斜面低溫保藏法

1、斜面低溫保藏法此法為實驗室工作用菌種的最常用的保藏方法操作簡單，使用方便，不得特殊設備， 操作時，將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至2-8C冰箱中保藏。保藏時間依微生物的種類而有所不同，霉菌、放線菌及芽 胞的菌保存 2-4 個月，移種一次；酵母菌兩個月移種一次，細菌最好每月移種一次。此法 的缺點是菌種容易變異， 因為培養(yǎng)基的物理、 化學特性不是嚴格恒定的， 傳代過多會使微生 物的性狀和代謝發(fā)生變異，在傳代過程中，污染雜菌的機會也較多。因此，此法僅能用于工作用菌種的短期保藏， 并應隨時檢查其污染雜菌和變異等情況， 傳代代數(shù)超過 5 代的菌種應 滅菌處理后拋棄。xxx 食

2、品檢測中心作業(yè)指導書1. 目的 規(guī)范實驗室菌種的收集、使用、保管程序；確保實驗室的安全。2. 范圍 本管理細則適用于實驗室菌種的使用和管理。3. 職責3.1 菌種保管員：按照本指導書做好菌種的收集、轉(zhuǎn)種、使用、保存和發(fā)放以及銷毀工作。3.2 科室負責人：負責監(jiān)督菌種的使用及管理。4. 管理細則 本實驗室保存的菌種僅包括一部分致病性較弱的三類細菌、 一部分無致病能力的普通細菌和 常見真菌。不包括病毒、螺旋體、衣原體、立克次體；保存的菌種主要用于各類培養(yǎng)基、檢 測試劑的性能測試和質(zhì)量控制。4.1 在本實驗室保管的菌種名4.1.1 保留工作菌種：大腸桿菌 ATCC25922 、鼠傷寒沙門氏菌 500

3、13 、福氏志賀氏菌 2a ATCC12022、副溶血性弧菌 200904-1、金黃色葡萄球菌 ATCC25923、表皮葡萄球菌 ATCC12228 溶血性鏈球菌 23310、銅綠假單胞菌 10211、普通變形桿菌，克雷伯氏桿菌，小腸 結 腸 炎 耶 森 氏 菌 ATCC 23715 、 單 核 增 生 李 斯 特 菌 ATCC19111 、 枯 草 芽 胞 桿 菌ATCC6633b、蠟狀芽胞桿菌 ATCC11778、白色念珠菌 ATCC10231、釀酒酵母 ATCC9763、黑 曲霉菌 、展青霉菌 、 黃曲霉菌。4.1.2 常規(guī)檢測 ,科研分離得到的有保留價值的三類 /四類菌種根據(jù)需要可繼續(xù)

4、保留； 如果在食 品中分離到二類 /一類菌種 ,及時送上級單位進一步鑒定 ,并按規(guī)定立即銷毀。 本實驗室不保存 一類、二類菌種。4.2 菌種的保管4.2.1 實驗室菌種保存于專用的菌種室。4.2.2 菌種保管員及科室負責人雙人雙鎖負責保管菌種。4.2.3 使用菌種需提出申請、經(jīng)科室負責人批準后，向菌種保管員領用。4.2.4 菌種應按規(guī)定的時間定期轉(zhuǎn)種，一般每轉(zhuǎn)種 3 代做一次鑒定，如發(fā)現(xiàn)污染或變異應及 時處理。4.2.5 保管人員工作變動時應作好交接工作。4.3 菌種的使用和保存4.3.1 菌種的類別4.3.1.1 實驗室內(nèi)的標準菌種根據(jù)用途不同，分為儲存菌種、傳代用菌種和工作用菌種。 儲存菌

5、種： 以冷凍干燥保藏為主， 用于菌種的長期保存， 一般是從菌種保藏中心或?qū)I(yè)實 驗室購買得到的標準菌株，用符號 S 表示。一般可保存 5 年。 傳代用菌種： 采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法， 用于菌種的傳代， 用符號 G 表示。甘油冷凍管保藏法一般可保存 2 年； 工作菌種：保存于半固體內(nèi)或瓊脂斜面培養(yǎng)基中，作為工作用菌種，用符號W表示。一般可保存12個月。431.2實驗室從樣品中分離得到的菌株用符號Y表示。4.3.2 菌種的接收菌種購到實驗室后， 應在菌種接收記錄上填寫所購菌種的信息， 如名稱、數(shù)量和接收日期等。 貼好標簽后儲存于-30 C以下。4.3.3 冷凍干燥菌種的恢復培養(yǎng)按

