莪術(shù)油注射液對人卵巢癌SKOV3細胞脹亡及Bcl2表達的影響

1、莪術(shù)油注射液對人卵巢癌SKOV3細胞脹亡及Bcl-2表達的影響作者：楊美春,方剛,李林,覃振林,鐘振國,楊思源,湯紅麗【摘要】 目的 觀察莪術(shù)油注射液對人卵巢癌SKOV3細胞脹亡指數(shù)及Bcl-2表達的影響,探討莪術(shù)油注射液致人卵巢癌SKOV3細胞脹亡的機制。方法 以不同濃度莪術(shù)油注射液作用人卵巢癌SKOV3細胞后,通過熒光顯微鏡觀察細胞核變化、透射電鏡計算細胞脹亡指數(shù)、瓊脂糖凝膠電泳觀察細胞DNA斷裂情況、免疫組化觀察細胞Bcl-2基因的表達。結(jié)果 人卵巢癌SKOV3細胞經(jīng)莪術(shù)油注射液作用48 h后,熒光顯微鏡觀察到脹亡細胞出現(xiàn)細胞腫脹,體積增大,胞膜面積縮小,核染色質(zhì)分散擴大；細胞脹亡指數(shù)隨

2、濃度的增加而增大,呈量效關(guān)系；電泳觀察DNA呈彌漫型；Bcl-2基因表達下調(diào)。結(jié)論 莪術(shù)油注射液可使人卵巢癌SKOV3細胞隨濃度的增加而脹亡指數(shù)增大,并可下調(diào)Bcl-2基因表達,提示下調(diào)Bcl-2基因表達可能是莪術(shù)油注射液致SKOV3細胞脹亡的作用機制之一。 【關(guān)鍵詞】 莪術(shù)油注射液；人卵巢癌SKOV3細胞；脹亡指數(shù)；Bcl-2 Abstract：Objective To discuss the impact of zedoary turmerie oil (ZTO) injection over oncosis index and Bcl-2 expression of human ovar

3、ian cancer SKOV3 cell. Methods After ZTO injection acted on human ovarian cancer SKOV3 cells, the changes in the nucleus were observed by fluorescence microscope, oncosis index was counted by projection electron microscope, the situation of cell DNA breakage was observed by agarose gel electrophores

4、is, and cell Bcl-2 gene expression was observed by immunohistochemical method. Results After treated by ZTO injection for 48 hours, human ovarian cancer SKOV3 cells shows that oncosis cell was swelling in fluorescence microscope, the volume increased, the membrane area narrowed, the nuclear chromati

5、n expansed. The oncosis index increased with dose-effect relationship, DNA electrophoresis showed diffuse type and Bcl-2 gene expression was down-regulated. Conclusion ZTO injection can increase oncosis index of human ovarian cancer SKOV3 cell with the concentration, and lower Bcl-2 gene expression,

6、 which may be one of the mechanisms of ZTO injection caused oncosis of SKOV3 cell.2 / 12 Key words：zedoary tumerie oil injection；human ovarian cancer SKOV3 cell；oncosis index；Bcl-2 我們在前期的實驗研究中發(fā)現(xiàn),莪術(shù)油注射液對人卵巢癌SKOV3細胞有明顯的抑制作用,并且能導致SKOV3細胞出現(xiàn)脹亡現(xiàn)象1-2。本實驗通過觀察細胞核的形態(tài)變化、計算細胞脹亡指數(shù)、細胞DNA斷裂情況、檢測細胞Bcl-2的表達來進一步探討其作用

7、機制。1 實驗材料人卵巢癌SKOV3細胞購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所,廣西腫瘤防治研究所臨床中心實驗室傳代保存。細胞用含有10%滅活小牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液于37 、5%CO2條件下培養(yǎng)。熒光顯微鏡為美國產(chǎn),電泳儀為日本產(chǎn),H-500日立透射電鏡,Bcl-2 SP法免疫組化的試劑盒(福州邁新公司),RPMI-1640和小牛血清為Gibco公司產(chǎn)品,其余均為國產(chǎn)分析純試劑。莪術(shù)油注射液購自黑龍江瑞格制藥有限公司(批號051101,國藥準字：H20023314)。2 實驗方法2.1 熒光顯微鏡觀察 選擇濃度為31.25、62.5、125 g

