蛋白激酶C參與脂多糖誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)

1、蛋白激酶C參與脂多糖誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá) 作者：葛海燕，馮健，賁素琴，倪松石【摘要】 目的：觀察蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）在內(nèi)毒素/脂多糖（lipopolysacchride， LPS)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達(dá)上調(diào)中可能發(fā)揮的作用。方法：以肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，用PKC抑制劑預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞，以RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA水平的表達(dá)變化；Western Blot檢測(cè)其蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化。結(jié)果：(1)VEGF mRNA的表達(dá)水平與LPS呈劑量和時(shí)間依賴的關(guān)系

2、；（2）PKC抑制劑calphostin c預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞能顯著抑制LPS誘導(dǎo)VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)論：LPS可能通過(guò)PKC信號(hào)通路而誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào)。 【關(guān)鍵詞】 脂多糖 蛋白激酶C 肺血管內(nèi)皮細(xì)胞 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子Abstract Objective: To investigate whether lipopolysacchride（LPS）-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was mediated by protein kinase C（PKC）. Methods

3、: The rat pulmonary microvascular endothelial cells (RPMVECs) were challenged with LPS before PKC inhibitor(calphostin c) or vehicle, the levels of VEGF mRNA were assayed by RT- PCR, and the levels of VEGF protein were assayed by Western Blot. Results: LPS induced VEGF expression at time and dose de

4、pendent manner in RPMVEC. Pretreatment of these cells with the PKC inhibitor(calphostin c) markedly inhibited the LPS-induced VEGF expression. Conclusion: LPS may induce VEGF expression in RPMVEC mediated in part by PKC signal pathway.2 / 14Key words Lipopolysaccharide; Protein kinase C; Pulmonary m

5、icrovascular endothelial cell ; Vascular endothelial growth factor血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell, VEC)處在血液與血管平滑肌細(xì)胞之間,能分泌多種生理活性物質(zhì),調(diào)節(jié)血管功能，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 即為其中之一。VEGF 具有促進(jìn)VEC分裂、誘發(fā)新血管形成及增加血管通透性的作用1,2。本文以培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型, 以細(xì)菌脂多糖(lipopolysacchride, LPS) 為誘導(dǎo)因素,從VEGF和蛋白激

6、酶C（protein kinase c, PKC）著手，以闡明其發(fā)生機(jī)制。1 材料和方法1.1 材料 LPS（Escherichia coli,0111:B4), calphostin C均購(gòu)自Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基和Trizol 試劑購(gòu)自Gibco BRL公司，小牛血清購(gòu)自Hyclone公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司，VEGF多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，ECL Western 檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Cell Signal公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas MBI公司。1.2 方法1.2.1 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)和處理 大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離,培養(yǎng)參照

7、Chen等的方法3，將新生1 d的SD仔鼠處死，乙醇浸泡消毒5 min，取出肺組織用PBS沖洗，將肺的周邊切割成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，用吸管將組織塊均勻放置在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，間距約1 cm。加入含10胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，放入37 、含5CO2、濕度為95100的孵箱內(nèi)，靜置培養(yǎng)60 h后去除組織塊。34 d更換1次培養(yǎng)液。第12周8090細(xì)胞單層匯合時(shí)，用0.5%胰蛋白酶消化后按13傳代。實(shí)驗(yàn)用25代細(xì)胞。相差顯微鏡下，細(xì)胞呈典型的鋪路石狀排列，采用CD31抗原間接免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)

8、24 h。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為：(1)正常對(duì)照組和用不同濃度LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞24 h，分別測(cè)定VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)；(2)正常對(duì)照組和100 ng/ml LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞6 h、12 h、24 h、36 h和48 h，分別測(cè)定VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)；(3)正常對(duì)照組和用終濃度分別為0.011 mol/L的calphostin c預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞30 min后，用LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞24 h，分別測(cè)定VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)。1.2.2 RT-PCR 應(yīng)用Trizol Reagent從各組內(nèi)皮細(xì)胞中提取總RNA。以O(shè)ligo (dT) 為引物,遵循RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成d

9、scDNA。根據(jù)VEGF(Genebank: AF062644)基因序列,用primer premier軟件設(shè)計(jì)的PCR 反應(yīng)體系中的上下游引物,分別為：上游引物為:5'- CACATAGGAGAGATGAGCTTC-3下游引物為:5'-TCGTCACCGTCGACAGAACAG -3擴(kuò)增產(chǎn)物400 bp, GAPDH上下游引物分別為：上游引物為:5'-GAAACTACCTTCAAC TCCATC-3'下游引物為:5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'擴(kuò)增產(chǎn)物250 bp，以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物dscDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為

