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文檔簡介

1、銀杏葉提取物對局灶性腦缺血大鼠腦組織炎癥信號(hào)TLR4表達(dá)的影響【摘要】 目的 觀察銀杏葉提取物對局灶性腦缺血(FCI)大鼠腦組織Toll樣受體4基因(TLR4)、蛋白表達(dá)的作用。方法 參照Longa等方法制造FCI大鼠模型,將60只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、和銀杏葉提取物組,分別采用RTPCR法及免疫組化法檢測缺血灶周圍腦組織TLR4基因、蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 模型組TLR4基因相對表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01) ;銀杏葉提取物組TLR4相對表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.01) ;TLR4蛋白表達(dá)類似于基因相對表達(dá)。結(jié)論 模型組大鼠缺血灶周

2、圍腦組織TLR4基因高表達(dá),銀杏葉提取物對TLR4表達(dá)有抑制作用,這可能是其抗炎作用的機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】 銀杏葉提取物;腦梗死;大鼠;Toll樣受體4腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病之一,尤其腦梗死(CI)具有較高的發(fā)生率、致殘率、病死率,CI后缺血損傷的機(jī)制復(fù)雜,其中過度的炎癥免疫反應(yīng)存在于CI后壞死及缺血區(qū)域,導(dǎo)致炎性損傷,此已成共識(shí),因此減輕炎癥損傷成為治療急性腦梗死(ACI)的主要途徑之一,研究證實(shí)TLR4與非生物性炎性損傷關(guān)系密切1,2。銀杏葉味甘、苦、澀,性平,有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛功效,其主要有效成分銀杏葉提取物(GBE)已被廣泛應(yīng)用于腦血管疾病3、認(rèn)知功能障礙4、炎癥5等

3、相關(guān)疾病的治療,但其對CI的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察銀杏葉提取物對CI大鼠腦組織TLR4基因及蛋白表達(dá)的影響,探討銀杏葉提取物抗CI的可能作用。2 / 151 材料與方法1.1 動(dòng)物與試劑 健康雄性Wistar大鼠60只,300350 g,由吉林大大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供許可證號(hào)DK04032007,清潔級(jí)。銀杏葉提取物為河北石家莊神威藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的舒血寧注射液,5 ml/支,折合銀杏葉提取物為17.5 mg。NAR ISH IGE SR6N腦立體定向儀(日本);電子天平(日本AND HR120,精確度為0.1 mg);RTPCR相關(guān)試劑(美國Promeg公司);引物合成(上海生工生物工程技術(shù)

4、服務(wù)有限公司合成);PCR擴(kuò)增儀(德國Eppendorf,Mastercycler gradient);低溫離心機(jī)(德國Eppendorf,Centrifuge 5417R),凝膠成像分析系統(tǒng)(SYNGENE)。1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將60只大鼠隨機(jī)分為:假手術(shù)組,模型組和銀杏葉提取物組。每組又分為6、12、24和48 h,4個(gè)亞組,每亞組均為5只大鼠。假手術(shù)組大鼠不插線,模型組及銀杏葉提取物組線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞的動(dòng)物模型。各組均為腹腔給藥,將藥物以蒸餾水制成相同濃度混懸液(40 mg/ml),模型組及假手術(shù)組均給予1 ml生理鹽水,于手術(shù)完畢后3 h給藥1次,之后每天1次,直至相應(yīng)

5、時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物,取前囟前2 mm至前囟后3 mm腦組織,以進(jìn)針點(diǎn)為界分為前后兩部分,前部分取梗死灶周圍腦組織,快速稱取100 mg,置于冰浴中的勻漿器并迅速勻漿,用于抽提總RNA。后部分腦組織用4%多聚甲醛固定液固定,4下持續(xù)固定2448 h后,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,在切片機(jī)上連續(xù)冠狀切片,片厚5 m,-20保存。1.3 RTPCR檢測血腫周圍腦組織TLR4 mRNA的表達(dá)1.3.1 梗死灶周圍腦組織總RNA抽提與純化 在冰浴勻漿器中加入1 ml Trizol及100 mg組織,迅速研磨,將勻漿液裝于EP管中,加入200 l氯仿劇烈震搖30 s,間隔放冰盒保溫,反復(fù)震蕩, 4, 12 0

