仁康醫(yī)院檢驗科微生物操作

1、武岡市展輝醫(yī)院 微生物檢驗標準操作程序 展輝醫(yī)院檢驗科 微生物檢驗操作程序（SOP）（第一版）制作人： 劉新平啟用日期：2011年5月28日 目 錄微生物室工作崗位職責4微生物檢驗室內(nèi)質(zhì)控操作程序（SOP）4微生物室標本接收程序（SOP）8微生物室標本接種程序（SOP）9病原微生物污染處理程序（SOP）10血液及骨髓培養(yǎng)標準操作程序（SOP）11痰（咽拭）培養(yǎng)標準操作程序（SOP）12尿液培養(yǎng)標準操作程序（SOP）13膽汁培養(yǎng)標準操作程序（SOP）14腦脊液培養(yǎng)標準操作程序（SOP）15膿液及傷口分泌物培養(yǎng)標準操作程序（SOP）16糞便培養(yǎng)標準操作程序（SOP）17穿剌液培養(yǎng)標準操作程序（SO

2、P）19生殖系統(tǒng)細菌培養(yǎng)程序（SOP）20細菌常規(guī)鑒定程序（SOP）21細菌涂片染色程序（SOP）28革蘭陽性球菌的鑒定30 葡萄球菌屬的鑒定30 微球菌屬的鑒定32 鏈球菌屬的鑒定32 腸球菌屬的鑒定33 氣球菌屬的鑒定34革蘭陰性球菌的鑒定35奈瑟菌屬細菌的鑒定35韋榮球菌屬細菌鑒定35革蘭陽性桿菌的鑒定36 李斯特菌屬與丹毒絲菌屬的鑒定36棒狀桿菌屬的鑒定36諾卡菌屬的鑒定37 紅球菌屬的鑒定38芽胞桿菌屬的鑒定38腸桿菌科的細菌鑒定38弧菌屬的鑒定39氣單胞菌屬的鑒定40不動桿菌屬的鑒定40莫拉菌屬的鑒定41金黃桿菌屬的鑒定41假單胞菌屬的鑒定41嗜血桿菌屬的鑒定42放線桿菌屬的鑒定4

3、2產(chǎn)堿桿菌屬的鑒定43布魯菌屬的鑒定43軍團菌屬的鑒定43彎曲桿菌科細菌的鑒定43消化球菌屬和消化鏈球菌屬的鑒定44擬桿菌屬及梭桿菌屬的鑒定44厭氧無芽胞革蘭陽性桿菌的鑒定44梭狀芽胞桿菌屬的鑒定45臨床真菌的檢驗及鑒定46 毛癬菌屬的鑒定46小孢子菌屬的鑒定46 念珠菌屬的鑒定47隱球菌屬的鑒定47曲霉菌屬的鑒定48毛霉屬和根霉菌屬的鑒定48鐮孢霉屬的鑒定48馬爾尼菲青霉菌的鑒定48莢膜組織胞漿菌的鑒定49申克孢子絲菌的鑒定49微生物藥敏試驗程序49藥敏質(zhì)控程序51醫(yī)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測53空氣含菌量的監(jiān)測53工作人員手細菌監(jiān)測54物體表面細菌的監(jiān)測54消毒劑的監(jiān)測55無菌物品的監(jiān)測55血液培養(yǎng)

4、儀BacT/ALERT 3D Select操作程序 56ATBTM接種操作程序56微生物鑒定/藥敏鑒定ATBTM操作57微生物室工作崗位職責1、負責全院臨床各科細菌檢驗標本的驗收，各種微生物檢測；細菌培養(yǎng)手工和上機分析鑒定及藥敏試驗；支原體和衣原體檢測；院感監(jiān)測及其室內(nèi)室間質(zhì)控工作等。各項操作嚴格按照標準化操作程序（SOP）進行。2、每天檢查細菌自動分析儀工作是否正常；觀察培養(yǎng)箱溫度、室內(nèi)濕度、冰箱溫度是否符合要求，并做好記錄。查看培養(yǎng)基、各種生化管、試劑、藥敏紙片、染色液等是否滿足檢測要求，并及時更新或配制。3、檢查細菌培養(yǎng)申請單及原始登記本，確定標本接種是否正確。觀察培養(yǎng)基、血液增菌培養(yǎng)瓶

5、生長狀況，如發(fā)現(xiàn)有細菌生長立即進行移種，并涂片革蘭染色，將細菌的染色特性及形態(tài)做好記錄，及時通知臨床醫(yī)生。4、檢測分析細菌，挑取可疑菌落涂片革蘭染色鏡檢，將菌落純分于血平板，做生化鑒定和藥敏試驗或上機分析鑒定，并及時發(fā)放檢驗結(jié)果報告。5、做好菌種的保存，對一些難得的菌株、標準菌株等要定期移種，一般一月一次，低溫保存；做好移種記錄，并做好生物安全防護。6、定期做好所用藥敏紙片的質(zhì)控，每周一次并有記錄；3-6個月畫一次質(zhì)控圖并有分析；對檢驗樣本的數(shù)量、樣本的陽性率、各種細菌的耐藥性、各類細菌檢出構(gòu)成的百分比進行統(tǒng)計，并打印成文統(tǒng)一保存。7、經(jīng)常保持室內(nèi)的清潔衛(wèi)生，生活垃圾與醫(yī)療垃圾要分裝處理；每天

