兒童急性白血病細胞視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白的表達及臨床意義

1、兒童急性白血病細胞視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白的表達及臨床意義 作者：袁向亮，趙惠君，蔣黎敏，徐，袁曉軍，湯靜燕，沈立松【摘要】 本研究檢測視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein, pRb）在不同類型兒童急性白血病細胞中的表達，并探討其表達水平與細胞周期、危險度、微小殘留?。╩inimal residual disease, MRD）監(jiān)測、預(yù)后等臨床診斷治療監(jiān)測指標的關(guān)系。對89例初發(fā)小兒急性白血病患者（包括25例AML, 10例T-ALL, 54例B-ALL）及7例正常對照骨髓標本，采用流式細胞術(shù)（FCM）分別檢測治療前后視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白的表達情況，并對部分病例進行細胞周期

2、分析。 結(jié)果表明： 流式細胞術(shù)檢測pRb的表達準確直觀；在各種類型的急性白血病中pRb的高水平表達具有普遍性，同一患兒白血病細胞pRb的表達明顯高于非白血病細胞，在不同類型的急性白血病中pRb均有缺失表達； pRb的表達水平與白血病細胞的細胞循環(huán)周期可能存在一定的相關(guān)性，pRb表達陽性的B-ALL中處于G1期的白血病細胞數(shù)顯著高于pRb表達陰性的病例(92% vs 77%)； B-ALL中，MRD陽性組pRb的表達量明顯低于陰性組，且差值有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），并且治療前后非白血病細胞的pRb表達水平是穩(wěn)定的； pRb的表達量與B-ALL早期治療預(yù)后之間存在一定相關(guān)性，B-

3、ALL預(yù)后不良組pRb的表達量低于預(yù)后良好組（P<02 / 2305）。結(jié)論： pRb在兒童急性白血病細胞中存在高水平表達或缺失等異常形式的表達差異，pRb的表達與白血病細胞的細胞周期、MRD監(jiān)測、早期治療反應(yīng)的預(yù)后評價等存在相關(guān)性，對于B-ALL的治療監(jiān)測及預(yù)后評估具有指導(dǎo)意義。 【關(guān)鍵詞】 急性白血??； 兒童急性白血病；視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白； MRD監(jiān)測Expression of Retinoblastoma Protein in Child Acute Leukemia Cells and Its Clinical SignificanceAbstractThe resear

4、ch was aimed to detect the expression levels of retinoblastoma protein (pRb) in child acute leukemia cells, and to explore its possible association with leukemia cells cycle, the risk of disease, minimal residual disease (MRD) monitoring and prognosis of B-ALL. Flow cytometry (FCM) was used to detec

5、t the expression of pRb in 89 cases of acute leukemia (including 25 AML, 10 T-ALL and 54 B-ALL) and bone marrows from 7 normal children (control group). Meanwhile the cell cycle in some cases was analyzed . The results showed that (1) the FCM could accurately detect the expression of pRb in acute le

6、ukemia cells; (2) the high level of pRb expression was frequent in all types of child acute leukemias. In the same case, the expression of pRb was significantly increased in leukemia cells when compared with non-leukemia cells. And no detectable pRb protein was found in partial cases of acute leukem

7、ia; (3) there was a close relation between expression of pRb and the cell cycle of leukemia cells, the number of G1 phase cells in pRb positive case of B-ALL was more than that in pRb negative case (92% vs 77%); (4) in B-ALL, the level of pRb expression in MRD positive group was significantly lower

8、than that in MRD negative group (P<0.05), but pRb expression was stable in non-leukemia cells during therapy; (5) pRb expression was related to the early response to therapy in B-ALL, the expression of pRb was significantly increased in sensitive group when compared with insensitive group (P&

9、amp;lt;005). It is concluded that high level or absence of pRb expression can be found in child acute leukemia cells. The expression of pRb is positively related to cell cycle of leukemia cells, MRD monitoring and the early response to therapy. In short, the detection of pRb expression level can gui

10、de the therapy and the evaluation of prognosis in B-ALL.Key worksacute leukemia; child acute leukeima; retinoblastoma protein; MRD monitor視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein, pRb）作為細胞周期的重要調(diào)控因子以及它的基因作為第一個被克隆的抑癌基因在視網(wǎng)膜母細胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌等多種腫瘤中異常表達、缺失或突變等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。以往研究表明，急性白血病細胞中pRb的表達狀態(tài)與白血病細胞對化療的敏感性及患者

