酶分離純化的評(píng)價(jià)PPT精選文檔

1、1第二章第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化酶的生產(chǎn)與分離純化(2學(xué)時(shí)，共4學(xué)時(shí))2主要內(nèi)容主要內(nèi)容w 酶分離、純化的評(píng)價(jià)w酶的劑型與保存w酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能34 酶分離、純化的評(píng)價(jià)酶分離、純化的評(píng)價(jià)w酶經(jīng)分離、純化后要確定該純化步驟是否適宜，必須經(jīng)過(guò)對(duì)有關(guān)參數(shù)的測(cè)定及計(jì)算才能確定。酶的產(chǎn)量是以活力單位表示，因此在整個(gè)分離過(guò)程中每一步始終貫穿比活力和總活力的檢測(cè)、比較。4基本概念基本概念1w酶活力(Enzyme activity)：酶活力是指酶催化反應(yīng)的能力，它表示樣品中酶的含量。w1961年國(guó)際酶學(xué)會(huì)規(guī)定：l min催化lmol分子底物轉(zhuǎn)化的酶量為該酶的一個(gè)活力單位 ( 國(guó)際單位 ) ，溫度為25

2、 ，其它條件 (pH、離子強(qiáng)度) 采用最適條件。重要5w酶的總活力為樣品的全部酶活力。 總活力 = 酶活力 總體積 (mL) 或 = 酶活力 總質(zhì)量 (g)6w比活力比活力 (Specific activity) ：比活力是指單位蛋白質(zhì) (毫克蛋白質(zhì)或毫克蛋白氮) 所含有的酶活力 (單位/毫克蛋白) 。w比活力是酶純度指標(biāo)，比活力愈高表示酶愈純，即表示單位蛋白質(zhì)中酶催化反應(yīng)的能力愈大。w但是，比活力仍然是個(gè)相對(duì)酶純度指標(biāo)。要了解酶的實(shí)際純度，尚需采用電泳等測(cè)定方法。7 w回收率回收率 (Yield percent) ：回收率是指提純前與提純后酶的總活力之比。它表示提純過(guò)程中酶的損失程度，回收率

3、愈高，其損失愈少。 w提純倍數(shù)提純倍數(shù)：提純倍數(shù)是指提純前后兩者比活力之比。它表示提純過(guò)程中酶純度提高的程度，提純倍數(shù)愈大，提純效果愈佳。8酶純化評(píng)價(jià)實(shí)例酶純化評(píng)價(jià)實(shí)例 95 酶的劑型與保存酶的劑型與保存w酶制劑通常有下列四種劑型：n液體酶制劑n固體粗酶制劑n純酶制劑n固定化酶制劑（見書中第五章）105.1 液體酶制劑液體酶制劑 w包括稀酶液和濃縮酶液。一般除去固體雜質(zhì)后，不再純化而直接制成，或加以濃縮而成，一般需要加穩(wěn)定劑。這種酶制劑不穩(wěn)定，且成分復(fù)雜，只用于某些工業(yè)生產(chǎn)。115.2 固體粗酶制劑固體粗酶制劑 w發(fā)酵液經(jīng)殺菌后直接濃縮或噴霧干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工業(yè)生產(chǎn)。有的經(jīng)

4、初步純化后制成，如用于洗滌劑、藥物生產(chǎn)。用于加工或生產(chǎn)某種產(chǎn)品時(shí)，務(wù)須除去起干擾作用的雜酶，才不會(huì)影響質(zhì)量。固體酶制劑適于運(yùn)輸和短期保存，成本也不高。125.3 純酶制劑純酶制劑 w包括結(jié)晶酶，通常用作分析試劑和醫(yī)療藥物。要求較高的純度和一定的活力單位數(shù)。用作分析工具酶時(shí)，除了要求沒有干擾作用的雜酶存在外，還要求單位質(zhì)量的酶制劑中酶活力達(dá)到一定的單位數(shù)。用作基因工程的工具酶要求不含非專一性的核酸酶，或完全不含核酸酶， 13酶的保存方法酶的保存方法w(1) 溫度。w(2) pH與緩沖液。 w(5) 為提高酶穩(wěn)定性，常加入下列穩(wěn)定劑：n 底物、抑制劑和輔酶，它們的作用可能是通過(guò)降低局部的能級(jí)水平，

