人BNIP3基因在Hela細胞中的表達及定位

1、人BNIP3基因在Hela細胞中的表達及定位 作者：陳登宇 劉蕓 鐘田雨 王蔚 趙明哲 劉靖華 姜勇【摘要】 目的： 構建BNIP3-HA融合蛋白的真核表達載體，觀察BNIP3在Hela細胞中表達及其定位。方法： 采用兩步克隆法將HA和BNIP3的編碼序列以融合表達的形式克隆到載體pcDNA3上，隨后轉染Hela細胞。BNIP3經(jīng)AlexaFluor 488免疫熒光標記，線粒體用MitoFluor Red 589染色后在熒光顯微鏡下觀察BNIP3的表達和定位。結果： 重組質粒經(jīng)酶切、聚合酶鏈反應(PCR) 和測序鑒定構建正確，并在Hela細胞中能夠表達，在熒光顯微鏡下觀察，BNIP3-HA融合

2、蛋白分布于線粒體。結論： 成功構建BNIP3-HA融合蛋白表達載體并在Hela細胞線粒體中表達。 【關鍵詞】 基因，bcl-2； Hela細胞； 線粒體； 熒光免疫測定； 細胞內定位 Abstract Objective: To construct human BNIP3 fuse protein vector, express it in Hela cells, and determine its location in the cells. Methods: The expression vector was constructed by cloning the coding sequen

3、ces of fusion protein of human BNIP3 and HA onto vector pcDNA3 by two-step method; The constructed vector was then transfected into Hela cells and observed with fluorescence microscope. The recombinant plasmid was verified by enzyme digestion, polymerase chain reaction (PCR) and sequence analysis. R

4、esults: The fusion protein was highly expressed in Hela cells. Being observed with fluorescence microscopy, the fusion protein of human BNIP3 and HA was found to distribute in the mitochondria. Conclusion: The expression vector of BNIP3 fusing to HA is successfully constructed and the fusion protein

5、 has expressed in the mitochondria of Hela cells, which would facilitate the further study of BNIP3.2 / 15 Key words genes,bcl-2; hela cells; mitochondria; fluoroimmunoassay; intracellular localization BNIP3作為bcl-2家族中促凋亡成員，在腫瘤的缺氧凋亡和免疫耐受的研究中有著非常重要的意義1。以往的研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3促進細胞凋亡主要是通過線粒體凋亡途徑完成的。但BNIP3的線粒體膜轉位及

6、其促細胞凋亡機制尚不清楚1。構建帶有HA標簽的BNIP3真核表達載體，并通過細胞免疫熒光技術觀察了該蛋白在人Hela細胞線粒體中的定位情況，試圖為探討B(tài)NIP3蛋白在不同細胞類型中的表達和亞細胞定位，及其與線粒體內其他蛋白質的相互作用奠定基礎。 1 材料和方法 1.1 主要材料 克隆載體pcDNA3購自Clontech公司；大腸桿菌DH5及人Hela細胞系均為本室保存；PolyFect 轉染試劑購自Qiagen公司; 小鼠HA單克隆抗體購自Cell Signaling公司；羊抗鼠IgG（H+L）AlexaFluor488、MitoFluor Red 589和DAPI細胞核染色試劑購自Molec

7、ular Probes公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco-BRL公司; 胎牛血清（FBS） 購自HyClone 公司; 微量質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自U-gene 公司; 限制性核酸內切酶Kpn I、EcoR I、Xba I、BamH I、Ligation high試劑、高保真DNA 聚合酶Kodplus和Kodplus突變試劑盒購自ToYoBo公司; 引物由北京英駿公司合成；1 kb、500 bp DNA Marker 購自NEB公司；瓊脂糖和LB培養(yǎng)基購自Life Technology公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。 1.2 pcDNA3-BNIP3-HA 融合蛋白真核表達載體的構建