10、:94 變性30 s，55 退火1 min，72 延伸1 min，共25 循環(huán)，最后于72 繼續(xù)保溫5 min，反應(yīng)產(chǎn)物以1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。反應(yīng)結(jié)束后,取PCR 反應(yīng)液(10 l) 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀上觀察結(jié)果。1.2.3 Western Blot 細(xì)胞培養(yǎng)至相應(yīng)的時(shí)間后棄去培養(yǎng)液提取蛋白并用改良Lowry法進(jìn)行蛋白定量，從相應(yīng)蛋白樣品中取等量的蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，在5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h。隨后以抗VEGF(11000稀釋)孵育過(guò)夜。1×PBST洗滌3次后加入相應(yīng)的二抗孵育2 h。洗滌后以ECL檢測(cè)，通過(guò)X

11、膠片感光而獲得蛋白信號(hào)。-actin作為內(nèi)參。2 結(jié) 果2.1 LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)2.1.1 LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的劑量依賴性不同劑量LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，隨著LPS劑量的升高，VEGF mRNA表達(dá)的相對(duì)量亦逐漸升高（圖1A）。10、100、1000 ng/ml LPS處理組VEGF mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組。VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)變化與mRNA表達(dá)變化相一致，LPS上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴關(guān)系（圖1B）。2.1.2 LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的時(shí)間依賴性100 ng/ml LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，VEGF mRNA表達(dá)相對(duì)量逐漸升高，LPS 24 h處理

12、組VEGF mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值（圖2A）；LPS 刺激36 h后VEGF mRNA表達(dá)相對(duì)值開(kāi)始下降。VEGF蛋白質(zhì)表達(dá)變化與mRNA表達(dá)變化相一致，LPS上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴關(guān)系（圖2B）。2.2 PKC參與LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá) 用0.011 mol/L calphostin C預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞，其以劑量依賴的方式抑制LPS所誘導(dǎo)的VEGF mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加，這提示LPS通過(guò)調(diào)節(jié)PKC信號(hào)通路而調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)增加（圖3）。3 討 論VEGF 是一種能與肝素結(jié)合的分子量為3446 kD 的多肽血管生長(zhǎng)因子。VEGF 是一高度特異的血管內(nèi)皮有絲分裂素,具有雙重功

13、能: (1) 增加微血管通透性,促進(jìn)血漿纖維蛋白外滲; (2) 通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞上兩個(gè)VEGF 受體Flt1 (fms 樣酪氨酸激酶) 和flk(胎肝激酶) 作用,直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞移位,有利于炎癥細(xì)胞向鄰近結(jié)締組織基質(zhì)擴(kuò)散,在炎癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用4,5。本文利用LPS為誘導(dǎo)劑來(lái)刺激PMVEC ,結(jié)果表明:正常PMVEC 僅有微量的VEGF的基礎(chǔ)表達(dá),LPS 的刺激能顯著促進(jìn)PMVEC 表達(dá)VEGF,呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴方式。提示可能是由于內(nèi)毒素致傷后,通過(guò)某種途徑或因素促進(jìn)了PMVEC VEGF的表達(dá),從而為血管通透性增加提供了物質(zhì)基礎(chǔ),也是PMN大量于肺內(nèi)扣押及肺組

14、織廣泛損傷的前提。對(duì)于LPS引起VEGF表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，Ramanathan等報(bào)道LPS介導(dǎo)VEGF的表達(dá)是NF-B依賴的。LPS通過(guò)與Toll樣受體（toll-like receptor 4,TLR-4）結(jié)合，激活TNF受體相關(guān)因子-6（tumor necrosis factor associated factor-6, TRAF-6）,TRAF-6又激活下游的NF-B誘導(dǎo)激酶（NF-B-inducing kinase，NIK），它們又激活I(lǐng)-B磷酸激酶，引起I-B磷酸化而降解，從而引起NF-B的轉(zhuǎn)核活化6。PKC是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可把細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，引起核反應(yīng)，在細(xì)胞的增殖

15、、分化和應(yīng)激的調(diào)控中起重要作用。已有研究表明PKC激動(dòng)劑佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）能顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)，而抑制PKC的活性能逆轉(zhuǎn)PMA所誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)7。PKC可能通過(guò)增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性上調(diào)VEGF的表達(dá)。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞PKC活化而調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性改變8，那么PKC是否參與了LPS誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)調(diào)控，文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，calphostin C可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RPMVEC VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)，這說(shuō)明LPS介導(dǎo)的VEGF的轉(zhuǎn)錄和翻譯至少可部分通過(guò)PKC途徑實(shí)現(xiàn)。C

16、alphostin C是非特異性PKC抑制劑，所以需進(jìn)一步研究LPS通過(guò)某個(gè)或幾個(gè)特異性PKC亞型發(fā)揮作用，這也揭示阻斷異常的PKC信號(hào)通路可能成為防治內(nèi)毒素休克時(shí)血管內(nèi)皮損傷的新途徑，PKC也可作為一個(gè)治療的分子靶點(diǎn)，來(lái)控制細(xì)菌感染所致敗血癥、感染性休克和多器官功能不全綜合征?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Gavard J, Patel V, Gutkind JS. Angiopoietin-1 prevents VEGF-induced endothelial permeability by sequestering Src through mDiaJ. Dev Cell, 2008,14(1):25

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