11、生存期有關(guān)1，2。因此研究pRb的表達情況對闡明白血病的發(fā)病機制及對于白血病的診斷、治療監(jiān)測具有重要意義。本研究采用流式細胞術(shù)對89例小兒急性白血病患者（包括AML、T-ALL、B-ALL）標本的檢測，研究pRb蛋白在急性白血病的表達情況以及pRb蛋白的表達水平及其與細胞周期、急性B淋巴系白血病危險度分期、微小殘留?。╩inimal residual disease, MRD）監(jiān)測和治療預(yù)后的相關(guān)性。材料和方法病例2003年2月2004年11月，上海兒童醫(yī)學(xué)中心收治的初發(fā)急性白血病患兒89例。在89例中急性B淋巴系白血?。˙-ALL）54例，男32例，女22例，中位年齡5歲；急性T淋巴系白血病

12、（T-ALL）10例，男9例，女1例，中位年齡6歲；急性髓性白血病(AML)25例，男17例，女8例，中位年齡7歲。所有患者都經(jīng)FAB分型法以及流式細胞術(shù)免疫分型法確診，并用PVDL（泊尼松、長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶）方案進行誘導(dǎo)緩解治療。在第1療程結(jié)束而達到臨床緩解后，對部分B-ALL病例進行MRD監(jiān)測。正常對照7例，均為上海兒童醫(yī)學(xué)中心兒?？企w檢正常的兒童，中位年齡6.6歲。主要儀器與試劑流式細胞儀（FACS Calibure Becton Dickinson產(chǎn)品）；Anti-pRb-FITC (Becton Dickinson PharMingen產(chǎn)品)； 鼠IgG1-FITC

13、(Becton Dickinson PharMingen產(chǎn)品)作為同型對照；CD45-PC5；8E透膜劑(美國St.Jude Children's Research Hospital, Dr Dario Campana 贈送)；胎牛血清（Gibco產(chǎn)品）；牛血清白蛋白（Sigma產(chǎn)品）； Ficoll淋巴細胞分離液。標本收集及處理取白血病患者和正常兒童0.5 ml骨髓液，用Ficoll 分離液分離單個核細胞，用PBSA (含0.2 % 牛血清白蛋白及0.2 % 疊氮鈉的PBS)洗2遍后懸浮。調(diào)節(jié)每管細胞數(shù)為（2-3） ×106, 先用表面抗原標志CD45-PC5標記，孵育10

14、分鐘。用PBSA洗2 遍，加入8E透膜劑避光40分鐘。離心5分鐘去上清，加入Wash 緩沖液(含5 % 胎牛血清，1.5 % 牛血清白蛋白，0.0055% EDTA 和0.2% 疊氮鈉的PBS) 10分鐘。離心去上清，用Wash 緩沖液再洗1遍。加入Anti-pRb-FITC和鼠IgG1-FITC抗體進行胞漿染色10分鐘，用Wash 緩沖液洗2 遍，多聚甲醛懸浮待用。作細胞周期分析時，作PI DNA染色處理，先將細胞用30%乙醇固定，37孵育20分鐘，PI染液染色，室溫封閉至上機分析。流式細胞術(shù)檢測分析用FACS Calibur流式細胞儀檢測，測定前先用標準熒光微球校準儀器。用CellQues

15、t軟件(version 3. 2)獲取分析10 000個細胞。不同的抗體組合及不同的患者標本都用同一設(shè)定條件檢測。應(yīng)用CD45/SSC設(shè)門法將不同型的白血病細胞與正常細胞分離開來。pRb表達水平以除去陰性對照的百分比例表示。每一標本均進行免疫分型檢測，并對B-ALL病例進行MRD篩選。MRD監(jiān)測患者誘導(dǎo)治療結(jié)束后的骨髓標本，經(jīng)Ficoll分離液分離單個核細胞后, 用篩選時確認為有效的抗體組合進行4色熒光標記檢測。應(yīng)用Shen等建立的B-ALL MRD監(jiān)測方法檢測3。早期預(yù)后反應(yīng)判定根據(jù)上海兒童醫(yī)學(xué)中心ALL-XH-99及NHL-99方案按序化療： ALL患兒以治療第7天強的松試驗作為腫瘤細胞對

