RNA干擾沉默STAT3基因表達對人大腸癌細胞生物學(xué)行為的影響

1、RNA干擾沉默STAT3基因表達對人大腸癌細胞生物學(xué)行為的影響 作者：孫海波 李靜 安鼎偉 陳麗 張照果【摘要】 目的 探討RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默STAT3基因表達對人大腸癌細胞生物學(xué)行為的影響。方法 采用真核細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HCT116細胞，MTT法檢測細胞增殖，RTPCR、Western blot及免疫組化法分別觀察STAT3基因和蛋白的變化，流式細胞儀及AO/EB染色觀察細胞凋亡。結(jié)果 pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重組質(zhì)粒對大腸癌細胞的增殖有明顯抑制作用，與空白組及陰性組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2、(P<0.05);在重組質(zhì)粒組，STAT3基因mRNA及蛋白的表達與空白組及陰性組相比明顯減低(P<0.05);重組質(zhì)?？烧T導(dǎo)HCT116細胞凋亡，細胞周期分期示細胞阻滯于G2期。結(jié)論 pSilencer 3.0H1siRNASTAT3重組質(zhì)?？梢种芐TAT3基因在人大腸癌細胞中的表達。 【關(guān)鍵詞】 STAT3;RNA干擾;大腸癌;基因治療大腸癌發(fā)生發(fā)展過程受諸多因素的影響1。傳統(tǒng)的放療、化療及手術(shù)治療仍不能獲得理想的效果，而基因治療逐漸成為大腸癌研究的熱點。轉(zhuǎn)錄信號傳導(dǎo)子與激活子家族(signal transducers and activators of tra

3、nscription，STAT)的重要成員STAT3，其信號傳導(dǎo)通路與細胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān)，該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，目前將其定義為癌基因2。本文通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制STAT3基因在人大腸癌細胞HCT116中的表達，觀察其對大腸癌細胞生物學(xué)行為的影響，為大腸癌基因治療提供有效靶點及技術(shù)。2 / 141 材料與方法1.1 材料 AntipSTAT3(Y705)、actin兔抗人多克隆抗體購自cst公司。人結(jié)腸癌HCT116細胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。轉(zhuǎn)染試劑siPORT NeoFX購于Ambion公司，IMDM、胎牛血清購自Gib

4、co公司，常規(guī)試劑由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心提供。pSilencer1.0U6STAT3siRNAGFP重組質(zhì)粒由本室保存，超純質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒(去內(nèi)毒素)購于EZNA公司，質(zhì)粒提取按說明書進行，經(jīng)DNA定量0.5 g/L者待用。1.2 方法1.2.1 MTT法 取對數(shù)生長期細胞，轉(zhuǎn)染前1 h，0.25%胰酶消化后，含10%胎牛血清的IMEM培養(yǎng)基終止消化，收集備用。實驗分為空白組(M)，pSH1SiScramble組(N)，pSH1SiSTAT3組(T)，T組再按質(zhì)粒濃度分為T1、T2、T3。每組分24 h、48 h、72 h三個時間段，每時間段 4復(fù)孔。各組質(zhì)粒分別?。篘組0.8 g，

5、T1組0.6 g，T2組0.8 g，T3組1.2 g加染試劑2.0 l，于24 h、48 h、72 h相差顯微鏡下觀察拍照后，各孔加入5 g/L的MTT 20 l，孵育4 h，棄上清，每孔加入分析純DMSO 100 l，震蕩10 min，酶標儀檢測各孔吸光度值(A570)，計算細胞生長抑制率。實驗共重復(fù)3次。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組/對照組)×100%。1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 h，按上述方法收集細胞備用。實驗分為M、N、T共3組。將轉(zhuǎn)染試劑5.0 l溶于終體積IMDM(17.7 g/L)100 l，混勻后制成A液，室溫孵化10 min;各組質(zhì)粒分別取3.0 g溶于I

6、MDM(17.7 g/L)100 l，混勻后制成B液;將A液加入B液，混勻后制成C液，室溫孵化10 min。分配C液200 l到6孔板各孔中，調(diào)細胞濃度為2×105/孔。轉(zhuǎn)染后72 h，相差顯微鏡觀察細胞生長情況后進行后續(xù)實驗。1.2.3 RT-PCR 收獲的細胞按說明書完成RNA提取，取總RNA 10 g逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR條件:94，5 min;94，30 s;56，30 s;72，45 s;72，7 min，30循環(huán)，25 l體系，以actin為內(nèi)參。PCR產(chǎn)物以20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Gene genius凝膠成像系統(tǒng)分析后，以STAT3/actin產(chǎn)物量的比值為最終