8、構建流程見圖1。設計分別含有HA序列片段的上下游引物,將HA編碼序列插入質粒pcDNA3的多克隆位點中的Xba I和Apa I之間，上游引物為5ccagattacgcttaagggccctattctatagtgtcacc 3,下游引物為5aacatcgtatgggta tctagatgcatgctcgagcg 3。以高保真DNA 聚合酶KOD plus 進行反向聚合酶鏈反應(PCR )。反應條件: 94 、2 min, 98 、10 s, 55 、30 s，68 、5 min 30 s, 10 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物直接進行Dpn I酶切反應1 h, 產(chǎn)物使用T4DNA連接酶和Ligation

9、high 16 過夜連接,反應產(chǎn)物轉化氯化鈣制備的新鮮DH5感受態(tài)菌并接種到含有氨芐青霉素的Luria Bertani(LB) 瓊脂培養(yǎng)板, 37 CO2 孵箱培養(yǎng)12 h。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中, 37 振搖過夜。小量提取質粒, 分別進行測序鑒定。構建質粒命名為pcDNA3-HA。 設計分別含EcoR I 和Xba I 酶切位點的上下游引物, 從載體pDEST22-BNIP3載體上擴增BNIP3編碼序列, 上游引物為5cggaattcacccagaccctcaagtacgcctccagag 3, 下游引物為5gc tctaga tctgtccaaaaactgtaggtt

10、gatgctcctttc 3,以高保真DNA聚合酶KODplus進行PCR , 反應條件: 94 、15 s, 55 、30 s，68 、2 min, 35 個循環(huán)。用EcoR I和Xba I核酸內切酶分別對PCR 產(chǎn)物及載體質粒pcDNA3-HA 進行雙酶切。酶切產(chǎn)物凝膠電泳分離并回收,T4 DNA連接酶16 過夜連接。連接產(chǎn)物轉化DH5感受態(tài)菌并接種到含有氨芐青霉素的LB 瓊脂培養(yǎng)板,37 CO2 孵箱培養(yǎng)12 h。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中,37 振搖過夜。小量提取質粒, 分別進行PCR、EcoR I和Xba I酶切及測序鑒定。構建質粒命名為pcDNA 3-BNIP3-

11、 HA。 1.3 脂質體介導的瞬時轉染和表達 Hela 細胞培養(yǎng)于含有體積分數(shù)為10% FBS、0.1 mmol/L 非必需氨基酸的DMEM 中, 置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱, 37 培養(yǎng)。轉染前24 h按6×104個細胞將細胞傳代鋪于petri皿中。待細胞長至約40%50% 融合時, 按照polyfect轉染試劑盒說明進行轉染，先將300 ng 質粒DNA用無血清培養(yǎng)基稀釋至終體積20 l并混勻, 取3 l PolyFect加入DNA中, 溫和混勻, 于室溫下孵育10 min。期間給細胞置換新鮮的含有10% FBS的DMEM。在DNA轉染復合物中加入120 l 含10% FB

12、S的培養(yǎng)基, 輕柔混勻并均勻滴入petri皿中,然后將細胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 1.4 細胞固定、染色觀察及照像 觀察前, 去除細胞培養(yǎng)上清, PBS洗滌1 次, 以體積分數(shù)為4% 的多聚甲醛固定細胞10 min; PBS洗滌3次, 以體積分數(shù)為0.1%的PBST處理細胞5 min，PBS洗滌3次，以質量分數(shù)為0.1%的硼氫化鈉(NaBH4) 處理細胞5 min; PBS 洗滌3次,3%BSA室溫封閉1 h，0.1%的PBST洗滌3次，小鼠HA單克隆抗體為一抗，室溫孵育1 h，0.1%的PBST洗滌3次，羊抗鼠IgG（H+L）AlexaFluor488為二抗，室溫孵育

13、1 h，0.1%的PBST洗滌3次，再以100 l 的DAPI細胞核染色試劑染核5 min。PBS洗滌細胞,以500 nmol/L的MitoFluor Red 589 線粒體染料100 l于37 孵育15 min，PBS洗滌3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察結果并照像。 2 結果 2.1 構建載體鑒定 2.1.1 構建質粒pcDNA3-HA鑒定 見圖2。DNA測序結果顯示, HA片段插入位置正確，重組pcDNA3-HA 質粒構建正確。 圖2 構建載體測序鑒定 Fig.2 Identification of vectors by sequencing 2.1.2 構建質粒pcDNA 3-BNIP3-