8、/mL的莪術(shù)油注射液進行實驗1。用6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞,預(yù)先將小蓋玻片放置于培養(yǎng)板底部,調(diào)整細胞密度至1.0×104個/mL,每孔2 mL。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),至對數(shù)生長期,更換培養(yǎng)液,加入藥物。實驗組加入終濃度分別為31.25、62.5、125 g/mL的莪術(shù)油注射液,同時以RPMI-1640培養(yǎng)液作為空白對照組,48 h后取出蓋玻片,PBS洗滌,加入吖啶橙儲存液(10 mg/L)5 L,在氯化鈣介質(zhì)中染色,熒光顯微鏡觀察,攝片。2.2 透射電鏡觀察計數(shù)脹亡細胞指數(shù) 參照文獻3方法并改進。選擇濃度為31.25、62.5、125 g/mL的莪術(shù)油注射液進行實驗,每個濃度制作10個標本

9、。按照上述濃度接種于細胞培養(yǎng)瓶中,作用48 h后,收集細胞,清洗后1%鋨酸固定,0.1%PBS清洗,常規(guī)脫水,浸透,環(huán)氧樹脂包埋,切成超薄切片,透射電子顯微鏡觀察計數(shù)脹亡細胞,并計算細胞脹亡指數(shù)。2.3 瓊脂糖凝膠電泳細胞DNA斷裂情況 經(jīng)31.25、55.16、62.5、125 g/mL濃度的莪術(shù)油注射液作用48 h后,收集細胞,用PBS洗滌數(shù)次,加入0.5 mL細胞裂解液, 10 L蛋白酶K(20 g/L)置37 水浴中過夜,用等體積的飽和酚萃取,10 000 r/min離心,取上層,加入等體積的氯仿-異戊醇(241)除蛋白,10 000 r/min離心10 min,取上清液,加入3倍體積

10、的無水乙醇、1/10體積的的醋酸鈉(3 mol/L),置-20 20 min,取出離心,沉淀用體積分數(shù)為70%乙醇洗滌2次,空氣干燥。加入200 L TE溶解,RNase酶2 L(10 g/L)反應(yīng)30 min(37 )。取上述樣品20 L,在2%瓊脂糖凝膠電泳,75 V,1.5 h,攝像。2.4 免疫細胞化學法檢測Bcl-2基因的表達 參考文獻4方法,取對數(shù)生長期的SKOV3,調(diào)整細胞濃度1.0×104個細胞/mL,接種至內(nèi)鋪玻片的12孔培養(yǎng)板內(nèi),置于37 、5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,加入終濃度為55.16 g/mL (莪術(shù)油注射液作用SKOV3 48 h后其IC5055

11、.16 g/mL2)濃度的藥物,并設(shè)對照組(僅加培養(yǎng)基),每孔液體體積為2 mL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,取出玻片,PBS洗5 min×3次,95%酒精固定20 min,嚴格按試劑盒說明書操作,以PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷：排除爬片中間細胞,10×10低倍鏡下隨機選取10個細胞分布均勻的視野,10×20中倍鏡下隨機計數(shù)50個細胞視野。按著色強弱分為4個等級：無著色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分(抗體陽性部位均在胞漿)。按公式HSCOREPi(i+1)(i0,1,2,3；Pi表示評分為i的比例)計算HSCORE得分5。該評分方法考慮到了單個細胞是否陽性

12、及其強弱,更具體真實地反映細胞的蛋白表達情況。3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學處理,所有數(shù)據(jù)以x±s表示,細胞脹亡指數(shù)行單因素方差分析,Bcl-2的表達比較行t檢驗。4 結(jié)果4.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果 吖啶橙染色后,熒光顯微鏡觀察,空白對照組SKOV3細胞呈均勻熒光染色,而細胞經(jīng)不同濃度莪術(shù)油注射液的作用48 h后,主要變化為細胞腫脹,體積增大,胞膜面積縮小,核染色質(zhì)分散擴大,尤其在125 g/mL濃度可見明顯的腫脹細胞,胞漿染色極不明顯,未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡細胞(即細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密濃染顆粒狀熒光)。4.2 脹亡指數(shù)(見表1)表1 SKOV3細胞脹亡指數(shù)比較(略