6、00 r /min,低溫離心20 min,取上層水相轉(zhuǎn)移至另一EP 管中,加等體積的異丙醇,輕輕混勻,-20過夜, 4, 12 000 r/min,低溫離心20 min,棄上清,加75%乙醇700 l輕輕混勻,4,12 000 r/min,低溫離心10 min,輕輕吸出上清,室溫垂直放置2030 min涼干,加入DEPC水20 l溶解,留取1 l待測RNA濃度。1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄(RT合成第1條鏈cDNA) 在PCR管中建立如下反應(yīng)體系:依次加入如下試劑: 5×RT緩沖液5 l、dNTP (10 mmol/L) 2.5 l、Rnasin 1 l、Primer 1 l、M2MLV 1

7、l,RNA及DECP水總共14.5 l。短暫離心振蕩混勻4低溫短暫離心;在PCR儀中,37反轉(zhuǎn)錄50 min,95 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶,立即冰浴,-20保存。1.3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)TLR4引物的設(shè)計(jì) GenBank中查到TLR4序列號(hào)為( #AF057025),用Gene Toll軟件設(shè)計(jì)TLR4上游引物為5GCC GGA AAG TTA TTG TGG TGG T3(2 4422 463),下游引物為5ATG GGT TTTAGG CGC AGA GTT T3(2 7762 795),PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95×2 min后,變性95×40 s,退火52

8、×40 s,延伸72×1 min,35個(gè)循環(huán)后72延伸10 min,PCR產(chǎn)物為356 bp。內(nèi)參照actin引物序列為:上游5GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA3,下游5GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG3,擴(kuò)增產(chǎn)物為375 bp。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95×2 min后,變性95×30 s,退火52×30 s,延伸72×40 s; 35個(gè)循環(huán)后,最后延伸72×5 min。1.4 PCR產(chǎn)物的電泳鑒定 各樣品PCR產(chǎn)物5 l(actin 5 l)加于2%瓊脂糖凝膠電泳槽齒孔中,取PCR標(biāo)

9、準(zhǔn)同時(shí)電泳,作為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照。1×TBE 50 V恒壓電泳4060 min,取膠置凝膠成像系統(tǒng)中,紫外光下拍照,結(jié)果掃入電腦備處理。1.5 免疫組化染色 免疫組化染色采用SABC法,石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟,梯度酒精浸泡后充分水洗,置于3%H2O2/甲醛溶液中15 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,浸入0.01 mol/L、pH6.0枸櫞酸鹽緩液中,加熱至9298熱修復(fù)抗原, 20 min后冷卻至室溫,0.01 mol PBS(pH 6.0)振洗5 min×3次,正常山羊血清封閉液孵育30 min。滴加兔抗鼠TLR4多克隆抗體(1400), 4孵育過夜。0.01 molPBS

10、(pH 6.0)振洗5 min×3次,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗,37 孵育45 min。吸去二抗,0.01 mol PBS(pH 6.0)振洗5 min×3次;加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液,37孵育30 min。0.01 mol PBS (pH 6.0)振洗5 min×3次,DAB顯色,適時(shí)終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡下觀察。陰性對照以PBS代替一抗。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均以x±s表示,組間比較運(yùn)用單因素方差分析,兩兩比較運(yùn)用q檢驗(yàn),所有數(shù)據(jù)用SAS軟件處理。2 結(jié) 果2.1 各組腦組織TLR4 mRNA