14、HA鑒定 見圖3。PCR 擴增產(chǎn)物電泳可見到特異的約579 bp DNA片段,與插入的DNA 序列大小相符。EcoR I和Xba I雙酶切鑒定產(chǎn)物電泳可見514 kb和579 bp 2個條帶,一條與pcDNA3-HA原質粒EcoR I和Xba I雙酶切產(chǎn)物電泳結果一致,另一條與PCR 產(chǎn)物大小一致。并經(jīng)DNA測序結果顯示,重組pcDNA 3-BNIP3- HA質粒構建正確。 2.2 BNIP3- HA 融合基因在Hela細胞內的表達見圖4。pcDNA3-HA轉染的對照組Hela細胞無綠色熒光分布；用0.3 mg 重組pcDNA3-BNIP3-HA 轉染Hela細胞后48 h綠色熒光布于線粒體中

15、，線粒體為紅色熒光分布，融合顏色為黃色。3 討論 人BNIP3基因全長為1 535 bp，位于10q26.3，開放閱讀框編碼1個含194個氨基酸的蛋白質，分子量為21.54 kD2。Northern雜交發(fā)現(xiàn)，BNIP3在心、肝、腦、腎、胰和骨骼肌等多種正常成人組織中均有表達2。細胞定位研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在一些真核細胞中表達后可以定位于線粒體外膜、內質網(wǎng)膜和核膜。內源性BNIP3松散地聯(lián)結于正常組織的線粒體外膜。當BNIP3過表達時，以N末端位于胞漿和C末端位于膜內的方式完全整合入線粒體外膜，通過開放MPTP和損傷線粒體功能導致細胞死亡1。 內源性BNIP3如何保持非激活和非整合狀態(tài)，內源性BNIP

16、3的線粒體膜轉位是否和其他的bcl-2家族促凋亡成員一樣是通過磷酸化、二聚體 注：A是BNIP3-HA蛋白分布; B是線粒體染色熒光結果；C是DAPI染核結果；D是 A B C三者疊加結果形成或蛋白裂解酶裂解等翻譯后修飾機制實現(xiàn)的還需進一步研究。近幾年研究結果表明，BNIP3的異常表達與許多腫瘤的進展及耐藥機制關系密切，大部分腫瘤中BNIP3的活性與相應正常組織相比是下調的，這有助于腫瘤細胞逃避缺氧誘導的細胞死亡而存活，促進腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的機制之一，許多化療藥物就是通過促進BNIP3表達，誘導腫瘤細胞凋亡而達到治療目的36。腫瘤細胞中BNIP3表達下調使凋亡減少，降低了化療藥物的細胞毒

17、性，可能是導致腫瘤耐藥的機制之一7。這些相關機制的研究是該蛋白最近研究的熱點之一。 在本文中，將分子標簽HA的編碼序列重組到BNIP3的3末端，構建了HA標簽的真核表達載體pcDNA3-BNIP3-HA。并研究了BNIP3-HA融合蛋白在人的Hela細胞內的表達定位情況，通過線粒體染料的共定位發(fā)現(xiàn)，蛋白BNIP3表達并定位于線粒體。【參考文獻】 1謝晉予,鄭長黎.BNIP3基因及其與腫瘤的關系J.國際病理科學與臨床雜志,2006(8)：298-301.2YasudaM, Theodorakis P, Subramanian T, et al. Adenovirus E1B19K/BCL-2 i

18、nteracting protein BNIP3 contains a BH3 domain and a mitochondrial targeting sequenceJ. J Biol Chem, 1998(20):12415-12421.3Guo K, Searfoss G, Krolikowski D, et al. Hypoxia induces the expression of the pro-apoptotic gene BNIP3J.Cell Death Differ,2001(4):367-376.4Yook YH, Kang KH, Maeng O, et al. Nitric oxide induces BNIP3 expression that causes cell death in macrophagesJ. Biochem Biophys Res Commun, 2004(2):298-305.5Burton TR, Henson ES, Baijal P, et al.