5、使酶蛋白處于不穩(wěn)定狀態(tài)的扭曲部分轉(zhuǎn)入穩(wěn)定狀態(tài)。n 對(duì)巰基酶，可加入SH保護(hù)劑。如二巰基乙醇、GSH(谷胱甘肽)、DTT(二硫蘇糖醇)等。n 其他如Ca2+能保護(hù)淀粉酶，Mn2+能穩(wěn)定溶菌酶，Cl能穩(wěn)定透明質(zhì)酸酶。(3) 酶蛋白濃度。(4) 氧。146 酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能156.1 酶分子組成酶分子組成1. 酶蛋白酶蛋白雖然少數(shù)有催化活性的RNA分子已經(jīng)鑒定，但幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)。酶蛋白有三種組成形式：?jiǎn)误w酶，僅有一個(gè)活性部位的多肽鏈構(gòu)成的酶分子質(zhì)量為1335 k Dalton，為數(shù)不多，且都是水解酶；寡聚酶，由若干相同或不同亞基結(jié)合而組成的酶，亞基一般無(wú)活性，必須

6、相互結(jié)合才有活性，分子質(zhì)量為35 k Dalton以上到數(shù)百萬(wàn)單位；多酶復(fù)合體，指多種酶進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)的體系。前一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物為后一反應(yīng)的底物。162. 輔基或輔酶輔基或輔酶僅有少部分酶是由單一蛋白質(zhì)所組成，而大部分酶則為復(fù)合蛋白質(zhì)，或稱全酶，是由蛋白質(zhì)部分(酶蛋白)和非蛋白質(zhì)部分所組成，即酶蛋白本身無(wú)活性，需要在輔因子(Cofactor)存在下才有活性。有機(jī)輔因子可依其與酶蛋白結(jié)合的程度分為輔酶(Prosthetic enzyme)和輔基(Prosthetic group)。17（1）鐵）鐵卟啉卟啉w鐵卟啉是細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等氧化酶的輔基。w氧化酶的鐵卟啉的功能在于靠鐵的價(jià)

7、電子變化（Fe2+Fe3+）來(lái)傳遞電子，催化氧化還原反應(yīng)。SCHH3CCH3HCNH3CCHNCH2CH2COOHCH3HOOCH2CH2CNFe2+CHSCH3CHCH3NCH組苯丙賴蘇精半胱谷亮半胱 蘇賴谷圖 3-1 鐵卟啉與酶蛋白的連結(jié)方式18（2）黃素核苷酸黃素核苷酸 (FMN和和FAD等等)w黃素核苷酸為維生素B12 (核黃素) 的衍生物，為黃素酶類 (如氨基酸氧化酶、琥珀酸脫氫酶等) 的輔基。NNNHNH3CH3COOOH OHOOCH2-(CHOH)3-CH2O-P-O-P-O- CH2OHOOHNNNNNH2FMNFAD圖 3-2 FMN與FAD的分子結(jié)構(gòu)19w在酶的催化作用下

8、，F(xiàn)MN和FAD的功能是傳遞氫(傳遞質(zhì)子和電子2H2H+2e)，亦稱氫載體而自成氧化還原體系，反應(yīng)主要表現(xiàn)在6,7二甲基異咯嗪基團(tuán)中的第1位及第10位N原子的脫氫與加氫。其反應(yīng)式如圖33。7 NNNHNH3CH3COOR1234910568+2H-2HNHNNHHNH3CH3COOR圖 3-3 FMN與FAD的氧化 - 還原體系氧化型(FMN或FAD)還原型FAD. H2）(FMN. H2 或20（3）煙酰胺核苷酸煙酰胺核苷酸(NAD及及NADP)w煙酰胺核苷酸是許多脫氫酶 (如異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等) 的輔酶。主要有兩種：煙酰胺腺膘呤二核苷酸 (NAD、輔酶) 和煙酸胺腺

9、膘呤二核苷酸磷酸 (NADP、輔酶)。OOHNNNNNH2OOHCH2OPOOHOPOOO-H2COHN+CONH2OOHNNNNNH2OOHCH2OPOOHOPOOO-H2COHN+OPO3H2OHCONH2NADNADP圖 3-4 NAD與NADP的分子結(jié)構(gòu)21wNAD及NADP在脫氫酶催化過(guò)程中參予傳遞氫的作用，其氧化還原作用體現(xiàn)在煙酰胺環(huán)的第4位碳原子上的加氫或脫氫。在中性環(huán)境中其氧化還原的反應(yīng)式如圖35。N+CONH2RH4NCONH2RH4H+ H+2H-2H氧化型還原型或：NAD(P)+2H-2HNAD(P)H+ H+圖 3-5 NAD及NADP傳遞氫過(guò)程22（4）硫辛酸硫辛酸(

10、6，8 二硫辛酸二硫辛酸) w硫辛酸在生物體廣泛存在，呈黃色。它與酶蛋白呈牢固的結(jié)合狀態(tài)，水解后為自由態(tài)。存在氧化型和還原型兩種狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)式如下：CH2 HSCH2HCHS(CH2)4COOHCH2SCH2HCS(CH2)4COOH氧化型還原型+2H-2H當(dāng)兩者互相轉(zhuǎn)變時(shí)，起傳遞氫的作用。另外，在酮酸氧化脫羧反應(yīng)中，還起傳遞?；淖饔谩?3（5）泛醌泛醌 (輔酶輔酶Q，簡(jiǎn)寫為，簡(jiǎn)寫為UQ) w泛醌是生物體中廣泛存在的一種醌類衍生物。它是呼吸鏈上的一個(gè)組成成分，其功能是傳遞氫和電子，在氧化磷酸化作用中起重要作用。其結(jié)構(gòu)式為：OOH3COH3COCH3(CH2CHCCH3CH2)nH24（6）輔

11、酶）輔酶A (CoA) w輔酶A在脂肪代謝中極為重要，其分子結(jié)構(gòu)中含有維生素B族的泛酸部分，此外，尚含有腺嘌呤核苷酸和氨基乙硫醇部分。OONNNNNH2H2COHPOOHOPOOHOOPHOOOHCH2CCH3CH3COHHCONHCH2CH2CONHCH2SH輔酶A圖 3-6 輔酶A的結(jié)構(gòu)式25輔酶A也可寫為CoASH。CoASH通過(guò)其巰基 (SH) 的受?；c脫?；?，參與轉(zhuǎn)?；饔茫浞磻?yīng)式為：CH3C-AOHAH-酶CH3C酶OCH3C酶OCH3C酶OCH3CSCoAOCoASHB上式A為?；墓w；B為?；氖荏w。乙酰輔酶A(CH3COSCoA)的硫酯鍵為一種高能鍵，當(dāng)脫?；鶗r(shí)可放出大

12、量的自由能，供給合成反應(yīng)的需要，在酰化時(shí)則需要能量，因此，在?；c脫酰過(guò)程中有能量的轉(zhuǎn)移。脂肪酸的分解與合成也必須在酯酰輔酶A的參與下才能進(jìn)行，所以，輔酶A在脂肪代謝上非常重要。26w磷磷酸腺苷及其它核苷酸類酸腺苷及其它核苷酸類 在代謝過(guò)程中起著重要作用，它們是許多轉(zhuǎn)磷酸基酶 (如磷酸激酶) 的輔酶。w焦磷酸硫胺素焦磷酸硫胺素(TPP) 酮酸脫羧酶和糖類的轉(zhuǎn)酮酶(催化自酮糖上轉(zhuǎn)2單位至醛糖上去的酶)的輔酶。w磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺 氨基酸的轉(zhuǎn)氨酶、消旋酶和脫羧酶的輔酶，磷酸吡哆胺與轉(zhuǎn)氨作用有關(guān)。w生物素生物素(維生素維生素H) 羧化酶的輔基，屬于維生素族，它與酶蛋白結(jié)合后

13、可催化CO2的摻入與轉(zhuǎn)移。w四氫葉酸四氫葉酸(輔酶輔酶F，THFA) 甲?；喖谆纫惶蓟妮d體，能參與一碳化合物的代謝。w金屬金屬 除卟啉環(huán)含鐵或銅離子外，還有許多酶尚含有銅、鎂、鋅、鈷等金屬離子作為輔基，為酶的催化作用中不可缺少的組分。27基本概念基本概念 2w酶分子修飾：n通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程。如金屬離子交換法、 大分子修飾法n例如，Bender和Kosland成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。重要6.2 酶的結(jié)構(gòu)與功

14、能酶的結(jié)構(gòu)與功能28酶分子的修飾方法酶分子的修飾方法w化學(xué)法化學(xué)法又可分為：金屬離子置換法、大分子修飾法、肽鏈有限水解法、蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的小分子修飾法等。w生物法生物法是通過(guò)基因工程的手段改變蛋白質(zhì)，即基于核酸水平對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，利用基因操作技術(shù)對(duì)DNA或mRNA進(jìn)行改造和修飾以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更為合理的蛋白質(zhì)。w物理修飾法物理修飾法的特點(diǎn)是不改變酶的組成和基團(tuán)，酶分子的共價(jià)鍵不發(fā)生變化。重要29酶原：酶原：n酶是在活細(xì)胞中合成的，但不是所有新合成的酶都具有催化活力，這種新合成酶的前體 (無(wú)催化活力) 稱為酶原 (Proenzyme) 。n就生命現(xiàn)象而言，酶原是酶結(jié)構(gòu)一種潛在的存在形式，如果沒有

15、這種形式，生命就會(huì)停止。重要30酶酶 原原分子構(gòu)象發(fā)生改變分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心形成或暴露出酶的活性中心 一個(gè)或幾個(gè)特定的肽鍵斷裂，水解一個(gè)或幾個(gè)特定的肽鍵斷裂，水解掉一個(gè)或幾個(gè)短肽掉一個(gè)或幾個(gè)短肽在特定條件下在特定條件下 酶原激活的機(jī)理酶原激活的機(jī)理31w例如，哺乳動(dòng)物的胰臟分泌到消化系繞中的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原，每種酶原都是由二硫鍵交聯(lián)的單一多肽鏈組成，它們?cè)诘竭_(dá)十二指腸以前，一直是十分穩(wěn)定的，而到達(dá)十二指腸后則被另一種蛋白質(zhì)水解酶所活化，這種活化過(guò)程是從無(wú)活力酶原轉(zhuǎn)變成有活力酶的過(guò)程。該種酶原往往由該種酶所激活，稱為酶原的自我激活。3233w酶的多形性與同工酶n1

16、975年H. Harris提出酶的多形性概念，認(rèn)為很多酶可催化相同的反應(yīng)，但其結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)有所不同，這種現(xiàn)象稱為酶的多形性。根據(jù) 其 來(lái) 源 可 分 為 異 源 同 工 酶 和 同 工 酶 (Isoenzyme) ，前者是不同來(lái)源的同工酶.重要34n例如，酵母菌中醇脫氫酶和動(dòng)物肝臟中的醇脫氫酶，而后者是指來(lái)自同一生物體同一生活細(xì)胞的酶，能催化同一反應(yīng)，但由于結(jié)構(gòu)基因不同，因而酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)以及其它性質(zhì)有所差別，稱為同工酶。測(cè)定同工酶最常用的方法是電泳法，此法對(duì)樣品純度要求不嚴(yán)格，分辨力強(qiáng)，而且簡(jiǎn)便快速。35n例如天冬氨酸激酶 (AK) 有三種同工酶：AK1、AK2、AK3，磷酸葡萄