7、結(jié)果。實驗重復(fù)3次。引物序列:STAT3：正向5TTGCCAGTTGTGGTGATC3，反向5AGACCCAGAAGGAGAAGC3;actin:正向5AAGTACTCCGTGTGGATCGG3，反向5ATGCTATCACCTCCCCTGTG3。1.2.4 Western印跡法 收獲的細胞，加入裂解液，超聲裂解20 s，冰上靜置30 min，12 000 r/min 4離心25 min，上清為總蛋白粗提液。BCA法蛋白定量，取總蛋白40 g/20 l，煮沸變性5 min，SDSPAGE電泳后半干法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，AntiPSTAT3及actin兔抗人多克隆抗體濃度為11 000，堿性磷酸酶標

8、記的羊抗兔二抗?jié)舛葹?1 000，NBT/BCIP 顯色。Gene genius凝膠成像系統(tǒng)分析后，以STAT3/actin蛋白量的比值為最終結(jié)果。實驗共重復(fù)3次。1.2.5 細胞免疫組化法 按上述轉(zhuǎn)染步驟將細胞分M、N、T共3組轉(zhuǎn)染于6孔板內(nèi)，72 h后取出蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察拍照后用40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗3次，蒸餾水洗3次，TritonX 100(0.3%)洗10 min，PBS洗5 min×3次，其余步驟按免疫組織化學(xué)染色說明書操作。陽性結(jié)果為細胞質(zhì)或胞核棕黃著色，隨機選取5個高倍鏡視野，計數(shù)陽性細胞占所研究細胞的15%以上即為陽性。1.2.6 流

9、式細胞術(shù)(FCM) 取轉(zhuǎn)染48 h后的細胞1×106個，離心后用冷PBS懸浮，1 000 r/min離心10 min，清洗2遍，棄上清，將細胞用1 ml注射器快速推入700 ml/L冷乙醇中，4固定12 h以上。PBS洗2次，調(diào)細胞密度為1×109/L，RNase消化后，加入50 mg/L 1.5 ml PI染液?；靹蚝笊狭魇郊毎麅x做單參數(shù)分析，計算各期細胞所占比例，實驗共重復(fù)3次。1.2.7 AO/EB雙染色 取轉(zhuǎn)染72 h后的細胞，制成懸液并調(diào)細胞密度為1×1010/L，取20 l加100 mg AO染液2 l及100 mg EB染液2 l，滴于載玻片，蓋片封

10、片后熒光顯微鏡直接觀察，于20 min內(nèi)計數(shù)500個細胞。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，計量資料采用x±s表示;兩組均數(shù)的比較用t檢驗。2 結(jié) 果2.1 細胞增殖活性判定 參照轉(zhuǎn)染試劑說明書推薦的質(zhì)粒最佳轉(zhuǎn)染濃度，設(shè)計3種不同濃度(0.015 g/L、0.020 g/L、0.030 g/L)的pSH1SiSTAT3，結(jié)果顯示細胞增殖活性隨質(zhì)粒濃度增高而下降，但在0.020 g/L和0.030 g/L濃度之間變化不大，故選擇0.020 g/L作為最佳質(zhì)粒濃度進行以后的實驗。MTT結(jié)果顯示，N組細胞生長速度略慢于M組，T組細胞生長明顯慢于M組及N組，生長抑制

11、率24、48、72 h分別為13.32%、35.44%、 44.14%，48 h及72 h組與M組細胞相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。2.2 HCT116細胞STAT3表達 RTPCR結(jié)果顯示，T組STAT3基因的mRNA表達明顯降低，STAT3產(chǎn)物量/actin的比值分別為0.866±0.03、0.853±0.02、0.453±0.03，T組與M組、N組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。Western印跡結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒治療組PSTAT3蛋白表達亦明顯減弱，STAT3蛋白量/actin分別為0.780±

12、;0.01、0.713±0.01、0.430±0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。細胞免疫組化結(jié)果顯示，M組及N組胞漿和/或胞核中可見大量棕黃著色細胞，而T組僅見部分細胞核中含有棕黃色顆粒。表1 不同處理組HCT116細胞吸光度A值比較圖1 不同處理組HCT116細胞STAT3基因mRNA表達2.3 大腸癌HCT116細胞凋亡 FCM結(jié)果示T組細胞出現(xiàn)明顯的細胞凋亡峰，凋亡率達20.6%，與M組及N組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細胞周期分析示T組細胞出現(xiàn)G2期阻滯，T組S期與G2期細胞數(shù)與M組及N組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P&

