260 nm/280 nm 應(yīng)為 2第五步：建立引物設(shè)計(jì)參數(shù)ReagentStorage Temp.Storage StateTaq DNA po