細(xì)胞復(fù)蘇及細(xì)胞鑒別與計(jì)數(shù)

1、 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告細(xì)胞復(fù)蘇及細(xì)胞鑒別與計(jì)數(shù) 姓名： 學(xué)號(hào)： 班級(jí)： 專業(yè)： 同組成員： Part1、細(xì)胞復(fù)蘇一、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞復(fù)蘇是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。復(fù)蘇細(xì)胞原則：快溶。防止在融化過程中已融解水滲透入細(xì)胞導(dǎo)致的二次結(jié)晶對(duì)細(xì)胞形成損害。使培養(yǎng)物能快速通過對(duì)細(xì)胞有損害的50攝氏度區(qū)域，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)胞復(fù)蘇的基本方法三、實(shí)驗(yàn)器材（1）儀器  CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡、倒置顯微鏡，超凈臺(tái) （2）材料  培養(yǎng)瓶，試管，移液管，廢液缸

2、，75%酒精棉球，酒精燈，凍存的Hela人宮頸癌細(xì)胞，滴管（3）試劑  完全培養(yǎng)基（DMEM），小牛血清，雙抗四、實(shí)驗(yàn)步驟1、準(zhǔn)備一個(gè)茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯40的溫水。2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘內(nèi)融化。3、將凍存管放入離心管中800rpm離心10分鐘，取出凍存管拿入超凈臺(tái)中，75%酒精消毒管口，打開凍存管，棄上清。4、沉淀加1ml完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞使之均勻，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25ml培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加3ml新鮮培養(yǎng)基于干凈培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。5、另取90微升細(xì)胞懸液于1.5ml離心管中，再加入10微升0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色,取80µ

3、l細(xì)胞液鏡下觀察活力。6、再向上述培養(yǎng)瓶中加入4ml10%含F(xiàn)CS及雙抗的DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，顯微鏡下觀察。蓋上瓶蓋, 去倒置顯微鏡上觀察細(xì)胞形態(tài)。做好標(biāo)記。將瓶蓋適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。7、將用過的試劑儀器等擺回原處，將超凈臺(tái)打掃干凈，關(guān)閉照明燈及抽風(fēng)機(jī)。8、實(shí)驗(yàn)后數(shù)小時(shí)后去觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并拍攝照片。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果傳代后在顯微鏡下可看到細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，全部為單個(gè)的分散的細(xì)胞。復(fù)蘇后大部分細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，透明度大，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，沒有空泡,細(xì)胞形態(tài)完整。也存在少數(shù)顏色較暗的死細(xì)胞，無立體感，細(xì)胞通透性差，有顆粒狀物質(zhì)。 我們5小后對(duì)復(fù)蘇后的

4、人宮頸癌Hela細(xì)胞進(jìn)行拍照，可觀察到細(xì)胞復(fù)蘇效果較好，多數(shù)細(xì)胞處于開始貼壁狀態(tài)，細(xì)胞呈現(xiàn)扁平或梭型，透明度較好。仍有少數(shù)細(xì)胞成懸浮狀態(tài)，未貼壁 （凍存的人宮頸癌Hela細(xì)胞復(fù)蘇 倒置顯微鏡20×）Part2、細(xì)胞的計(jì)數(shù)與死細(xì)胞的鑒別一、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：血球計(jì)數(shù)板。 血球計(jì)數(shù)板：由一塊長(zhǎng)約7.5cm，寬3.5cm的厚玻璃制成。計(jì)數(shù)室的邊長(zhǎng)為1mm，中間平臺(tái)下陷0.1mm，蓋上蓋片后計(jì)數(shù)室的容積為 0.1mm3。所以，可根據(jù)在顯微鏡下觀察到的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中細(xì)胞的數(shù)量。 細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞壓格計(jì)上線不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右，如有少量?jī)蓚€(gè)以上細(xì)胞按一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，如超過10%說明消

5、化不充分。 通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性,細(xì)胞即可被認(rèn)為已經(jīng)死亡.臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)是檢測(cè)細(xì)胞膜完整性最常用的生物染色試劑.健康的正常細(xì)胞能夠排斥臺(tái)盼藍(lán),而死亡的細(xì)胞,膜的完整性喪失,通透性增加,細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色.依據(jù)此原理,細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后,可通過顯微鏡,直接鏡下計(jì)數(shù)或拍照后計(jì)數(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞存活率比較精確的定量分析.二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。2、學(xué)習(xí)死活細(xì)胞的鑒別方法三、實(shí)驗(yàn)器材（1）儀器 CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡、倒置顯微鏡，超凈臺(tái) （2）材料 培養(yǎng)瓶，試管，移液管，廢液缸，75%酒精棉球，酒精燈，凍存的Hela人宮頸 癌細(xì)胞，滴

6、管、血球計(jì)數(shù)板（3）試劑 完全培養(yǎng)基（DMEM），小牛血清，雙抗，臺(tái)盼藍(lán)染料四、實(shí)驗(yàn)步驟1、檢查記數(shù)板：在正式計(jì)數(shù)前，先用顯微鏡檢查記數(shù)板的計(jì)數(shù)室，看其是否沾有雜質(zhì)或干枯的菌體。若有污物，則需作以下幾步清洗：（1）、擦洗 用藥棉蘸取95%酒精，輕輕擦洗計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室。（2）、沖洗 用蒸餾水沖洗計(jì)數(shù)板，并用毛邊紙吸干其上的水分注意：勿用內(nèi)火焰來烤干，最后用擦鏡紙揩干凈。2、鏡檢：鏡檢清洗后的計(jì)數(shù)板，直至計(jì)數(shù)室無污物時(shí)，才可用于細(xì)胞的計(jì)數(shù)。3、加樣：先將蓋玻片安放在計(jì)數(shù)室上面，然后搖勻樣品取懸液，從蓋玻片邊緣滴加細(xì)胞懸液，連續(xù)23次，直至充滿計(jì)數(shù)板和蓋玻片間的空隙。4、計(jì)數(shù)： 將加好樣品

7、的記數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)的中央，然后按下列步驟操作：（1）找計(jì)數(shù)室：先在低倍顯微鏡下尋找計(jì)數(shù)板上的大方格網(wǎng)位置。尋找時(shí)顯微鏡的光圈要適當(dāng)縮小，使視野偏暗。然后順著大方格線，移動(dòng)計(jì)數(shù)板，使計(jì)數(shù)室位于視野中間。（2）轉(zhuǎn)高倍鏡：轉(zhuǎn)至高倍鏡后，適當(dāng)調(diào)節(jié)光度，使細(xì)胞和計(jì)數(shù)室線條均清晰為止。然后將計(jì)數(shù)室一角的中格移至視野中。（3）計(jì)數(shù)：計(jì)算計(jì)數(shù)板的四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者只計(jì)算左側(cè)和上方的，右和下的不計(jì)算在內(nèi)。5、清洗：計(jì)數(shù)完畢后，記數(shù)板先用95%酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然后吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們共取了16個(gè)計(jì)數(shù)室，體積均為0.1mm3。得到的細(xì)胞數(shù)量數(shù)據(jù)如下表所示。 第一組細(xì)

8、胞計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)數(shù)室細(xì)胞總數(shù)/個(gè)死細(xì)胞數(shù)/個(gè)125424233531318818417522519421628724715617821419第二組細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)數(shù)室細(xì)胞總數(shù)/個(gè)死細(xì)胞數(shù)/個(gè)118721221726323427419721515016616618717820818722兩組細(xì)胞計(jì)數(shù)總計(jì)細(xì)胞總數(shù)/個(gè)死細(xì)胞數(shù)/個(gè)總數(shù)3319347平均值27422 根據(jù)上表可得：細(xì)胞總數(shù)/ml = 274×104 ×10/9=3.04×106個(gè)/ml細(xì)胞活力(細(xì)胞總數(shù) - 藍(lán)色細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)X100% = 89.545%六、結(jié)果分析：觀察表格中的數(shù)據(jù)可得，本次實(shí)驗(yàn)我們小組

9、所復(fù)蘇細(xì)胞的細(xì)胞存活率為89.545%，細(xì)胞總數(shù)為3.04×106個(gè)/ml?？傮w而言每個(gè)計(jì)數(shù)室細(xì)胞總數(shù)相差不大，說明細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，整體而言細(xì)胞懸液較為均勻，提高了計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)時(shí)可能因鏡檢時(shí)間過長(zhǎng)、因鏡檢而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡數(shù)增多，導(dǎo)致得到的存活率偏小。七、思考題1、細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)注意的問題？ 細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)要求懸浮中細(xì)胞數(shù)目在50×104個(gè)/ml左右，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。 細(xì)胞壓格計(jì)上線不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右，如有少量?jī)蓚€(gè)以上細(xì)胞按一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。鏡下計(jì)數(shù)，有時(shí)偶爾有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明消化不充

10、分，細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)/10平方毫米或多于500個(gè)/10平方毫米時(shí)，均說明稀釋不當(dāng)，需重新置備細(xì)胞懸液，再重新記數(shù)。 在加樣時(shí)要搖勻樣品取懸液，從蓋玻片邊緣滴加細(xì)胞懸液，連續(xù)23次，直至充滿計(jì)數(shù)板和蓋玻片間的空隙。操作時(shí)注意蓋片下不能有氣泡，否則要重新計(jì)數(shù)。染色時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以免對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷。2、檢測(cè)細(xì)胞的死活還有哪些方法？(1)染色法亞甲基藍(lán)溶液染色：亞甲基藍(lán)為活體染色劑，可以讓活細(xì)胞染色,死細(xì)胞不能染色?；罴?xì)胞被染為深藍(lán)色的部分是（細(xì)胞核）亞甲基藍(lán)可以結(jié)合核酸，使細(xì)胞核呈藍(lán)色。中性紅染色：中性紅是液泡系的專有染料，也是一種低毒性染料，可以使活細(xì)胞液泡著紅色，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不被著色；死細(xì)胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個(gè)細(xì)胞中，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被染成紅色。(2)儀器分析法：可采用微電極技術(shù)（利用死活細(xì)胞膜兩側(cè)電位的差異）、全自動(dòng)分析細(xì)胞記數(shù)儀和流式細(xì)胞儀等，可對(duì)細(xì)胞的死活進(jìn)行精確的批量檢測(cè)。流式細(xì)胞儀法用來判斷細(xì)胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)出熒光的物質(zhì)，例如