11、相對表達(dá) 各組各時(shí)間點(diǎn)TLR4 mRNA 均表達(dá),與假手術(shù)組相比模型組各時(shí)間點(diǎn)TLR4mRNA相對表達(dá)均明顯升高,且在24 h達(dá)高峰,持續(xù)到48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) ;銀杏葉提取物組TLR4 mRNA相對表達(dá)明顯低于模型組(P<0.01),見表1,圖1。表1 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA相對表達(dá)水平的比較1)與模型組比較,2)與6,12 h組比較:均P<0.01,下表同圖1 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA表達(dá)2.2 各組大鼠腦組織TLR4蛋白的表達(dá) 假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)偶有TLR4少量表達(dá);TLR4表達(dá)以小膠質(zhì)細(xì)胞為主,位于細(xì)胞胞漿內(nèi)

12、。模型組在觀察的時(shí)間段內(nèi)6、12、24及48 h TLR4蛋白表達(dá)明顯增多,于缺血后24 h達(dá)高峰,持續(xù)大約48 h。銀杏葉提取物組TLR4蛋白相對表達(dá)明顯低于模型組(P<0.01),見表2。表2 各組大鼠腦組織TLR4蛋白的表達(dá)3 討 論銀杏葉提取物抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用正逐漸受到重視。腦缺血損傷見于許多臨床病理過程,影響這一過程的因素是多方面的。一般認(rèn)為,腦缺血損傷是典型的非感染性炎癥損傷,氧自由基產(chǎn)生、炎癥介質(zhì)釋放是其重要機(jī)制。然而,在臨床試驗(yàn)中抗炎治療并沒有效果,或許這些藥物抑制炎癥通路的效果有限。長期以來對炎癥發(fā)生機(jī)制缺乏清晰的認(rèn)識(shí)妨礙了人們對炎性細(xì)胞因子在腦缺血損

13、傷中的作用給出合理的解釋。近年認(rèn)為TLR4在非生物性炎癥損傷中起重要作用1,2。TLR4的結(jié)構(gòu)及其參與促炎反應(yīng)、促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟分化及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等方面研究的較為清楚。目前已證實(shí)人和鼠腦內(nèi)有眾多的TLR4表達(dá)6,TLR4廣泛分布腦室周圍血管叢,小膠質(zhì)細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞,腦內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)TLR4 mRNA。多種PAMP如肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白以及氧應(yīng)激,氧自由基等均可激活TLR4,最終引起TNF,ILs等前炎癥因子的激活,導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑鏈?zhǔn)结尫哦a(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。TLRs家族不僅識(shí)別外源性微生物,而且識(shí)別內(nèi)源性有害物質(zhì)7,如參與調(diào)節(jié)機(jī)體對壞死細(xì)胞、熱休

14、克蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物等的應(yīng)答。最近研究證實(shí)8,9TLR4在誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,小膠質(zhì)細(xì)胞是損傷介質(zhì)的主要來源。TLR4作為炎性跨膜受體在感染性疾病研究領(lǐng)域中已是熱點(diǎn)。本研究中假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)TRL4 mRNA相對表達(dá)變化無差異,模型組6、12、24、48 hTLR4 mRNA相對表達(dá)明顯增多,于缺血后24 h達(dá)高峰,并持續(xù)到48 h,與模型組比較銀杏葉提取物組能顯著降低腦出血大鼠TLR4 mRNA的相對表達(dá),TLR4蛋白表達(dá)類似于基因表達(dá)。由此可以推斷,局灶性腦缺血后損傷組織釋放的內(nèi)源性激活物被TLR4識(shí)別后,啟動(dòng)了TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)通路,并進(jìn)一步激活NFB而釋放致炎細(xì)胞

15、因子而造成組織損傷。而銀杏葉提取物可以降低TLR4基因、蛋白的表達(dá),從而抑制之后一系列瀑布式炎癥損傷,并最終減輕腦水腫,而其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究?!緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Li C,Ha T,Kelley J,et al.Modulating Tolllike receptor mediated signaling by (13)betaDglucan rapidly induces cardioprotectionJ. Cardiovasc Res,2004;61 (3):53847.2 Cao CX,Yang QW,LV FL,et al.Reduced cerebral ischemia

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