13、)注：與空白組比較,*P0.05,*P0.01；與莪術(shù)油注射液中劑量組比較,#P0.01；與莪術(shù)油注射液低劑量組比較,P0.014.3 免疫細胞化學法檢測Bcl-2基因表達結(jié)果 經(jīng)免疫組化染色后的切片,陽性細胞呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色。細胞Bcl-2表達的HSCORE得分見表2。表2 SKOV3細胞Bcl-2表達的HSCORE得分比較(略)注：與空白組比較,*P0.014.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 經(jīng)不同濃度莪術(shù)油注射液處理后, SKOV3細胞DNA條帶均呈彌漫型,瓊脂糖電泳未出現(xiàn)典型的凋亡梯度狀條帶。見圖1。5 討論 細胞脹亡是由多基因調(diào)控的被動死亡的過程,在形態(tài)學及生物學特征上明顯不同于

14、細胞凋亡。目前研究表明,異常細胞脹亡與腫瘤發(fā)生發(fā)展有極密切的關(guān)系,可通過導致細胞脹亡來發(fā)揮抗腫瘤作用6。目前標志細胞脹亡的指標很多,除了透射電鏡觀察以外,瓊脂糖凝膠電泳也可證明脹亡的存在。由于CAD(caspase activated DNase)7的作用,脹亡細胞DNA內(nèi)的核小體為彌漫性隨機碎片,經(jīng)電泳后呈隨機性電泳條帶,區(qū)別于凋亡細胞的階梯狀條帶。在細胞脹亡的調(diào)節(jié)中,Bcl-2發(fā)揮了作用,有研究發(fā)現(xiàn)脹亡細胞中的Bcl-2基因表達常下調(diào)8。 本課題主要研究莪術(shù)油注射液對人卵巢癌SKOV3細胞脹亡指數(shù)、Bal-2基因表達等的影響。按照現(xiàn)行常用的透射電鏡計數(shù)脹亡細胞,多參照Hein S等2提出的

15、要求底數(shù)為1 000個腫瘤細胞,但是本實驗細胞培養(yǎng)所收集的每份腫瘤細胞制作成超薄切片后觀察計數(shù),每張切片一般不超過500個細胞。因此,本實驗每個標本只計算1個脹亡指數(shù)。實驗結(jié)果表明,莪術(shù)油注射液作用SKOV3細胞后,其細胞脹亡指數(shù)隨濃度的增加而增大,呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(P0.01)。熒光顯微鏡觀察到脹亡細胞出現(xiàn)細胞腫脹,體積增大,胞膜面積縮小,核染色質(zhì)分散擴大；電泳觀察DNA呈彌漫型條帶；免疫組化提示,莪術(shù)油注射液導致人卵巢癌SKOV3細胞脹亡與下調(diào)Bcl-2基因表達有關(guān)。 總之,莪術(shù)油注射液致人卵巢癌SKOV3細胞脹亡隨濃度的增加脹亡指數(shù)增大,并且可下調(diào)Bcl-2基因表達,提示下調(diào)Bcl-2

16、基因表達是莪術(shù)油注射液致SKOV3細胞脹亡的作用機制之一。 致謝：對廣西醫(yī)科大學醫(yī)學實驗中心黎丹戎教授、廣西中醫(yī)學院病理教研室王進聲老師等在實驗過程中的指導和大力協(xié)助深表感謝?！緟⒖嘉墨I】 1 楊美春,方 剛,張奕梅,等.莪術(shù)油注射液致人卵巢癌SKOV3細胞脹亡形態(tài)變化的研究J.實用藥物與臨床,2009,12(1)：13.2 楊美春,方 剛,鐘振國,等.莪術(shù)油注射液對人卵巢癌SKOV3細胞體外生長的影響J.時珍國醫(yī)國藥,2009,20(3)：603604.3 Hein S, Amon E, Kostin S, et a1. Progression from compensated hypert

17、rophy to failure in the pressure overloaded human heart：structural deterioration and compensatory mechanismsJ. Circulation, 2003,107(7)：984991.4 陳小芬,湯為學,李龍江.姜黃素對人卵巢癌細胞株SKOV3的抗增殖作用J.重慶醫(yī)科大學學報,2005,30(2)：256259.5 Harrington DJ, Lessey BA, Rai V, et al. Tenascin is differentially expressed in endometrium and endometriosisJ. J Pathol,1999, 187(2)：242248.6 曹獻英,張 珠,張 然,等.磷灰石納米粒子體外致肝癌細胞的脹亡J.中國腫瘤,2003,12(6)：248350.7 Zhao K, Zhao GM, Wu D, et a1. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling,