甲胎蛋白基因在轉錄水平上的檢測

1、 檢測甲胎蛋白基因在轉檢測甲胎蛋白基因在轉錄水平上的的表達情況錄水平上的的表達情況 討論的題目 甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) (GenBank 登錄號: NM_001134.1)的異常表達與肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤有關，請根據(jù)基因表達的檢測方法，設計實驗方案從轉錄水平檢測AFP的表達情況。實驗方案包括：實驗目的、實驗方法及原理、技術路線、可能的結果分析及應用等。 1、掌握Northern印跡雜交和RTPCR技術的方法2、了解實驗的操作方法和步驟3、判斷基因在轉錄水平的表達情況甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)甲胎蛋白是腫瘤相關的胚胎特異-球蛋白

2、,分子量約為70kDa，是一直以來都被認為是臨床診斷胎兒出生缺陷和肝細胞癌的經(jīng)典腫瘤標志物。正常情況下這種存在于胚胎早期血清中的甲胎蛋白在出生后就迅速消失，如果重現(xiàn)于成人血清中則提示有肝癌的可能。 AFP基因的DNA結構 AFP基因約為20kbp大小,由15個內含子和14個外顯子組成,包含590個氨基酸,其中在N末端有19個氨基酸是信號肽序列。實驗方法 1、 Northern印記雜交 2、核糖核酸酶保護試驗 3、原位雜交 4、RTPCR技術 5、實時熒光定量PCRNorthern印跡雜交實驗原理 Northern印跡雜交是指將RNA變性及電泳分離后，將其轉移到固相支持物上，然后利用雜交反應來鑒

3、定其中特定mRNA 分子的含量及其大小的過程。RNA印跡技術正好與DNA相對應，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為Western blot。實驗技術路線1、提取mRNA2、瓊脂糖凝膠電泳分離RNA3、Northern印跡轉移前的凝膠預處理4、Northern印跡轉移5、用標記的RNA探針與轉移到固相支持物上的核酸片段進行雜交6、雜交結果的顯示結果分析 1、若出現(xiàn)明顯雜交帶，則表明細胞組織內有AFP基因的表達，則會有患肝癌的風險。2、若沒有出現(xiàn)明顯雜交帶，則表明細胞組織內基因未表達。應用 Northern印記技術多用來檢查基因組中某個特定的基因是否得到轉錄以及

4、轉錄的相對水平。目前，Northern印記技術仍然被認為是檢測基因表達水平的金標準。RT-PCR技術實驗原理 逆轉錄PCR，是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板經(jīng)反轉錄酶或隨機引物的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段檢測基因表達。試驗技術路線 1、提取mRNA 2、反轉錄DNA鏈 3、PCR擴增 4、凝膠電泳 5、結果顯示反轉錄酶的選擇 1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶 2 禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶 3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉錄酶。 4MMLV反轉錄酶的RNase H突變體引物設計的原則 1、長度及堿基分布 2、引物之間及引物自身 3、引物3端 4、引物5端 5、二級結構區(qū) 6、簡并引物結果分析 1、若有AFP基因表達，則在與其反轉錄CDNA鏈分子量平行處應有檢測信號。 2、若AFP基因未表達，則在與其反轉錄CDNA鏈分子量平行處沒有檢測信號。應用 1、分析基因的表達 2、獲取目的基因 3、合成CDNA探針 Northern印跡雜交與PCR方法的比較 Northern印跡雜交技術檢測mRNA表達水平的敏感性較PCR技術低，但其特異性強，假