6、下班對室內(nèi)空氣進行消毒處理；生物安全防護嚴格執(zhí)行醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露防護制度。微生物檢驗室內(nèi)質(zhì)控操作程序（sop）一、目的：規(guī)范微生物檢驗及室內(nèi)質(zhì)量控制，保證細菌檢測及藥敏結(jié)果的可靠性。二、程序的更改：該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出，并報請專業(yè)組長及科主任批準簽字后生效。三、控制方法(一)對實驗室人員的要求每個實驗室的技術(shù)人員數(shù)要充足，且要具備良好的職業(yè)道德。凡參加細菌檢驗的技術(shù)人員，要有一定的理論知識和實踐能力水平。要有廣泛的基礎(chǔ)訓(xùn)練教育，而且要在一位有經(jīng)驗的微生物學(xué)家的監(jiān)督下，進行實際工作的嚴格訓(xùn)練，對新工作人員，除教會基本原理和操作外，還應(yīng)對其進行職業(yè)道德教育。(

7、二)實驗室操作手冊制定微生物檢驗室標準化操作程序的手冊，內(nèi)容要全面，文字應(yīng)簡練，間隔一定時間要進行修改、刪舊補新。操作手冊一般包括以下內(nèi)容：實驗室的規(guī)章制度：包括各級人員職責、權(quán)限及各項有效的制度，如標本的接收、報告的發(fā)送、交接班、輪換、消毒隔離及安全制度等。樣品采集、運送與處理；細菌檢驗流程及檢測工具；檢驗方法與質(zhì)控方法 ( 細菌分離、培養(yǎng)、鑒定與藥物敏感試驗 )；試劑和培養(yǎng)基質(zhì)量控制；儀器操作手冊；報告方式；臨床意義及參考數(shù)據(jù)；實驗室安全。(三)儀器設(shè)備的質(zhì)控 1、高壓滅菌器及干熱滅菌器：使用滅菌器應(yīng)遵守儀器操作規(guī)程。物品滅菌時，應(yīng)同時放入監(jiān)控指標。生物指標應(yīng)用嗜熱脂肪芽胞桿菌懸液，裝入試

8、管或安培瓶，也可用紙帶?；瘜W(xué)指標用對熱敏感的染料標記的變色帶子。滅菌時，將試管或安培瓶、紙條或變色帶等夾放在試驗包裹中，以監(jiān)視滅菌效果。對大型滅菌器，監(jiān)視指標應(yīng)放在不同位置。2、培養(yǎng)箱、水浴箱及冰箱：溫度要求：培養(yǎng)箱35±1；水浴箱37±0.5；冰箱4±2，冰格5±1；低溫冰箱20±2；超低溫冰箱80±10。溫度記錄：每天在工作開始和結(jié)束時記錄溫度，這類儀器要放入最高、最低溫度計監(jiān)視。3、二氧化碳培養(yǎng)箱：二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)的CO2含量控制在510之間。4、厭氧缸及厭氧培養(yǎng)箱：工作時應(yīng)保證絕對無氧，在使用時應(yīng)用化學(xué)和生物學(xué)兩種指標進行監(jiān)視

9、?；瘜W(xué)指標用美藍或刃天青，無氧時均為無色；生物學(xué)指標用諾維氏芽胞梭菌，如厭氧裝置有隙縫時，該細菌即不生長。鈀粒應(yīng)新鮮并具有活性，用過鈀粒通過加熱1601.52小時，重新活化后使用。5、生物安全箱處理：對含有分枝桿菌和致病性真菌的標本，或培養(yǎng)物是需要的。穿過通風櫥表面的氣流，不應(yīng)小于30.38M/分，用于消除櫥內(nèi)污染的紫外線燈及濾過裝置，必須每隔3個月校正其性能一次，不合格者應(yīng)調(diào)換。6、接種環(huán)要求長58cm，環(huán)直徑約3mm；尿定量接種環(huán)，應(yīng)定期檢驗其容量是否準確，否則應(yīng)予校準；接種針長58cm。臨床微生物實驗室常用儀器設(shè)備的質(zhì)量控制標準見下表。表1 常用儀器設(shè)備的質(zhì)量控制儀器設(shè)備名稱控制標準允許

10、范圍監(jiān)控方法和頻率光學(xué)顯微鏡每年 4 次或需要時，作清潔與調(diào)試培養(yǎng)箱35 ± 1 每天觀察記錄溫度二氧化碳培養(yǎng)菌每天觀察記錄溫度和溫度35 ± 1 二氧化碳濃度氣體5%-10%<10%冰箱每天觀察記錄溫度冷藏室4 ± 2 冷凍室-5 ± 1 低溫冰箱-20 ± 2每天觀察記錄溫度壓力蒸汽滅菌器 121 121 使用時觀察并記錄溫度、壓力，每周用嗜熱芽孢菌或每次用化學(xué)方法測試滅菌效果 隨著醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)科的不斷發(fā)展，許多自動化儀器和微量生化反應(yīng)系統(tǒng)相繼進入微生物實驗室。給細菌和真菌的培養(yǎng)、鑒定與藥敏試驗，帶來快速準確的結(jié)果。對于這些儀器設(shè)備的質(zhì)

11、量控制，可根據(jù)廠商說明書推薦的方法去做，確保測試系統(tǒng)的靈敏度和精密度。(四)培養(yǎng)基的質(zhì)控實驗室每一次制備的培養(yǎng)基作為一批，標明批號；商品培養(yǎng)基則以同一時間內(nèi)生產(chǎn)的，相同批號作為一批。如果同一批號不在同一個月內(nèi)使用，則培養(yǎng)基應(yīng)重新用標準菌株進行考核。因此，必須對培養(yǎng)基作以下三方面質(zhì)控。 1、一般性狀 培養(yǎng)基一般性狀包括外觀、厚度、 pH 值等。剛配制的液體培養(yǎng)基，其外觀應(yīng)透明、清亮、無混濁、無沉淀，顏色符合要求。新鮮的固體培養(yǎng)基應(yīng)具有特定的顏色，表面濕潤但無水汽、平整、光潔無凹坑和氣泡。整塊平板厚薄均勻，一般厚度在3mm ，但 MH 平板的厚度不得小于4mm 。斜面的長度不得超過試管長度的23

12、。應(yīng)經(jīng)常觀察貯存培養(yǎng)基的質(zhì)量是否合格。若試管內(nèi)液體培養(yǎng)基液面降低，表明水分蒸發(fā)，培養(yǎng)基濃縮。當固體培養(yǎng)基發(fā)生顏色改變，表面干燥，出現(xiàn)裂紋或邊緣的瓊脂與平板或試管分離時，應(yīng)不再使用。培養(yǎng)基的pH 是細菌生長的重要條件之一，一般而言合格培養(yǎng)基的 pH 應(yīng)在規(guī)定值上下 0.2 的范圍之內(nèi)。 2、無菌試驗 新制備的培養(yǎng)基，要按批號隨機抽取一定數(shù)量的樣品作無菌試驗。對于壓力蒸氣滅菌后傾注的固體培養(yǎng)基，抽樣后放35 ± 1 溫箱培養(yǎng) 24-48h ；滅菌后經(jīng)無菌操作分裝的液體培養(yǎng)基，要全部放入35 ± 1 溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h ；對有些無需高壓滅菌，只需煮沸消毒的選擇性培養(yǎng)基要取部分瓊脂，

13、放入無菌肉湯管培養(yǎng)24h；上述試驗證實無細菌生長時才算合格。若有細菌生長，說明培養(yǎng)基制備過程中已受雜菌污染，除了尋找原因外，應(yīng)不再使用。 3、細菌生長試驗 所有的培養(yǎng)基在使用前除了做無菌試驗外，還必須做細菌生長試驗以測定培養(yǎng)基性能是否符合要求。要用已知的標準菌株，按照 NCCLS 推薦的方法作質(zhì)控。質(zhì)控所需的標準菌株分2 種：一種是已知的可在某種培養(yǎng)基上生長，并產(chǎn)生典型生物學(xué)性狀的，對培養(yǎng)基中的某種物質(zhì)產(chǎn)生陽性反應(yīng)的菌株；另一種是用已知的不能在某種培養(yǎng)基上生長，或?qū)ε囵B(yǎng)基中的某種物質(zhì)產(chǎn)生陰性生化反應(yīng)的菌株。表2 列出 10 種常用固體培養(yǎng)基的質(zhì)量鑒定標準及所需標準菌株。 無論是廠家的成品培養(yǎng)基

14、，還是實驗室自制的培養(yǎng)基，都應(yīng)經(jīng)過上述三方面的檢驗，才能證實其質(zhì)量是否合格。廠家應(yīng)將所做的試驗內(nèi)容，形成書面的質(zhì)量鑒定送交客戶保存。實驗室自行配制過程中應(yīng)對上述鑒定內(nèi)容有明確記載。此外，還應(yīng)對培養(yǎng)基配制原料的性狀、批號、失效期，以及配制過程各個環(huán)節(jié)的操作形成記錄。常用培養(yǎng)基的質(zhì)量鑒定見下表。表2 10種常用培養(yǎng)基的質(zhì)量鑒定表 培養(yǎng)基名稱 質(zhì)控菌株 ATCC 鑒定標準 血平板 金黃色葡萄球菌化膿性鏈球菌肺炎鏈球菌大腸埃希菌 2592319615630525922 中度到大量生長生長， - 溶血生長，溶血生長 巧克力平板 流感嗜血桿菌腦膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌 102111309043096 生長生長

15、生長 伊紅美藍平板 鼠傷寒沙門菌大腸埃希菌糞腸球菌 140282592229212 生長，無色到琥珀色菌落生長，藍黑菌落，金屬光澤部分抑制 麥康凱平板 大腸埃希菌奇異變形桿菌鼠傷寒沙門菌糞腸球菌 25922124531402829212 生長，紅色菌落生長， 無色菌落，遷徒現(xiàn)象部分抑制生長，無色菌落部分抑制 SS 平板 鼠傷寒沙門菌福氏志賀菌糞腸球菌大腸埃希菌 14028120222921225922 生長，無色菌落，有或無黑心生長，無色菌落全部抑制部分或全部抑制 TCBS 平板 霍亂弧菌副溶血弧菌大腸埃希菌 94591780225922 生長，黃色菌落生長，藍色菌落部分或全部抑制 營養(yǎng)瓊脂平

16、板沙保弱平板 福氏志賀菌白色念珠菌大腸埃希菌 120221023125922 中度到大量生長生長部分或全部抑制 羅氏培養(yǎng)基 結(jié)核分枝桿菌 H37R大腸埃希菌 2517725922 生長部分或全部抑制 淋病選擇性培養(yǎng)基 淋病奈瑟菌奇異變形桿菌表皮葡萄球菌 430964307112228 生長部分抑制部分抑制 常用培養(yǎng)基、染色液及生化反應(yīng)的種類繁多，其相應(yīng)的質(zhì)控菌株也有數(shù)十余種，這些菌株應(yīng)來源于世界上專門保存菌種的權(quán)威機構(gòu)。如美國菌種保藏中心(ATCC)；英國的國家典型菌種保藏中心(NCTC)；或我國衛(wèi)生部藥檢生物制品檢定所菌種保藏中心(CMCC)等。下面介紹一下質(zhì)控菌株的保存方法(1)一般保存方

17、法：用高層瓊脂保存，使細菌處于代謝緩慢狀態(tài)，并按照各種細菌生長的情況作定期移種。此方法是最簡單的保存方法，最長可保存一年細菌不會死亡。但細菌經(jīng)多次移種后，性狀可能發(fā)生變異。(2)低溫冰箱保存方法：取數(shù)環(huán)對數(shù)生長期的細菌混懸于小牛血清或無菌脫纖維羊血0.51ml中，容器中加入無菌玻璃珠數(shù)枚，速凍后(液氮內(nèi))，貯存于40低溫冰箱中保存。需用時無菌鑷子取出一枚玻璃珠置培養(yǎng)基中，即可獲得新鮮菌種。這種方法可長期保存細菌。(3)真空冷凍干燥法：該方法最為可靠，具有不改變菌種性狀，可長期保存，對保存條件適應(yīng)性強等優(yōu)點。（五）試劑質(zhì)控臨床微生物實驗室常用的試劑，包括染色液、診斷血清及各種生化反應(yīng)試劑等。各種

18、染色液配制后，必須用適應(yīng)的標準菌株作陽性和陰性對照后方可使用；各種生化反應(yīng)試驗的培養(yǎng)基及試劑，必須用化學(xué)純或分析純試劑配制，并且陽性與陰性菌株作性能試驗，再注明批號，按試劑性質(zhì)，分別予以避光冷藏，在有效期限內(nèi)使用；定期以陽性與陰性菌株進行監(jiān)控。1、染色液質(zhì)控 細菌室最常用的染色液是革蘭染色液和抗酸染色液。對自制的染色液，要求將整個配制過程的操作步驟形成記錄并保存；配好的染色液應(yīng)貼上寫有染色液名稱、配制日期、配制人的標簽；初次使用時必須用革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌標準株作質(zhì)量鑒定，以證實染色液配制無誤；商品化染色液應(yīng)對試劑名稱、批號、存放條件、失效期等說明；廠家應(yīng)向客戶提供染色液鑒定的質(zhì)量保證書

19、。按照 CLIA88 的規(guī)定，染色液應(yīng)每周作一次質(zhì)量控制，用金黃色葡萄球菌 (ATCC25923) ，大腸埃希菌 (ATCC 25922) 作革蘭染色液的室內(nèi)質(zhì)控。用結(jié)核分枝桿菌 H37Ra(ATCC 25177) 對抗酸染色液進行質(zhì)量鑒定。過期的染色液應(yīng)不再使用。 2.、常用生化試劑的質(zhì)控 隨著細菌鑒定儀和快速微量生化鑒定板條的普及，臨床微生物檢驗常用的生化試劑種類日趨減少，對這些試劑的質(zhì)控要求見表3。此外，應(yīng)注意在用試劑貯存時的避光、冷藏等要求，保證試劑的穩(wěn)定性。不要使用過期的試劑。 3、診斷血清的質(zhì)控 診斷血清是一種重要的細菌鑒定的試劑，應(yīng)從有資質(zhì)的生產(chǎn)單位購買。驗收時必須看清生產(chǎn)批號、

20、血清效價、透明度與色澤。初次使用時應(yīng)注意：工作濃度并與原用的診斷血清對照比較后再用于病人樣品的測試。試驗中應(yīng)注意無菌操作，避免細菌污染。要經(jīng)常檢查貯存在4 冰箱中的各種血清，若發(fā)現(xiàn)混濁，出現(xiàn)絮狀，應(yīng)停止使用。為保證血清凝集反應(yīng)結(jié)果準確，應(yīng)每3 個月對血清進行一次質(zhì)控；不要使用過期的血清。 表3 常用試劑的質(zhì)量鑒定試劑名稱 陽性對照菌種 陰性對照菌種 監(jiān)控頻率 凝固酶血漿 金黃色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 每天 桿菌肽 A 群鏈球菌 B 群鏈球菌 每周 Optochin 紙片 肺炎鏈球菌  每周 10% 去氧膽酸鈉 肺炎鏈球菌  每周 三氯化鐵（馬尿酸鈉試驗） B 群鏈球菌 A

21、群鏈球菌 每次 過氧化氫 金黃金葡萄球菌 A 群鏈球菌 每天 氧化酶 銅綠假單胞菌 大腸埃希菌 每天 甲基紅試劑 大腸埃希菌 產(chǎn)氣腸桿菌 每周 VP 試劑 產(chǎn)氣腸桿菌 大腸埃希菌 每周 三氯化鐵（苯丙氨酸脫氫酶試驗） 奇異變形桿菌 大腸埃希菌 每周 “X ”因子條狀物 嗜沫嗜血桿菌 副流感嗜血桿菌 每周 “V ”因子條狀物 副流感嗜血桿菌 流感嗜血桿菌 每周 “X+V”因子條狀物 流感嗜血桿菌副流感嗜血桿菌  每周 芽管血清 白色念珠菌 熱帶念珠菌 每次 微生物室標本接收程序（SOP）一、目的：確保送檢標本合格及檢驗結(jié)果的正確性和及時性。二、操作方法1接收標本應(yīng)做好查對，對不合格標本

22、或標本與檢驗單不符合的，應(yīng)及時與臨床聯(lián)系，直至標本送檢合格并做好記錄。痰液標本：先看外觀（膿性粘液狀），再直接涂片鏡檢，低倍鏡下白細胞25個、上皮細胞10個/每個視野，為合格痰液；應(yīng)無菌容器盛裝。無菌體液標本：檢查盛裝器皿或試管必須消毒滅菌，標本數(shù)量多少是否符合要求，是否有污染的可能；盡量在用藥前采集標本。大便標本：要取病變部位（膿、血粘液）盛裝消毒盒內(nèi)；容易干燥的標本：如咽拭子、膿液拭子、泌尿生殖道拭子等采集后要及時送檢、接種。尿液標本：要留取晨尿3-5ml于無菌瓶中，防止污染；厭氧菌培養(yǎng)的標本，其送檢環(huán)境是否滿足；各種標本做好原始單的登記。2標本編號規(guī)則（1）BacT/ALERT3D60型

23、血培養(yǎng)編號按流水號+位置號。（2）接種平板常規(guī)標本按流水號，每年從1開始編號。（3）標本涂片編號：涂片查找抗酸菌：T+編號；涂片找真菌、桿菌：B+編號；球菌涂片： C+編號。（4）院感標本按每月從1編號。3標本登記規(guī)則細菌室要有細菌培養(yǎng)登記本、傳染病登記本、各種涂片染色登記本，并在電腦上登記每天接受的標本，和細菌培養(yǎng)鑒定及藥敏資料。登記內(nèi)容必須完整準確，包括編號、患者姓名、性別、年齡、科室、床號、標本來源、住院號、細菌名及各種藥敏結(jié)果。對法定傳染病的結(jié)果，要登在傳染病登記本上，并報告院防保科。各項登記必須準確登記年、月、日，方便查詢。對有特殊耐藥機制的細菌，必須準確記錄其產(chǎn)酶結(jié)果。微生物室標本

24、接種程序（SOP）一、目的：保證標本正確接種到合適的培養(yǎng)基中，使細菌能得到充分的生長和能分離出單個菌落，獲得純培養(yǎng)而供分析鑒定。二、操作方法1、右手持接種工具，在火焰上燒灼接種環(huán)變紅而滅菌。2、左手持標本容器或試管，用接種環(huán)挑取標本，采用分段劃線法接種于平皿上；無菌組織來源的標本應(yīng)接種增菌液，放35培養(yǎng)箱中。當從標本器皿或平板上挑取菌落后，應(yīng)立即塞上試管塞或扣上平皿蓋以防污染。3、挑取標本時，應(yīng)注意選擇反映感染的病理部分。如糞便挑取粘液膿血部分；純化細菌應(yīng)從原代培養(yǎng)基上挑取單個可疑菌落；從液體培養(yǎng)基中取菌，將接種環(huán)在培養(yǎng)液中蘸取一環(huán)即可，并編號記錄。4、接種時可根據(jù)標本，以快速、提高陽性率為前

25、題，采用不同的接種方法，選擇不同的培養(yǎng)基。5、接種后，應(yīng)在火焰上燒灼接種工具，所用工具應(yīng)放回原處。6、下表1是各種標本細菌培養(yǎng)應(yīng)選擇的培養(yǎng)基。如尿液接種方法：在火焰上燒紅接種環(huán)，無菌手續(xù)挑取中段尿50ul，在血瓊脂平板和麥康凱平板中做分段劃線接種，放35培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。表4 各種標本選擇的培養(yǎng)基標本名稱接種培養(yǎng)基尿液血平板（BM）、麥康凱（MCK）糞便麥康凱（MCK）、血平板、SS痰液、咽拭子、灌洗液血平板、巧克力平板、麥康凱（MCK）痰液、白帶等檢驗真菌沙保羅培養(yǎng)基、血平板白帶、前列腺液巧克力平板（TM）、血平板傷口分泌物、膿汁血平板、麥康凱（MCK）血液、脊髓液專用血培養(yǎng)瓶腦脊液巧克力平板、

26、血平板、肉湯管注：巧克力平板接種后放入5%-10%CO2環(huán)境中35培養(yǎng)中培養(yǎng)。血培養(yǎng)瓶包括 PLUS+AEROBIC/F（細菌、真菌培養(yǎng)）PLUS+ANAEROBIC/F(厭氧菌培養(yǎng)) PEDC-PLUS/F(兒童血、腦脊液培養(yǎng)) MYCO/F-LYTIC（結(jié)核培養(yǎng)）病原微生物污染處理程序（SOP）1、廢棄標本處理血液、穿剌液、腦脊液無菌手續(xù)抽取后，立即注入血培養(yǎng)瓶中送檢。用后的針頭放入利器盒中，注射器毀形裝入黃色塑料袋中統(tǒng)一焚燒處理。尿液、痰液用帶蓋的無菌瓶子盛放送檢，接種完后，標本瓶子放進帶蓋的污物桶中，統(tǒng)一焚燒處理。生殖道標本、傷口分泌物等用無菌帶蓋棉簽試管送檢，接種后，標本試管放入帶蓋

27、污物桶中，統(tǒng)一焚燒處理。涂片的玻片使用后，放入盛有2000mg/L含氯消毒液桶中，浸泡后煮沸30分鐘滅菌處理，清洗干凈。2、使用后的衛(wèi)生物品處理廢棄的塑料培養(yǎng)基、一次性衛(wèi)生用品、過期的菌株及痰盒放進黃色塑料袋子集中放進高壓鍋消毒后焚燒。檢驗后帶菌玻璃培養(yǎng)皿，集中統(tǒng)一放進高壓鍋消毒后，清洗干凈烤干再用。凡用于吸取菌液的吸嘴、吸管，一律放入2000mg/L含氯消毒液中浸泡后焚燒。3、被細菌污染操作臺面或地面的處理：應(yīng)立即用2000mg/L含氯消毒液擦拭或用2000mg/L含氯消毒液灑到污染點上，浸泡30分鐘后擦洗干凈。4、職業(yè)暴露后處理手被污染后應(yīng)立即浸泡到含氯消毒液中或用碘伏消毒處理。若眼睛或粘

28、膜污染，則用無菌生理鹽水沖洗，滴抗菌素眼藥水處理。無故剌傷，若被病原體污染，應(yīng)立即用碘伏消毒、口服抗菌素處理；并報告防保科有關(guān)部門，根據(jù)不同病原體采取相應(yīng)的應(yīng)急措施，包括預(yù)防接種和抗菌素治療等。血液及骨髓細菌培養(yǎng)標準操作程序（SOP）1、標本采集由病房護士在病人發(fā)熱初期或發(fā)熱高峰時抽取血液，采集血量510ml，為培養(yǎng)液的1/10為宜（兒童為35 ml）；骨髓1-3 ml。標本采集注意事項，執(zhí)行臨床檢驗標本采集指南。注意嚴格無菌操作，標本采集后應(yīng)立即注入血培養(yǎng)瓶充分混勻，防止凝固，并立即送檢。2、檢驗程序圖1 血液、骨髓（增菌需、厭氧培養(yǎng)） 涂片染色鏡檢 分離培養(yǎng) 直接藥敏試驗 3568小時血平

29、板和巧克力平板 血平板和麥康凱 初步報告（CO2培養(yǎng)及需氧培養(yǎng) ） （厭氧培養(yǎng)） 菌落觀察涂片染色鏡檢 純培養(yǎng) 血清學(xué)試驗 生化反應(yīng) 藥敏試驗 確定報告 3、機檢程序：培養(yǎng)瓶放入BacT/ALERT3D自動細菌培養(yǎng)儀里，若有細菌生長儀器自動報警，取出移種血平板做進一步培養(yǎng)分析鑒定。用一次性注射器以無菌技術(shù)抽取瓶內(nèi)培養(yǎng)物涂片，做革蘭氏染色，將染色特性結(jié)果電話通知臨床醫(yī)生。取生長物移種血平板、麥康凱平板放35培養(yǎng)16-20小時。肉眼觀察血平板、麥康凱平板上的菌落特征并做革蘭氏染色。 若是革蘭陽性球菌：根據(jù)血平板溶血生長情況和涂片細菌形態(tài)做PC12測試板鑒定。若是革蘭陰性桿菌：作氧化酶試驗，并做NC

30、21測試板鑒定。4、報告結(jié)果菌體鑒定到種或型及所測得的抗生素MIC試驗結(jié)果。培養(yǎng)七天后如果陰性，BacT/ALERT3D儀器自動報警，取出培養(yǎng)瓶盲傳血平板、巧克力平板、麥康凱平板及革蘭氏染色。有細菌就報××菌生長；如無細菌則報告：“培養(yǎng)7天無細菌生長”。痰（咽試）培養(yǎng)標準操作程序（sop）1、常見病原菌 表5 下呼吸道標本培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌 腦膜炎奈瑟氏菌 化膿性鏈球菌 流感嗜血桿菌 肺炎鏈球菌 腸桿菌科細菌 結(jié)核分枝桿菌 非發(fā)酵菌 白喉棒狀桿菌 嗜肺軍團菌 假絲酵母菌 擬桿菌 2、標本采集：為清晨經(jīng)漱口的第一口痰，且新鮮深咳出者，收集時

31、應(yīng)避免受唾液污染；將痰吐入無菌帶蓋的痰杯中送檢。痰標本肉眼觀察：顏色，粘度，有無血絲或膿性，若標本為水狀且明顯是唾液，涂片鏡檢上皮細胞25，白細胞很少為不合格，重送標本。3、檢驗程序圖2 痰液 結(jié)核菌檢查 血平板及麥康凱 巧克力平板 涂片革蘭染色鏡檢抗酸染色 羅氏培養(yǎng)基 需厭氧各一 CO2培養(yǎng)1824小時 初步報告 菌落觀察和涂片染色 鑒定試驗 藥敏試驗 確定報告涂片革蘭氏染色檢查：挑選痰液中膿性或帶血部分，涂成均勻薄片，革蘭氏染色鏡檢。除了解痰標本收集是否合格外，還可根據(jù)鏡檢所見發(fā)初步報告；如見排列成葡萄狀的G+C,可報告為“找到G+C,形似葡萄球菌”;如見到瓜子仁形或矛頭狀的尖端相背，成雙

32、排列短鏈狀，且有明顯莢膜的革蘭陽性球菌時，可報告為：“找到革蘭氏陽性球菌，形似肺炎鏈球菌等”。痰標本的接種：分別將痰標本接種于血平板、巧克力平板或麥康凱平板上。 培養(yǎng)：將血平板、麥康凱平板置于35培養(yǎng)箱培養(yǎng)；將巧克力平板置于5%10%CO2環(huán)境中，35培養(yǎng)箱培養(yǎng)1824小時。觀察培養(yǎng)基的生長狀況，并定量每一種微生物的生長情況，以多量、中量及少量記錄。觀察培養(yǎng)基的生長情形后，可視需要取菌落作涂片，進行革蘭氏染色鏡檢。根據(jù)革蘭氏染色情況，挑取可疑菌落做生化鑒定或利用WalkAway-40SI儀鑒定板進行鑒定和藥敏。若可能的話，可當日發(fā)出部分報告或最后確定報告。若是正常菌群生長，可報“無致病菌生長”

33、；查出致病菌或條件致病菌，報告菌名和藥物敏感試驗結(jié)果。尿液培養(yǎng)標準操作程序（sop）1、檢驗程序圖3 尿液涂片染色鏡檢 定量培養(yǎng) 分離培養(yǎng)（血平板、麥康凱） 淋球菌培養(yǎng) 菌落觀察 涂片染色 巧克力平板 涂片染色鏡檢 純培養(yǎng) 初步報告 5%-10%CO2 鑒定、藥敏試驗 3518-24h 確定報告2、標本的采集清潔外陰及尿道口周圍，自然排出的中段尿液13 ml，導(dǎo)尿及恥骨吸取膀胱尿液510ml裝于無菌容器，標本收集后立即送檢。3、標本的處理涂片檢查：以無菌操作吸取尿510ml，放入無菌試管內(nèi)，經(jīng)3000r/min離心10min后，傾去上清液，取其沉渣，涂片革蘭氏染色鏡檢。如發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陰性雙球菌

34、，存在細胞內(nèi)或細胞外或者有念珠菌等，即可發(fā)出鏡檢初步報告。尿定量培養(yǎng)（菌落計數(shù)）平板接種法：用定量加液器取尿液50ul，滴在平板培養(yǎng)基上，用接種環(huán)涂抹均勻，放35培養(yǎng)過夜，計數(shù)生長的菌落數(shù)，乘以20，求出每ml的菌數(shù)。傾注平板法：首先將無菌生理鹽水9.9ml分裝在試管中，加入被檢尿0.1ml,充分混勻，使成100倍稀釋。取此液1ml放入直徑9cm滅菌平皿內(nèi)，同時加入已融化并冷至50的培養(yǎng)基與尿混勻，待凝固后置35培養(yǎng)，生長菌落數(shù)乘以100即相當于每ml中菌數(shù)。培養(yǎng)基選擇：血平板、麥康凱是基本培養(yǎng)基，一般的革蘭氏陽性和陰性菌均可生長。淋球菌培養(yǎng)：選用巧克力平板，并放入CO2環(huán)境中培養(yǎng)。結(jié)核桿菌培

35、養(yǎng)：選用羅氏培養(yǎng)基。3報告方式：如下情況需要進行鑒定和抗生素敏感試驗。革蘭陰性桿菌計數(shù)大于105cfu/ml；革蘭陽性球菌計數(shù)大于104cfu/ml有診斷意義。導(dǎo)尿標本的菌落計數(shù)超過103cfu/ml有臨床意義。以“恥骨抽取”所得到尿液上的任何微生物。與病人血液中所發(fā)現(xiàn)的微生物相同者。通過染色鏡檢，生化反應(yīng)或上機分析鑒定，最后報告細菌名稱及藥敏試驗結(jié)果。注： 在血平板，巧克力平板，麥康凱平板上的菌落特征及生長情況都要記錄在“細菌培養(yǎng)登記薄”上。膽汁細菌培養(yǎng)標準操作程序（sop）1膽汁培養(yǎng)常見的病原菌表6 膽汁培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 腸球菌 大腸埃希菌 消化鏈球菌 肺炎克雷伯氏菌

36、 厭氧鏈球菌 變形桿菌 葡萄球菌 銅綠假單胞菌 傷寒及其它沙門菌1、標本的采集：由臨床醫(yī)生在無菌操作下，抽取膽汁于無菌試管中送檢。膽汁標本采集方法有三種，即十二指腸引流法，膽囊穿刺法及手術(shù)直接采取法。十二指腸引流法：無菌操作下用導(dǎo)管作十二指腸引流膽汁，分為A、B、C三部分。A液來自膽管，為橙黃或金黃；B液來自膽囊為棕黃綠色；C液來自肝膽道為檸檬色。B液做細菌培養(yǎng)意義較大。膽汁的接種量為培養(yǎng)液的1/10，無菌操作取B液5ml于培養(yǎng)瓶中輕輕混勻，放35溫箱中培養(yǎng)。2、標本的處理涂片檢查：一般不作涂片檢查，當臨床需要時，可將膽汁經(jīng)3000r/min離心10min后，取沉淀涂片，革蘭氏染色鏡檢。根據(jù)細

37、菌形態(tài)，排列及染色特性，發(fā)出初步報告。3、細菌檢驗程序圖4 膽汁涂片染色 需氧培養(yǎng)（增菌） 厭氧培養(yǎng)鏡檢 血平板、麥康凱 血平板 涂片染色鏡檢，鑒定及藥敏試驗 確定報告增菌培養(yǎng)：膽汁本身有抑菌作用，接種普通肉湯后，膽鹽稀釋降低抑菌作用，為提高陽性檢出率，膽汁的接種量為肉湯的1/10。分離培養(yǎng)：移種血平板、麥康凱，采用分區(qū)劃線接種，35增菌培養(yǎng)24h72 h觀察有無菌生長，無菌生長則報告無細菌生長。結(jié)果觀察及鑒定：有細菌生長，根據(jù)生長細菌按常規(guī)或上機鑒定之。4、報告方式沙門氏菌感染在膽汁中檢出率較高，但必須以血清凝集試驗為依據(jù)，報告血清型。正常膽汁應(yīng)是無菌的，如培養(yǎng)出細菌即為致病菌，應(yīng)報細菌的種

