DNA提取中各種試驗試劑作用原理

1、DN碾取中各種實驗試劑作用原理1、STE是Tris-Hcl 、EDTA Nacl的混合液。其總體作用是為 DN砒供保護環(huán)境，在此環(huán)境下DNA可以呈穩(wěn)定態(tài)，最少限度地受到破壞。Tris.HCl提供緩沖體系，DNAS這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)。EDTA是DNAB的抑制劑，可以防止細胞破碎后DNAB降解DNANaCl,有利于DNA的溶解。2、SDS的作用：利用高濃度的陰離子去垢劑 SDS（十二烷基磺酸鈉，Sodium dodecyl sulfate ）使DNA與蛋白質分離，在高溫（5565C）條件下裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質及多糖雜質沉淀，離心后

2、除去沉淀，3、苯酚的作用：使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與 DNA聯結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質；2.抑制了 DNase的降解作用。缺點：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分 poly （A） RNA 2.不能完全抑制 RNase的 活性。Tris酚的顏色，一般為黃色。如果變成粉紅色，說明被氧化，不能再用。4、氯仿的作用克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）5、異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產

3、生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。6、用乙醇沉淀 DNAM,為什么加入單價的陽離子？用乙醇沉淀DNAM,通常要在溶液中加入單價的陽離子，如 NaCl或NaAc, Na+中和DNA 子上的負電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。7.為什么在保存或抽提 DNA±程中，一般采用 TE緩沖液？在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa= 7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞

4、內環(huán)境的生理范圍(pH),可作DNA勺保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2+產生Ca3(PO4)2沉淀，在DN版應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用 Tris-HCl (pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是 TrisH+/Tris ,不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用 Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDT心能穩(wěn)定。8、STE是Tris-Hcl 、EDTA Nacl的混合液。其總體作用是為 DNAj供保護環(huán)境，在此環(huán) 境下DNA可以呈穩(wěn)定態(tài)，最少限度地受到破壞。Tris.HCl提供緩沖體

5、系，DNAS這一體系中呈穩(wěn)定態(tài)。EDTA是DNAB的抑制劑，可以防止細胞破碎后DNAB降解DNANaCl,有利于DNA的溶解。9、SDS的作用：利用高濃度的陰離子去垢劑SDS(十二烷基磺酸鈉，Sodium dodecyl sulfate )使DNA與蛋白質分離，在高溫(5565C)條件下裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性， 釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質及多糖雜質沉淀，離心后除去沉淀，10、苯酚的作用：使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與 DNA聯結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子 溶于酚相，而DNA溶

6、于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質；2.抑制了 DNase的降解作用。缺點：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分 poly (A) RNA 2.不能完全抑制 RNase的 活性。Tris酚的顏色，一般為黃色。如果變成粉紅色，說明被氧化，不能再用。11、氯仿的作用克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。(酚易溶于氯仿中)5、異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少 氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。12、用乙醇沉淀 DNA寸，為什么加入單價的

7、陽離子？用乙醇沉淀DNAM,通常要在溶液中加入單價的陽離子，如 NaCl或NaAc, Na+中和DNA子上的負電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。Tris中文品名：三羥甲基氨基甲烷；氨基丁三醇；緩血酸胺nh2 八。HHO，Tris結構式英文品名：Tris; Tris(Hydroxymethyl)aminomethane英文別名：2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol THAM; Tris base; Trometamol通用 CAS : 77-86-1產品純度：100%(USP藥典級)/ 99.9%(實驗室技術級)產品級別：U

8、SP藥典級，符合USP/EP/cGMP寸藥物賦形劑的要求分子式：NH2c(CH2OH)3分子量：121.14使用用途：生物制藥，體外診斷，個人護理及化妝品原料等保存溫度：常溫密封避光保存TRIS是一種最常用的生物緩沖液，常配成PH值為6.8, 7.4 , 8.0 , 8.8。其PH值隨溫度變化很大。一般來說，溫度每升高一度，PH值下降0.03。1M TRIS-HCl 6.8 和 1.5M TRIS-HCl 8.8 是 SDS-PAGEt常用的試劑。而由TRIS配成的TAE, TBE等是DNA電泳最常用的試劑，TE ( PH8.0)主要用于溶解 DNATE 為 Tris 力口 EDTA稱。緩沖特

9、性：Tris為弱堿，在室溫(25C)下，它的 晅為8.1 ;根據緩沖理論，Tris緩沖 液的有效緩沖范圍在 pH7.0到9.2之間。Tris堿的水溶液pH在10.5左右，一般加入鹽酸 以調節(jié)pH值至所需值，即可獲得該pH值的緩沖液。但同時應注意溫度對于Tris的pKa的影響。衍生緩沖液：由于Tris緩沖液為弱堿性溶液，DNA在這樣的溶液中會被去質子化，從而提高其溶解性。人們常常在Tris鹽酸緩沖液中加入 EDTA制成“TE緩沖液:TE緩沖液被用于DNA勺穩(wěn)定 和儲存。如果將調節(jié)pH值的酸溶液換成乙酸，則獲得“TAE緩沖液” (Tris/Acetate/EDTA ), 而換成硼酸則獲得“ TBE緩沖液” (Tris/Borate/EDTA )。這兩種緩沖液通常用于核酸電泳 實驗中。制備：Tris 可以由兩步反應生成：先由硝基甲烷生成中間體三羥甲基硝基甲烷 (HOCH2)3CNO2,然后再由該中間體還原得到Tris 。用途：Tris緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質白溶劑，還有許多重要用途。