【精品】ELISA鑒定噬菌體單克隆親和力

1、s0p2standard operation protocol ( sop )技術(shù)方法名稱：elisa鑒定噬菌體單克隆親和力基本原理：酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay, elisa)基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固 相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶 連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫 活性，又保留酶的活性。在測定吋，把受檢標(biāo)本(測定其中 的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與i古i相載體 表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成 的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上

2、的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的 底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受 檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或 定量分析。用途及受限因素elisa可用于測定抗原，也可用于測定抗體。受限因素：重復(fù)性不高，試驗(yàn)結(jié)果影響因素復(fù)雜，如洗 滌力度、抗原/抗體濃度、顯色時間等實(shí)驗(yàn)材料96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞計數(shù)器、細(xì)胞培養(yǎng)液、0.25%胰 酶、pbst、2%pbs-bsa> 4%多聚甲醛、0.1 %triton x-100> 固相的抗原或抗體(待檢細(xì)胞)、噬菌體單克隆、酶標(biāo)記的 抗原或抗體(hrp/anti-m13 antibody) >酶

3、作用的底物(tmb)、 顯色終止液(1n的hc1或2n的h2so4)、酶標(biāo)儀model 550 (bio-rad)溶液的配制(1) hrp/anti-m13 monoclnl conjug產(chǎn)地ge (amersham)公口1：北京希凱工作液：用2% bsa 1： 5000稀釋，每20ml bsa加入5卩1hrp/anti-m13 antibodytmb配方：a 液：tmb lmg/ml dmsob 液:檸檬酸:1.02g/100 ml nahpo4-12 h2o： 3.68g/100 mlph： 5.05.4 (一般配制后ph=50)c液：30%過氧化氫a： b： c=100： 900： 15

4、0皿/孔，顯色815分鐘，注意：在辣根過氧化酶hrp的數(shù)種顏色反應(yīng)底物中，tmb 因其靈敏度較高及無致癌性而得到廣泛應(yīng)用。單組分tmb 過氧化物酶底物與辣根過氧化物酶連接物反應(yīng)時產(chǎn)生一種 深藍(lán)色的產(chǎn)物，適用于定量以及定性分析的酶聯(lián)免疫分析當(dāng) 中，但不適用于膜染色或者是免疫組織化學(xué)染色。終止反應(yīng) 后，30分鐘內(nèi)在450nm處讀數(shù)。操作步驟及每步需注意事項(xiàng)細(xì)胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度，以2.5x10*孔接種96孔板，第二可用；無血清dmem, 37°c培養(yǎng)2小時；4%多聚甲醛100（11/孔固定20min, pbst-0.05%洗1次，每 次 lmin；0.1%triton x

5、-100 100|il /孔處理 lomin, pbst-0.05%洗 3 次,每次1分鐘；2%pbs-bsa 100）1137°c,封閉lh；同時封閉酶標(biāo)板（用于稀釋噬菌體單克?。?；酶標(biāo)板每孔加入各單克隆20）11,用300|il 2%pbs-bsa稀釋, 以50卩1/孔加入96孔板；并設(shè)置空白對照和原庫隨機(jī)對照;i37°c, lh； pbst-0.05%洗 3 次，每次 1 分鐘;加入 100皿 hrp-anti m13 抗體（用 2%pbs-bsa1： 5000 稀加 1 oopil tmb （a： b： c=l： 1： 1）, 鑰 lomin （陽性克隆顏色為藍(lán)色）

6、，加50 |il 1n鹽酸終止反應(yīng)（由藍(lán)變?yōu)辄S）;i450nm酶標(biāo)儀讀數(shù)。s0p3standard operation protocol (sop)技術(shù)方法名稱：細(xì)胞免疫化學(xué)dab染色鑒定噬菌體單克隆親和力試驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理同elisa,酶反應(yīng)底物改為dab。用途及受限因素可用于測定抗原，也可用于測定抗休。受限因素：重復(fù)性不高，試驗(yàn)結(jié)果影響因素復(fù)雜，如洗 滌力度、抗原/抗體濃度、顯色時間等實(shí)驗(yàn)材料96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞計數(shù)器、細(xì)胞培養(yǎng)液、0.25%胰 酶、pbst、2%pbs-bsa、4%多聚甲醛、0.1%triton x-100> 固相的抗原或抗體（待檢細(xì)胞）、噬菌體單克隆、酶標(biāo)記的 抗

7、原或抗體（hrp/anti-m13 antibody）>酶作用的底物（dab 試劑盒）、顯色終止液（1n的hc1或2n的h2so4）、琳 素、伊紅溶液的配制(1) hrp/anti-m13 monoclnl conjug產(chǎn)地ge (amersham)公司：北京希凱工作液：用2% bsa 1： 5000稀釋，每20ml bsa加入5卩1hrp/anti-m13 antibodydab試劑盒公司：北京中杉工作液：a、b、c液各取50卩1,加入150卩1水混勻，用前新 鮮配制操作步驟及每步需注意事項(xiàng)細(xì)胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度，以2.5x104接種96孔板，第二天用；無血清dmem,