13、lt;0.05)，見表2。AO/EB雙染色結(jié)果M組及N組細胞呈綠色或黃綠色熒光，T組細胞可見較多黃色熒光，偶見紅色熒光，提示實驗組細胞較多呈早中期凋亡。見圖3。圖2 不同處理組HCT116 STAT3蛋白Western印跡表2 不同處理組HCT116細胞凋亡率及細胞周期分布圖3 不同處理組HCT116細胞AO/EB雙染色(熒光顯微鏡，×400)3 討 論STAT3是作為白細胞介素6(IL6)信號傳遞中的急性反應(yīng)因子最早被發(fā)現(xiàn)并被純化的3，其所參與的JAK/STAT信號傳導(dǎo)通路與細胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān)，該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，為腫瘤形成過程中的重要環(huán)節(jié)2，4

14、，5。Joshua等6研究表明，STATs所介導(dǎo)的JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。我們的前期研究亦證實在42例人大腸癌組織及癌旁組織中均有STAT3mRNA及蛋白的高表達，同時檢測的下游基因cmyc、survivin及VEGF基因在大腸癌及癌旁組織中的表達亦增高，p53基因降低，提示STAT3的異常激活在大腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要的促進作用并阻斷了某些重要抑癌基因的活性7，因而STAT3基因可望成為大腸癌治療的新靶點。RNAi是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默方式8。并以其高效性、高特異性等優(yōu)點而作為研究基因功能的一種重要和常用的技術(shù)，已廣泛用于基因研

15、究和臨床疾病尤其是腫瘤的治療研究，有廣闊的前景和應(yīng)用潛力。Zheng等用RNAi技術(shù)在人胰腺癌SW1990細胞中成功的抑制了STAT3的表達，為防止胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了新的策略9。本研究應(yīng)用針對人的STAT3基因的siRNA構(gòu)建表達載體pSilencer3.0U6STAT3siRNAGFP，轉(zhuǎn)染過度表達STAT3基因的人大腸癌細胞株HCT116，結(jié)果表明重組質(zhì)粒在mRNA及蛋白水平均可抑制STAT3基因表達，MTT結(jié)果亦表明T組HCT116細胞的增殖活性明顯減低，可見RNAi可使大腸癌HCT116細胞的生物學(xué)行為明顯受抑，為大腸癌的基因治療提供了可靠的依據(jù)。此外，應(yīng)用RNAi沉默STAT3

16、基因后，S期細胞所占比例明顯減少而阻滯于G2期的細胞增加，凋亡細胞所占百分率明顯增加，這與Kunigal等5在乳腺癌中的研究相似。表明RNAi抑制STAT3基因可促進HCT116細胞凋亡，有助于抑制大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移并指導(dǎo)診療。我們在本研究中還發(fā)現(xiàn)N組的細胞在轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)部分細胞形態(tài)改變， mRNA及蛋白表達也有變化，雖然與M組相比無顯著性差異，但提示轉(zhuǎn)染試劑及攜有無關(guān)序列的表達載體對細胞還是存在一定的毒性作用及脫靶效應(yīng)，如能有效克服，將使以siRNA為主的基因重組藥物發(fā)揮更理想的治療作用。因此，應(yīng)用RNAi技術(shù)可抑制STAT3基因在大腸癌細胞中的表達，人工合成的STAT3siRNAGFP可通過

17、抑制大腸癌細胞的增殖、促進大腸癌細胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，STAT3基因可成為大腸癌治療中重要的靶點?！緟⒖嘉墨I】 1 Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statisticsJ.CA Cancer J Clin,2008;(58):7196.2 Kong LY,Wei J,Amit KS,et al.A novel phosphorylated STAT3 inhibitor enhances T cell cytotoxicity against melanoma through inhibition of regulatory T cellsJ.C

18、ancer Immunol Immunother,2009;58(7):102332.3 Lutticken C，Wegenka UM.Association of transcription factor APRF and protein kinase Jak1 with the interleukin6 signal transducer gp130J. Science,1994;263(5143):8992.4 Samavati L,Rastogi R,Du W,et al.STAT3 tyrosine phosphorylation is critical for interleukin 1 beta and interleukin6 production in response to lipopolysaccharide and live bacteriaJ.Mol Immun,2009;146(89):186777.5 Kunigal S，Lakka SS,Sodadasu PK,et al.Stat3siRNA induces Fasmediated apoptosis in vitro and in vivo in breast cancerJ.Intern J Oncol,2009