淀粉酶活力測定

1、淀粉酶活力的測定一、目的學習和掌握測定淀粉酶（包括- 淀粉酶和 - 淀粉酶）活力的原理和方法。二、原理淀粉是植物最主要的貯藏多糖， 也是人和動物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉經(jīng)淀粉酶作用后生成葡萄糖、 麥芽糖等小分子物質而被機體利用。 淀粉酶主要包括 - 淀粉酶和 - 淀粉酶兩種。 - 淀粉酶可隨機地作用于淀粉中的 -1,4- 糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。 - 淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進行水解，每次水解下一分子麥芽糖， 又被稱為糖化酶。 淀粉酶催化產(chǎn)生的這些還原糖能使3,5- 二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3- 氨基 -

2、5- 硝基水楊酸，其反應如下：淀粉酶活力的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。用標準濃度的麥芽糖溶液制作標準曲線，用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于幾乎所有植物中， 特別是萌發(fā)后的禾谷類種子， 淀粉酶活力最強，其中主要是 - 淀粉酶和 - 淀粉酶。兩種淀粉酶特性不同， - 淀粉酶不耐酸，在 pH3.6 以下迅速鈍化 。 - 淀粉酶不耐熱，在 70 15min 鈍化 。根據(jù)它們的這種特性， 在測定活力時鈍化其中之一， 就可測出另一種淀粉酶的活力。 本實驗采用加熱的方法鈍化 - 淀粉酶，測出 - 淀粉酶的活力。 在非鈍化條件

3、下測定淀粉酶總活力（ - 淀粉酶活力 +- 淀粉酶活力），再減去 - 淀粉酶的活力，就可求出 - 淀粉酶的活力。三、實驗材料、主要儀器和試劑1實驗材料萌發(fā)的小麥種子（芽長約1cm）2儀器（1）離心機 （2）離心管 （ 3）研缽 （4）電爐 （5）容量瓶：50mL× 1, 100mL× 1 （6）恒溫水浴 （7）20mL具塞刻度試管× 13 （ 8）試管架 （9）刻度吸管： 2mL×3, 1mL ×2, 10mL ×1 （ 10）分光光度計3試劑（均為分析純）（1）標準麥芽糖溶液（ 1mg/mL）：精確稱取 100mg麥芽糖，用蒸餾水溶

4、解并定容至 100mL。（2）3,5- 二硝基水楊酸試劑：精確稱取 3,5- 二硝基水楊酸 1g，溶于 20mL 2mol/L NaOH 溶液中，加入 50mL蒸餾水，再加入 30g 酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至 100mL。蓋緊瓶塞，勿使 CO2進入。若溶液混濁可過濾后使用。（3）0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液A 液：（ 0.1mol/L 檸檬酸）：稱取 C6H8O7·H2 O 21.01g ，用蒸餾水溶解并定容至 1L。B 液：（ 0.1mol/L 檸檬酸鈉）：稱取 Na3 C6H5 O7·2HO 29.41g ，用蒸餾水溶解并定容至 1L。取 A 液

5、 55mL與 B 液 145mL混勻，既為 0.1mol/LpH5.6 的檸檬酸緩沖液。（4）1%淀粉溶液：稱取 1g 淀粉溶于 100mL 0.1mol/L pH5.6 的檸檬酸緩沖液中。四、操作步驟1麥芽糖標準曲線的制作取 7 支干凈的具塞刻度試管，編號，按表1 加入試劑：管號試劑1234567麥芽糖標準液（ mL）00.20.61.01.41.82.0蒸餾水（ mL）2.01.81.41.00.60.20麥芽糖含量（ mg）00.20.61.01.41.82.03,5- 二硝基水楊酸（ mL）2.02.02.02.02.02.02.0搖勻，置沸水浴中煮沸 5min。取出后流水冷卻，加蒸餾

6、水定容至 20mL。以 1 號管作為空白調零點，在 540nm波長下比色測定光密度。以麥芽糖含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線。2淀粉酶液的制備稱取 1g 萌發(fā) 3 天的小麥種子（芽長約 1cm），置于研缽中，加入少量石英砂和 2mL蒸餾水，研磨勻漿。將勻漿倒入離心管中， 用 6mL蒸餾水分次將殘渣洗入離心管。提取液在室溫下放置提取 1520min，每隔數(shù)分鐘攪動 1 次，使其充分提取。然后在 3 000r/min 轉速下離心 10min，將上清液倒入 100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液，用于 - 淀粉酶活力測定。吸取上述淀粉酶原液 10mL，放入 50mL容

7、量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶總活力的測定。2 酶活力的測定：取6 支干凈的試管，編號，按表2 進行操作。酶活力測定取樣表操 作 項 目 - 淀粉酶活力測定 - 淀粉酶活力測定- 1- 2- 3-4-5-6淀粉酶原液（ mL）1.01.01.0000鈍化 - 淀粉酶置 70水浴 15min，冷卻淀粉酶稀釋液（ mL）0001.01.01.03,5- 二硝基水楊酸（mL）2.00 02.00. 0預保溫將各試管和淀粉溶液置于40恒溫水浴中保溫10min1%淀粉溶液（ mL）1.0 1.0 1.01.0 1.0 1.0保溫在 40恒溫水浴中準確保溫5min3,5-

8、二硝基水楊酸（ mL） 0 2.0 2.00 2.0 2.0將各試管搖勻，顯色后進行比色測定光密度，記錄測定結果，操作同標準曲線。五、結果計算計算 - 2、 - 3 光密度平均值與 - 1 光密度之差，在標準曲線上查出相應的麥芽糖含量（ mg），按下列公式計算 - 淀粉酶的活力。計算 - 2、 - 3 光密度平均值與 - 1 光密度之差，在標準曲線上查出相應的麥芽糖含量（ mg），按下式計算（）淀粉酶總活力。- 淀粉酶活力（）淀粉酶總活力- 淀粉酶活力六、附注（1）樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數(shù)可根據(jù)不同材料酶活性的大小而定。（2）為了確保酶促反應時間的準確性，在進行保溫這一步驟時，可以將

9、各試管每隔一定時間依次放入恒溫水浴，準確記錄時間，到達 5min 時取出試管，立即加入 3,5- 二硝基水楊酸以終止酶反應，以便盡量減小因各試管保溫時間不同而引起的誤差。同時恒溫水浴溫度變化應不超過± 0.5 。（3）如果條件允許，各實驗小組可采用不同材料，例如萌發(fā) 1d、 2d、3d、 4d 的小麥種子，比較測定結果，以了解萌發(fā)過程中這兩種淀粉酶活性的變化。七、思考題1為什么要將 - 1 、 - 2 、 - 3 號試管中的淀粉酶原液置 70水浴中保溫 15min？2為什么要將各試管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分別置于40水浴中保溫？參考答案1由于 - 淀粉酶不耐熱， 7015min 被鈍化，所以將此