8、37 °c培養(yǎng)2小時；4%多聚甲醛100卩1 /孔固定20min, pbst-0.05%洗1次，每次 lmin；0.1%triton x-100 loopil /孔處理 lomin, pbst-0.05%洗 3 次,每次1分鐘；2%pbs-bsa loopil /孔封閉，37°c, lh；同時封閉酶標(biāo)板（用于稀釋噬菌體單克隆）；酶標(biāo)板每孔加入各單克隆20|11,用300（11 2%pbs-bsa稀釋, 以50卩1/孔加入96孔板；并設(shè)置空口對照和原庫隨機(jī)對照;加入 100|11 hrp-anti m13 抗體（用 2%pbs-bsa1： 5000 稀釋），室溫lh, pbs

9、t-0.05%洗3次,每次1分鐘;加50|il dab37 °c放置15min,顯微鏡下觀察染色情況。（dab購自中杉公司）imager蘇木素液染色15min;流水下洗2min； 1%鹽酸乙醇分化10s；流水下洗2min；1%氨水反藍(lán)5min;流水下洗2min；顯微鏡下觀察染色情況，并拍照。s0p4standard operation protocol （sop）技術(shù)方法名稱：fitc-peptide細(xì)胞免疫熒光基本原理：細(xì)胞免疫熒光是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的 抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗 體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或 抗休

10、）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光 素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā) 出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì) 胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定 量技術(shù)測泄含量。用途及受限因素可用于測定多肽與細(xì)胞的親和力、特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果直 觀，說服力強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)材料96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞計數(shù)器、細(xì)胞培養(yǎng)液、0.25%胰酶、 細(xì)胞株、pbst、2%pbs-bsa、4%多聚甲醛、0.1%triton x-100、fitc-peptide> leica 熒光倒置顯微鏡溶液的配制fitc-peptide用滅菌水配制成1 mm.l"的初始濃

11、度，分裝成 50山，-20°c保存。工作液用2%pbs-bsa稀釋成25gm/l操作步驟及每步需注意事項(xiàng)各細(xì)胞株用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔io：細(xì)胞接種24孔板，培養(yǎng)過夜，第二天用；i無血清dmem,37 °c培養(yǎng)2小時；4%多聚甲醛looyl/孔固定20min, pbst-0.05%洗1次，每次 lmin；0%triton x-100 looptl /孔處理 lomin, pbst-0.05%洗 3 次,每次1分鐘；i2%pbs-bsa 100(11/孔封閉，37°c, lh；每孔加25|im/l多肽200|iil, 4°c孵育過夜；p

12、bs洗6次 每次lmin；熒光顯微鏡下觀察，波長為490nm, 觀察綠色熒光并拍照。s0p5standard operation protocol ( sop )技術(shù)方法名稱：fitc-peptide組織免疫熒光(石蠟切片)基本原理：細(xì)胞免疫熒光是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的 抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗 體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或 抗休)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光 素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā) 出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細(xì) 胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以

13、及利用定 量技術(shù)測泄含量。用途及受限因素可用于測定多肽與組織的親和力、特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果直 觀，說服力強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)材料二甲苯、乙醇、h2o2>甲醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、pbst、10 %pbs-bsa> fitc-peptide> leica 熒光倒置顯微鏡 溶液的配制(1) 3% h2o2-甲醇：30%的h2o2用甲醇1： 10稀釋成3% h2o2,可反復(fù)使用數(shù)次；(2) 檸檬酸鹽緩沖液(citrate buffer)：儲存液：a. 0.1m檸檬酸溶液：稱取21.01g檸檬酸(c6h8o7>h2o) 溶于1000ml蒸憾水中。b. 0.1m檸檬酸鈉溶液：稱取29.41g檸檬酸

14、鈉 (c6h5na3o72h2o)溶于1000ml蒸憾水中。1.2工作液:工作液: 取9ml a液和41ml b液加入450ml蒸憾水中，溶液ph值應(yīng) 為6.0±0.1, 0.01m檸檬酸緩沖液用于抗原修復(fù)。(3) fitc-peptide用滅菌水配制成1 mm.l1的初始濃度，分 裝成50|li1, -20 °c保存。工作液用10%pbs-bsa稀釋成25|im/l操作步驟及每步需注意事項(xiàng)一、脫蠟，水化將切片按順序浸泡在以下溶液屮。1、二甲苯i30min2、二甲苯iilomin3、乙醇100%lomin4、乙醇90%lomin5、乙醇80%lomin6、乙醇70%lomin7、乙醇50%lomin然后pbs洗5分鐘/3遍二、h2o2處理3% h2o2-甲醇浸泡切片半小時；然后pbs洗5mi