38、、型及藥敏試驗結(jié)果。腦脊液培養(yǎng)標準操作程序（sop）1、標本的采集：在患者用藥前，由臨床醫(yī)師以無菌手續(xù)行腰椎穿刺，抽取腦脊液3-5ml，盛于無菌試管中，立即送檢（切不可置冰箱冷藏）。2、標本的處理首先觀察腦脊液的外觀，除結(jié)核性腦膜炎，無菌性腦膜炎外；其他細菌引起的化膿性腦膜炎，腦脊液多呈明顯混濁。取腦脊液標本以3000r/min離心10min，取沉淀物培養(yǎng)和涂片革蘭氏染色、抗酸及墨汁染色鏡檢，根據(jù)染色鏡檢發(fā)出初步報告。3、檢驗程序圖5 腦脊液 涂片染色 巧克力平板 結(jié)核菌培養(yǎng) 沙保羅培養(yǎng)基 革蘭染色 血平板（增菌） 羅氏培養(yǎng)基 血平板黑汁染色 抗酸染色 5-10% CO2培養(yǎng) 需氧培養(yǎng) 25培

39、養(yǎng) 35培養(yǎng) 菌落形態(tài)， 若有菌生長， 涂片染色 涂片染色 涂片染色鏡檢 鑒定、藥敏試驗 鏡檢 確定報告培養(yǎng)基的選擇：可先將腦脊液接種肉湯增菌、巧克力平板及羅氏培養(yǎng)基，再用肉湯增菌后接種血平板、沙保羅平板等。結(jié)果觀察及鑒定：涂片染色鏡檢：革蘭氏陰性雙球菌，呈腎形兩凹面相對成一圓形成雙排列。本菌屬細菌氧化酶及觸酶陽性，腦膜炎奈瑟菌能分解葡萄糖、麥芽糖，而淋病奈瑟氏菌只分解葡萄糖相鑒別。4、報告方式：如實報告鑒定結(jié)果及其藥敏結(jié)果。膿液及傷口分泌物培養(yǎng)標準程序（sop）1、檢驗程序圖6 膿液及傷口分泌物涂片染色 需氧培養(yǎng) 厭氧培養(yǎng) 結(jié)核菌培養(yǎng)革蘭氏染色 抗酸染色 分離培養(yǎng) 分離培養(yǎng) 增菌培養(yǎng)鏡檢 血

40、平板及巧克力平板 葡萄糖血平板 硫乙醇酸鈉肉湯 麥康凱平板 牛心腦浸液平板 皰肉增菌培養(yǎng)基 觀察菌落 涂片染色鏡檢 純培養(yǎng) 生化試驗 藥敏試驗 確定報告 2、標本的采集創(chuàng)傷：用無菌鹽水清洗表面，用棉試子直接沾取膿液或分泌物。膿腫：消毒患部，無菌注射器抽取膿液2-5ml刺入無菌橡皮塞中送檢（注意厭氧菌的檢測）。檢查放線菌的標本應(yīng)取多量膿液，要注意采集其中“硫磺顆粒”進行鑒定。3、標本的處理涂片檢查：膿液標本均應(yīng)涂片進行革蘭氏染色或抗酸染色，根據(jù)鏡下所見發(fā)出初步報告。4、培養(yǎng)檢查培養(yǎng)接種：標本接種到血平板，麥康凱平板，置35培養(yǎng)，標本接種到巧克力平板置5-10%CO2環(huán)境35培養(yǎng)16-24h。培養(yǎng)

41、基菌落觀察及鑒定：血平板，巧克力平板，麥康凱平板上生長的細菌，按常規(guī)鑒定及藥敏試驗。膿性標本涂片見大量細菌，而培養(yǎng)不生長者，應(yīng)考慮厭氧菌感染，應(yīng)做厭氧菌培養(yǎng)。5、報告方式：對無菌組織部位的感染，分泌物中分離到細菌，一般均有臨床意義，要及時鑒定和藥敏試驗。報告細菌名稱及藥敏試驗結(jié)果。糞便細菌培養(yǎng)標準操作程序（sop）1、引起感染性腹瀉的病原微生物有：細菌性，產(chǎn)毒素型腹瀉：包括霍亂弧菌、腸毒素型大腸埃希菌等；侵襲型腹瀉：包括志賀菌、腸致病大腸埃希菌和腸侵襲型大腸埃希菌等；食物中毒：包括沙門菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽胞桿菌和肉毒梭菌等；偽膜性腸炎：包括艱難梭菌、葡萄球菌或真菌；慢性腹瀉：主要由結(jié)核桿菌、念珠菌引起。真菌性：念珠菌、毛霉菌等。引起腹瀉的致病菌見下表 表7 常見引起腹瀉的致病菌革蘭陽性菌 革蘭陰性菌金黃色葡萄球菌 傷寒及其它沙門菌結(jié)核分支桿菌 志賀菌屬難辨梭菌 致病大腸埃希菌蠟樣芽胞桿菌 （ETEC、EPEC、EIEC、EHEC）白色念珠菌 弧菌屬菌種毛霉菌 氣單胞、鄰單胞菌種 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 彎曲菌2、標本采集：采集糞便標本時，應(yīng)挑取有膿血或粘液部分35克，盛于消毒的廣口瓶、蠟質(zhì)紙盒或塑料盒內(nèi)及時送檢