6、菌種保藏中心的要求進行恢復培養(yǎng)。中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC） 建議的方法如下： 安瓿管開封：用浸過70 %酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，用火焰將安瓿管頂端加熱，滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂，用銼刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。 菌株恢復培養(yǎng)：用無菌吸管，吸取0.3-0.4ml適宜的液體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)肉湯），滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，取約 0.2ml 菌體懸浮液，移植于指定的瓊脂斜 面/平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入指定的液體培養(yǎng)基內(nèi)（3-4ml）,然后在建議的溫度下（一般培養(yǎng)溫度 32.5C戈.5C, 1824h）培養(yǎng)。 注意事項：菌種活化前，請將安瓿

7、管保存在5-10 C的環(huán)境下；某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長。4.3.4 菌種的傳代從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0代。按轉(zhuǎn)種次數(shù)確定菌種的代數(shù)： 冷凍干燥的菌種在液體培養(yǎng)基內(nèi)恢復培養(yǎng)（第1代）后，轉(zhuǎn)種至平板培養(yǎng)基上得到單個純菌落，此為第 2 代。菌種傳代一般不超過5 代。 鑒定菌種后制甘油冷凍管 經(jīng)菌種特性鑒定后， 挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備 甘油冷凍管，此作為第 2代傳代用菌種（G2）;同時挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面，此菌種作為工作 用菌種，為第 3代（ W3）。 將第2代傳代用菌種（G2）管冷凍保存（-30 C以下），將第3代工作用菌種（

8、W3）以適 當溫度下培養(yǎng)適當時間后可用于實驗。 取一支冷凍保存的第 2代傳代用菌種（G2）轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板上的菌種 制成甘油冷凍管，為第 3代傳代用菌種（G3）;斜面培養(yǎng)基經(jīng)適當溫度下培養(yǎng)適當時間后可 用作第 3 代工作用菌種（ W3）。 當工作用菌種代數(shù)小于 5時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種，如W3可直接轉(zhuǎn)接為 W4。 按上述程序操作，直至 G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟安瓿，再重復上述操作程序保藏和 使用菌種。4.3.5 菌種的保存方法4.3.5.1 甘油冷凍管保存法 甘油冷凍管保存法適用于保存?zhèn)鞔镁N，一般可保存 2 年。 將待保存用菌種接種至平板或瓊脂斜

9、面，經(jīng)37C 2448h培養(yǎng)后，用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔， 移至預先裝有無菌蒸餾水的試管中， 調(diào)整菌液濃度， 使其等同于 1 單位麥氏比濁管。 向已制備好的菌懸液中加入等體積，濃度為20%的無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。 輕輕振搖，使10%甘油菌懸液充分混合，分裝于無菌小試管中，在-30C條件下貯存。4.3.5.2 液體石蠟覆蓋保藏法 液體石蠟覆蓋保藏法適用于保存?zhèn)鞔镁N，一般可保存 3-6 個月。 取純化菌種穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中，經(jīng)37C 1824h培養(yǎng)后，加無菌液體石蠟覆蓋半固體表面（高度 1 厘米為宜）。 石蠟油封存以后，放入 4C冰箱中保存，也可直接放在低溫干燥處保藏。腸道細菌

10、、葡 萄球菌一般可保存 3-6 個月；保存 O1 群和非 O1 群霍亂弧菌時宜放置室溫陰暗處；保存副 溶血性弧菌時，用含 3.5%氯化鈉半固體，宜放置室溫陰暗處；保存葡萄球菌、鏈球菌可用 10%血半固體。4.3.5.3 斜面低溫保存法斜面低溫保存法適用于保存工作用菌種，一般可保存1 2 個月取純化菌種轉(zhuǎn)接種于適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)37C 1824 C培養(yǎng)后，用紙將管塞部分包扎好，放入4C冰箱中保存，也可直接放在低溫干燥處保藏。4.4 菌種的實驗室編號編號原則：菌種名稱 +類別/傳代次數(shù)-制備日期或接收日期，例副溶-G3-20081213。對于實驗室從樣本中分離得到的菌種，類別用 Y 表示，例副溶 -Y3-20081213 。注：菌種名稱使用中文簡稱，如 “副溶血性弧菌 ”用“副溶”表示； “金黃色葡萄球菌 ”用“金葡” 表示； “奇異變形桿菌 ”用“奇變 ”表示。4.5 菌種的銷毀4.5.1菌種銷毀采用高壓蒸汽滅菌：121C, 20分鐘。4.5.2下列菌種需及時銷毀處理：發(fā)生污染或變異的菌種；超過保存期限的菌種；使 用后的菌種。5. 記錄表式 菌種接收記錄表 菌種使