16、激素治療的敏感性評估指標。強的松治療第7天外周血白血病細胞下降至1 000/l為強的松反應(yīng)良好（pGR）組，1 000/l 為強的松反應(yīng)不良（pPR）組； ALL患兒以第19天骨髓像及MRD檢測作為腫瘤細胞對早期聯(lián)合化療的敏感性評估指標。第19天骨髓中鏡下原始淋巴細胞小于5%，MRD陰性定為早期聯(lián)合化療反應(yīng)良好組，大于5%，MRD陽性則為早期聯(lián)合化療反應(yīng)不良組； 以治療第35±10天達緩解及部分緩解作為早期聯(lián)合化療反應(yīng)良好組，反之為早期聯(lián)合化療反應(yīng)不良組。以上標準只要符合其中一項，或不符合但治療過程中死亡、發(fā)生急性粒細胞白血病變等情況即被列為預(yù)后不好，反之為預(yù)后良好。統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用S

17、PSS 11.5和Sigma Plot 9.0統(tǒng)計軟件，對pRb值作相關(guān)分析。對各組數(shù)據(jù)首先進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±SD表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)M及其5%-95%分布范圍表示，組間數(shù)據(jù)分析采用秩和檢驗。率的比較采用2檢驗。相關(guān)性采用線性相關(guān)分析。P值<0.05作為統(tǒng)計學(xué)有顯著性意義標準。結(jié)果pRb在兒童急性白血病中的表達流式細胞術(shù)檢測白血病細胞中pRb的表達由于白血病患兒骨髓標本中的白血病細胞CD45表達較正常細胞偏低，應(yīng)用CD45/SSC設(shè)門法可以將患者骨髓中白血病細胞與正常細胞分離開來。在直方圖中以除去陰性對照的Anti-pRb-FITC熒光表達區(qū)域設(shè)門

18、M1，計算pRb的表達百分數(shù)，以此來評估患兒腫瘤細胞的pRb表達水平。對每一例標本同時設(shè)門檢測白血病細胞與非白血病細胞的pRb表達情況，結(jié)果見圖1。pRb在兒童急性白血病中的表達兒童急性白血病患兒骨髓腫瘤細胞的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白的表達值呈非正態(tài)分布，其具體表達量見附表。各類白血病中腫瘤細胞pRb的表達量明顯高于正常水平，與正常對照相比均存在顯著性差異（AML P=0.019, T-ALL P=0.002, B-ALL P=0001）。并且在同一類急性白血病中白血病細胞pRb 的表達量顯著高于非白血病細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。急性白血病組間pRb的表達量也不盡相同，

19、差異有顯著性意義（P=0.015）。組間兩兩比較，B-ALL中pRb的表達量高于AML，但差異無顯著性意義（P>0.05）, T-ALL中pRb的表達量高于B-ALL，也高于AML且差異均有顯著性意義（P<0.05）。將B-ALL和T-ALL同歸類為一類急性淋巴系白血病，比較ALL與AML中間表達量的差異，ALL 22.33 (0.63-74.30) 顯著高于AML 12.51(0.25-64.43)（P=0.018）。同時，我們檢測到在部分白血病細胞中pRb有缺失表達，缺失表達率分別為： AML 7/25(28%), T-ALL 1/10(10%), B-ALL

20、6/54(11%), AML的缺失率明顯高于其他型白血病。缺失率的比較用卡方檢驗，組間比較及兩兩比較均未發(fā)現(xiàn)差異的顯著性（P=0.136）(P>0.05)。pRb的表達水平與白血病細胞周期有關(guān)視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（pRb）是細胞周期的抑制子，為驗證pRb的表達是否能夠?qū)⒛[瘤細胞限制在G1期，我們應(yīng)用流式細胞儀的PI DNA染色法進行了6例不同類型白血病細胞的細胞周期分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有檢測的6例標本中非白血病細胞的細胞周期分析是一致的，但在腫瘤細胞中pRb表達陽性的T-ALL和AML中處于G1期的白血病細胞數(shù)高于pRb表達陰性的病例，但差異不明顯，而pRb表達陽性的B-ALL處于G

21、1期的白血病細胞數(shù)卻顯著高于pRb表達陰性的病例（92% vs 77%）（圖2）。這種差異性可能具有重要基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用意義，值得我們今后分析更多病例，更深入的探討。Table . Expression of pRb in child acute leukemia（略）pRb與微小殘留病監(jiān)測的相關(guān)性對初發(fā)患兒標本做pRb表達檢測的同時，根據(jù)我們以前建立的急性B系淋巴細胞白血病MRD監(jiān)測的方法，我們對其中的37例標本作了19天及早期緩解后的MRD檢測，比較初發(fā)病人的pRb表達水平與MRD的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在B-ALL中MRD陰性組為21例，pRb表達中間值為 22.90 (0.75-92.91)；M

