納洛酮對(duì)帕金森病IL12P40表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、納洛酮對(duì)帕金森病IL-12P40表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】 目的 利用動(dòng)物模型探討納洛酮對(duì)帕金森病(PD)細(xì)胞因子IL-12P40表達(dá)的影響。方法 30只SD大鼠隨機(jī)分成3組，每組10只。第一組(PD組)立體定向?qū)?羥多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)注入右側(cè)黑質(zhì)制作PD模型，術(shù)后每周用阿樸嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)30min至第4周旋轉(zhuǎn)>6次/min者定為成功的PD模型，第二組(納洛酮)利用立體定向?qū)⒓{洛酮注入大鼠的右側(cè)黑質(zhì)，然后用與第一組相同的方法制作PD模型，第三組注入生理鹽水作為對(duì)照組。取鼠的術(shù)側(cè)中腦黑質(zhì)利用免疫組化(IH)檢測(cè)IL-12P40的表達(dá)。結(jié)果 IH檢

2、測(cè)IL-12P40，與正常對(duì)照組比較，PD組顯著增加(P<0.01);與PD組比較，納洛酮組表達(dá)顯著減少(P<0.01)。結(jié)論 納洛酮對(duì)PD發(fā)病的重要干預(yù)機(jī)制之一可能是通過(guò)影響IL-12P40的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。 【關(guān)鍵詞】 納洛酮;IL-12P40;帕金森病Abstract: Objective To evaluate the effects of Naloxone on cytokine interleukin-12 P40 (IL-12P40) expression in animal models of Parkinson disease (PD). Method

3、s 30 SD rats were randomly divided into 3 groups, 10 in each group. The first group (PD group) of ten rats were prepared to be hemiparkinsonian models induced by unilateral stereotaxic infusion of 6-hydroxydopamine ( 6-OHDA ) in right substantia nigra of mid-brain. Every week after operation, the ci

4、rcles the rats run were observed in 30 minute after intraperitoneal injection apomorphine. If the rats ran more than 6 circles every minute at the fourth week after operation, they were successful PD rat models. The second group (Naloxone group) were given stereotactic injection of naloxone in rat s

5、ubstantia nigra of the right side, and then the PD models were produced by the same way as the first group. The third group injected with normal saline as a control group. From the operative side in rat substantia nigra, an immunohistochemistry (IH) technique was used to detect the expression of IL-

6、12P40. Results IH measurement showed, compared to control group, IL-12P40 in PD group elevated significantly (P<0.01), and compared to PD group, the expression of IL-12P40 in Naloxone group was significantly less (P<0.01). Conclusion Naloxone is effective on reducing incidence of PD, o

7、ne of its important intervention mechanism may be influencing the expression of IL-12P40.2 / 13Key words: naloxone; interleukin-12P40; Parkinson disease帕金森病(PD)是中老年人常見(jiàn)病，其發(fā)病包含了遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用，病理改變主要是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失和小膠質(zhì)細(xì)胞的增生。已有多項(xiàng)研究表明炎癥因素參與了PD的發(fā)病過(guò)程13。白介素-12(interleukin-12，IL-12)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，主要由單核或巨

8、噬細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生?，F(xiàn)在它被認(rèn)為是作為一座功能性橋梁聯(lián)接于早期的非特異性先天性免疫與后期抗原特異性的適應(yīng)性免疫之間，在感染、腫瘤、自體免疫性疾病中起重要作用4。本實(shí)驗(yàn)利用動(dòng)物模型觀察IL-12的亞基之一P40(IL-12P40)在中腦黑質(zhì)中的表達(dá)以及納洛酮對(duì)其的影響，從而探討PD的發(fā)病機(jī)制及其干擾因素。1 材料和方法1.1 PD動(dòng)物模型的制備和分組 選擇30只健康的雄性Sprague Dawley ( SD)大鼠，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重210240g之間，隨機(jī)分成3組，每組10只。PD大鼠模型的制備如下，100g/L水合氯醛(按質(zhì)量34ml/kg)腹腔注射麻

9、醉，參照包新民主編的鼠腦立體定向圖譜5，將大鼠固定在立體定向儀上。剪去頭頂鼠毛，局部消毒，在正中從前向后切開(kāi)大鼠頭頂皮膚，分離顱骨表面的軟組織，暴露右側(cè)頂骨。以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，選用右側(cè)黑質(zhì)定位坐標(biāo)為：前囟后5.0mm，矢狀縫右側(cè)1.5mm，顱骨骨面下8.8mm。第一組(PD組)用微量注射器注入6-羥多巴(6-OHDA)18g即3l，注射速度為1l/min，術(shù)畢留針10min，第二組(納洛酮組)連續(xù)2天注入納洛酮0.2mg，第3天注入6-OHDA 3l;第三組黑質(zhì)內(nèi)注入0.2g/100ml抗壞血酸生理鹽水混合液3l作為正常對(duì)照組。術(shù)后每周用阿樸嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)30min至第4周旋轉(zhuǎn)>6

10、次/min者定為成功的PD模型。取鼠的術(shù)側(cè)中腦黑質(zhì)檢測(cè)IL-12P40的表達(dá)。1.2 檢測(cè)方法1.2.1 IL-12P40表達(dá)的定性檢測(cè) 采用免疫組化(IH)法檢測(cè)IL-12P40表達(dá)。首先石蠟包埋切片， 片厚5 m，抗體購(gòu)自Chemicon公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。按14 000稀釋?zhuān)捎肁BC法染色。每個(gè)標(biāo)本在高倍鏡下觀察，隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)IL-12P40陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。1.2.2 IL-12P40 mRNA表達(dá)的原位雜交(ISH)檢測(cè) 地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針及地高辛檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司， IL-12P40的ISH探針序列為: 5 -GCACAGAGAGAAGAATGAGT

11、T-3 (大鼠);陰性對(duì)照:雜交液中不加地高辛標(biāo)記的探針。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用ABC法染色。每個(gè)標(biāo)本在高倍鏡下觀察， 隨機(jī)取5 個(gè)視野， 計(jì)數(shù)IL-12P40 mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 免疫組化、原位雜交采用德國(guó)KONTRON IBAS 2.0 全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，SPSS12. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析并進(jìn)行兩兩比較。2 結(jié)果2.1 IH法檢測(cè)IL-12P40表達(dá) 與正常對(duì)照組比較， PD組IL-12P40陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量顯著增多(P<0.01)。與PD組比較，納洛酮組術(shù)側(cè)黑質(zhì)IL-12P40陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)表1。

12、2.2 ISH檢測(cè)IL-12P40 mRNA表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，PD組IL-12P40陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量顯著增多;與PD組比較，納洛酮組顯著減少。從mRNA水平說(shuō)明PD時(shí)IL-12P40的表達(dá)增多，納洛酮能夠阻斷IL-12P40的表達(dá)，見(jiàn)表1。表1 三組兩種檢測(cè)方法IL-12P40陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常對(duì)照組比較，a：t=4.91,b：t=7.96，P均<0.01;與PD組比較，c：t=4.53,d：t=7.63，P均<0.013 討論迄今為止，國(guó)內(nèi)外已有多項(xiàng)研究證實(shí)在PD的發(fā)病過(guò)程中有多種細(xì)胞因子的參與，在PD黑質(zhì)、紋狀體區(qū)發(fā)現(xiàn)有腫瘤壞死因子-(TNF-)、白細(xì)胞介素

13、-1(IL-1)和干擾素-(IFN-)等的增加，這些細(xì)胞因子可以對(duì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致其變性壞死1，2。而對(duì)于IL-12P40與PD的關(guān)系研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在研究PD動(dòng)物模型紋狀體部位IL-12P40 的表達(dá)以及納洛酮對(duì)其的影響。1989年，一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室的證據(jù)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染時(shí)或人EB病毒轉(zhuǎn)染的B淋巴母細(xì)胞系可在內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生一種因子，它能誘導(dǎo)IFN-生成，并激活自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)，促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的生長(zhǎng)，現(xiàn)在已被命名為IL-124。IL-12是分子量為70kD(P70)的異源二聚體分子，由分子量分別為40kD(P40)與35kD(P35)的兩條糖基鏈經(jīng)二硫鏈連接組成。微生物、I

14、FN-能促進(jìn)IL-12的生成，IL-10、IL-4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-)、前列腺素(PGE2)能抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12。IL-12誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞NK細(xì)胞生成幾種細(xì)胞因子:IFN-、IFN-、GM-CSF、M-CSF、IL-13、IL-8、IL-2，并通過(guò)這些介質(zhì)發(fā)揮作用，增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性6，7。所以推測(cè)中腦黑質(zhì)IL-12P40的增加有可能損害多巴胺能神經(jīng)元。多項(xiàng)研究表明，PD的發(fā)病中有黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞的大量激活，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如TNF-、IL-1和IFN-，這些細(xì)胞因子可以對(duì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用1,2。納洛酮是一種類(lèi)嗎啡樣多肽受體拮抗劑， LP

15、S誘導(dǎo)的PD模型中，能保護(hù)多巴胺神經(jīng)元8,9。納洛酮作用與對(duì)嗎啡樣受體的拮抗無(wú)關(guān)，因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)嗎啡樣受體拮抗劑陰性的納洛酮和他的對(duì)應(yīng)異構(gòu)物陽(yáng)性的納洛酮均不能結(jié)合嗎啡受體，但均能減緩大鼠黑質(zhì)炎癥介導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元的變性10。本實(shí)驗(yàn)所見(jiàn)6-OHDA誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型經(jīng)納洛酮處理后其PD的相關(guān)癥狀均有明顯改善。與正常對(duì)照組比較，PD組IL-12P40陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，IL-12P40 mRNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量顯著增多;與PD組比較，納洛酮組術(shù)側(cè)黑質(zhì)IL-12P40陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯下降，IL-12P40 mRNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量顯著減少。由此得知PD發(fā)病中有IL-12P40表達(dá)的大量增加，IL-12P4

16、0增加后可能對(duì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生損害，而納洛酮可以有效抑制IL-12P40 的增加，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用。但I(xiàn)L-12P40表達(dá)的增加以及納洛酮對(duì)其產(chǎn)生抑制的機(jī)制并未完全清楚，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)推測(cè)其可能的機(jī)制為：PD模型的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后產(chǎn)生大量IL-12P40，納洛酮可以阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而抑制了IL-12P40 的大量產(chǎn)生，阻斷了其對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的損害，形成神經(jīng)保護(hù)作用。本研究對(duì)臨床應(yīng)用納洛酮治療PD提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為PD的治療提供一種新的思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 劉潔,周東,唐勇,等.MPTP誘導(dǎo)帕金森病小鼠黑質(zhì)致密部細(xì)胞因子含量變化的研究J.四川醫(yī)學(xué),200

17、5,26(5):526-527.2 Hirsch EC, Hunot S, Damier P, et al. Glial cells and inflamemationin Parkinson's disease: a role in neurodegeneration J. Ann Neurol,1998,44(3suppl1):S115-120.3 McGeer Pl, Yasojima K, McGeer EG. Association of interleukin-1 beta polynorphisms with idiopathic Parkinson's dise

18、ase J. Neurosci Lett,2002,326(1):67-69.4 Trinchieri G. Interleukin-12:a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions that bridge innate resistance and antigen-specific adaptive immunity J. Annu Rev Immunol,1995,13:251-276.5 包新民,舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜M.北京:人民衛(wèi)生出版社,1991:49-58.6 John FM, Wu CY, Robert AS, et al. The regulation of IL-12:its role in infectious,autoimmune,and allerg