22、RD陽性組為16例，pRb為 9.50 (0.40-44.00) 。MRD陽性組中pRb的表達量明顯低于陰性組，且差值有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.047）。為驗證白血病的治療過程中pRb表達水平的檢測是否具有重復(fù)性，我們又對大部分作19天MRD檢測的骨髓標本檢測其治療后的pRb表達水平，檢測發(fā)現(xiàn)在同一患者標本中初發(fā)和MRD檢測時非白血病細胞中pRb表達水平是穩(wěn)定（圖3）。如圖示該病例患兒初發(fā)時骨髓中非白血病細胞的pRb表達量為8.03%，做19天MRD檢測時骨髓中非白血病細胞的pRb表達量為8.04%。pRb與危險度的相關(guān)性分析我們研究pRb與危險度的關(guān)系擬分析pRb的表達量是否與白血病的危險度有關(guān)

23、聯(lián)，從而決定是否對于治療起作用。對46例檢測過pRb表達且接受治療的患兒進行的危險度評價表明：低危組（LR）, 中危組（MR），高危組（HR） pRb的表達量中間值依次為16.46 (0.61-63.52 )， 22.90 (2.04-74.35)， 29.87 (0.44-92.82)。雖然低危組低于中危組、高危組，但統(tǒng)計學(xué)三者比較 (P=0.372) 或組間兩兩比較 (P低中=0.188; P低高=0.770; P中高=0.354) 均未發(fā)現(xiàn)差異的顯著性。pRb與早期治療預(yù)后的相關(guān)性研究在檢測pRb表達的41例病人中，我們對其進行了治療效果的綜合評價，判定標準如前。其中預(yù)后良好組為24例，

24、pRb 29.75（2.06-72.33）；預(yù)后不好組17例，pRb 18.62 (0.40-41.04)。 預(yù)后不好組pRb的表達量低于預(yù)后良好組，兩者比較有顯著性差異（P=0.037）。對其進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，pRb的表達量與治療預(yù)后之間存在一定相關(guān)性（r =-0.335, P=0.032）。討論視網(wǎng)膜母細胞瘤基因 (Rb) 是第一個被克隆成功的腫瘤抑制基因, 其編碼的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（pRb），既可通過與E2F、Elf-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合成復(fù)合物阻止轉(zhuǎn)錄因子活化從而控制著細胞的生長和分化, 又可通過調(diào)控與細胞增殖有關(guān)的原癌基因的功能如c-myc、c-fos等抑制細胞增殖促進細胞分化。Rb

25、基因的異常造成pRb缺失表達或表達異常，細胞失去自身生長負調(diào)節(jié)能力，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生4。自Rb作為抑癌基因克隆成功后，關(guān)于其在血液系統(tǒng)腫瘤的異常表達研究表明，Rb的異常表達與白血病的發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。Sauerbrey等5研究發(fā)現(xiàn)在急性白血病中Rb失活的頻率占30%-64%, Rb基因結(jié)構(gòu)異常達18%。在急性髓性白血病中, Rb蛋白缺失占19%-55%。Rb基因的缺失在腫瘤中是一普遍現(xiàn)象，Rb基因缺失的結(jié)果是導(dǎo)致pRb蛋白水平的低表達或不表達。在各類急性白血病中我們均檢測到有pRb蛋白水平的缺失表達，缺失表達率分別為： AML 28%（7/25）, T-ALL 10%（1/10）, B-ALL 1

26、1%（6/54）。AML的缺失率高于其他型白血病，這與國外報道結(jié)果基本一致2。AML與B-ALL，T-ALL缺失率的差異無顯著性，說明pRb在各類白血病中的缺失表達具有普遍性。在我們研究的89例新發(fā)各類急性白血病中，pRb的平均表達量明顯高于正常水平，ALL的表達水平高于AML且有顯著性差異。同時發(fā)現(xiàn)在多例病人中pRb的表達中間值18.37（0.55-70.37）大大高于正常水平。因為以前的研究表明，pRb的表達與其磷酸化狀態(tài)以及處于腫瘤特異性的S期腫瘤細胞比例呈正相關(guān)6，所以我們發(fā)現(xiàn)的各類白血病中高水平表達的pRb可能以磷酸化形式存在。雖然高度表達，但pRb失去活性，釋放與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E

27、2F或暴露其結(jié)合位點，促進細胞周期越過G1/S限制點，所以pRb這種形式的高水平表達也可提示腫瘤細胞增殖活躍。在白血病的發(fā)生中，可能存在細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴激酶等pRb上游調(diào)控因子的異常表達，使pRb高異常表達，高磷酸化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，pRb影響腫瘤細胞的增殖不僅僅是通過作為細胞周期的調(diào)控子發(fā)揮重要作用，還可能通過其他作用機制如抑制細胞凋亡等發(fā)揮作用7。所以白血病腫瘤細胞中pRb不僅缺失表達可參與腫瘤的發(fā)生，pRb的高水平表達可能通過不同的機制如高磷酸化狀態(tài)，抑制細胞凋亡等導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?？梢妏Rb的缺失表達及高水平異常表達均可能參與急性白血病的發(fā)生發(fā)展。從我們6例pRb不同表達水

28、平的各種急性白血病細胞周期分析中得出，pRb不同表達水平的T-ALL、AML中處于G1期的白血病細胞數(shù)差異不大，而B-ALL中pRb表達陽性病例G1期的白血病細胞數(shù)卻高于pRb表達陰性的病例，這表明pRb在不同類型白血病的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著不同的作用，這還有待于我們進一步探討。我們利用此方法檢測得出，在B-ALL疾病診斷時的不同的危險度組中pRb的表達無顯著性差異，不能作為判別危險度的一項指標。目前MRD對于急性白血病特別是B-ALL的治療監(jiān)測起著重要作用，分析MRD陽性組和陰性組pRb的表達發(fā)現(xiàn)MRD陽性組中pRb的表達量顯著低于陰性組。并且我們檢測的幾例緩解后作MRD時的骨髓細胞發(fā)現(xiàn)

29、，初發(fā)時pRb高表達而治療后表達明顯降低或不再表達，而非白血病細胞pRb的表達量是穩(wěn)定的。這一現(xiàn)象的具體應(yīng)用還需進一步臨床標本的實驗驗證，但至少這可提示pRb的表達可以作為一項MRD的檢測指標應(yīng)用于臨床的可能性。對一些臨床上常用的化療藥物作用機制研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)揮作用的實質(zhì)是通過調(diào)控pRb網(wǎng)絡(luò)各組分，使無限增殖的腫瘤細胞細胞周期停止進行或誘導(dǎo)其凋亡8。所以pRb的異常表達可影響化療藥物的作用。以往學(xué)者報道，pRb的表達與非霍奇金淋巴瘤、急性粒系白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的預(yù)后的關(guān)系結(jié)果不一，并缺少系統(tǒng)的研究pRb表達量與急性B系淋巴細胞白血病預(yù)后關(guān)系的資料。我們的結(jié)果表明，在B-ALL早期治療反應(yīng)

30、預(yù)后不好組pRb的表達量低于預(yù)后良好組，兩者比較有顯著性差異。在檢測的4例pRb陰性表達的B-ALL患者中有3例預(yù)后差（占75%），而正常的預(yù)后差的比例占41.5%，說明pRb低表達的患者預(yù)后相對較差，所以初診時檢測pRb的表達水平對于判斷療效和預(yù)后有一定的意義。綜上所述，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測兒童急性白血病中pRb的表達研究結(jié)果表明，pRb在白血細胞中存在缺失或高度表達等異常形式的表達，可能通過不同的機制在白血病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，在不同類型的急性白血病細胞中pRb的表達也存在一定差異。而且pRb的表達與MRD檢測、早期治療反應(yīng)的預(yù)后存在相關(guān)性，這對于B-ALL的治療監(jiān)測及預(yù)后評估具有指導(dǎo)意義

31、?！緟⒖嘉墨I】 1 Jamal R, Gale RE, Shaun N, et al. The retinoblastoma gene (rb1) in acute myeloid leukaemia analysis of gene rearrangements, protein expression and comparison of disease outcome. Br J Haematol, 1996; 94:342-3512 Korkolopoulou PA, Angelopoulou MK, Kontopidou FN, et al. Retinoblastoma gene product and P21 (WAF1, CIP1) protein e