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文檔簡介
1、花鱸肌肉和肝臟組織細(xì)胞原代培養(yǎng)1.細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養(yǎng)基與其他試劑的配 制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查 與調(diào)試。具體工作如下:一、清洗(1) 常用器具:細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、廣口瓶、燒杯、 量筒、玻璃棒、電子天平、紗布、脫脂棉、止血鉗、鑷子、解剖 剪、解剖刀、解剖針、注射器、注射器過濾器、移液槍、槍頭、 離心管、細(xì)胞凍存管、酒精燈、試管架、超凈工作臺、倒置顯微 鏡、生化培養(yǎng)箱、烘箱、液氮罐、封口膜、噴壺、以及洗刷用品 等。(2) 玻璃器皿清洗:燒杯、量筒'玻璃棒' 廣口瓶(瓶蓋不泡鹽酸, 清
2、洗趕緊后直接高壓滅菌)等玻璃器皿自來水刷洗,除去灰塵, 烤箱中烘干,然后再浸入 5%稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、 砷等物。泡鹽酸12小時后立即用自來水沖洗,再用洗滌劑刷洗, 自來水沖干凈,然后用蒸餾水沖洗干凈后用烤箱烘干,高壓滅菌, 烘干備用。(3) 塑料器皿的清洗:細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶可以直接使用, 進(jìn)口槍頭、進(jìn)口離心管高壓滅菌。(4) 金屬制品的清洗:止血鉗、鑷子、解剖剪、解剖刀等先用洗滌劑 刷洗,后用自來水沖干凈,然后用 75%酒精擦拭,再用自來水, 然后用蒸餾水沖洗,再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好, 高壓滅菌,再烘干備用。(5) 棉織品:紗布和脫脂棉,高壓滅菌,再烘干
3、備用。二、溶液配制(1) PBS:配方一|-用電子天平準(zhǔn)確稱取 NaCl /8.0 g. KCl /0.2 g,KH2P04/ 0.29 g, Na2HP04-12H20/ 1.42 g溶于 800 mL 的超純水中,用玻璃 棒攪拌至溶解后調(diào)節(jié)pH值為7.27.4,然后定容至1L。置于高 壓滅菌鍋中滅菌30min,冷卻到室溫后分裝,于4°C冰箱冷藏備用。 配方二|-等滲0.01MPBS (1X PBS)細(xì)胞培養(yǎng)用,用電子天平準(zhǔn) 確稱取NaCI/8.00g濃度為8/58.5=0.13675M,本配方主要靠NaCI, KCI/0.20a 濃度為 0.2/74.5=0.00268M, Na
4、gHPOg 12HD/2.90a 濃度 為 2.90/358= 0.0081M, NazHPO4 2HP/1.44g 濃度為 2.90/358= 0.0081M, KH2PO4/0.24g 濃度為 0.25/136= 0.0019M,溶于 800 mL 的dddH2O,用玻璃棒攪拌至溶解,dddH2O定容至1000ml。置于 高壓滅菌鍋中滅菌30min,冷卻到室溫后分裝,于4C冰箱冷藏備 用。配方三|-用電子天平準(zhǔn)確稱取 NaCl /8.0 g, KCI /0.2 g , KH?P04/ 0.2g, Na2HPO4-7H?0/2.16 g, MgCL? 6HP/0.1g, CaCLg/0.1g
5、 溶于 800 mL的超純水中,用玻璃棒攪拌至溶解后調(diào)節(jié) pH值為7.2 7.4,然后定容至1L。置于高壓滅菌鍋中滅菌30min,冷卻到室溫 后分裝,于4C冰箱冷藏備用。(2) 0.25%胰蛋白酶溶液:胰蛋白酶粉末(1: 250) 0.25g,用PBS在 容量瓶中定容至100ml, 0.22um微孔濾膜過濾除菌,分裝,于 20 C保存。(3) 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液:準(zhǔn)確稱取0.25g的Trypsin 和0.02g的EDTA ,用PBS在容量瓶中定容至100ml,調(diào)節(jié)pH值 為7.2-7.4,用孔徑為0.22卩砧勺濾膜過濾除菌,用2mL的離心管 分裝,凍存于-20C冰箱
6、備用。(4) 培 養(yǎng)基: 基礎(chǔ)培 養(yǎng)基 MEM ,這是使用最為廣泛的培養(yǎng)基;完全培 養(yǎng)基配置方法為:1L MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加4.76g HEPES充分溶 解后,用NaOH將PH調(diào)到7.4,加2ng/ml bFGF, 20%小牛血清, 1mmol/L的L-谷氨酸,50mmol/L的2-巰基乙醇,100IU/ml青霉 素和100ug/ml鏈霉素。(5) HEPES溶液:配置100X貯存液(1mol/L),在99ml培養(yǎng)液中加 入1ml貯存液,使最終濃度任為10mmol/L。00 X貯存液(1mol/L) 配置方法:取23.8gHEPES溶于90ml雙蒸水中,用1mol/L NaOH 調(diào)PH至7
7、.58.0,然后用水定容至100ml,過濾除菌,分裝2ml 小瓶,4C或-20C保存。三、培養(yǎng)室的滅菌( 1 ) 室內(nèi)滅菌: 每周打掃一次, 先用自來水拖地、 擦桌子、超凈工作 臺等,然后用新潔爾滅擦拭。(2) 生化培養(yǎng)箱滅菌:先用3%。新潔爾滅擦拭,然后用70%酒精擦 拭,再用紫外燈照射。 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈, 定期消毒。 定期 更換蒸餾水。( 3) 實驗前滅菌: 打開紫外燈 20-30 分鐘 。( 4) 實驗后滅菌: 用 70%酒精( 3% 新潔爾滅)擦拭超凈臺、邊臺、 倒置顯微鏡的載物臺,打開紫外線照射 20-30min。四、實驗人員的無菌準(zhǔn)備:( 1 ) 肥皂洗手。( 2) 穿好隔離
8、衣、帶好隔離帽、口罩、穿好鞋套。(3) 戴乳膠手套, 75%酒精擦手。五、無菌操作(1) 凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培 養(yǎng)基、 胰蛋白酶的瓶子 均要用 70%酒精擦拭瓶子的外表面 。( 2) 靠近酒精燈火焰操作。( 3) 打開和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。(4) 無菌級;別高的物品不能觸碰無菌級別低的物品。 手不能從敞開 的瓶口上方經(jīng)過。( 5) 各種操作要靠近酒精燈, 動作要輕、 準(zhǔn)確,不能亂碰。 如吸管不 能碰到廢液缸。(6) 吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管,防止交叉污染。( 7) 手握試管、滴管、移液管時盡量遠(yuǎn)離工作端。(8)盡可能移走不需要的物品,在操作中經(jīng)常用酒精
9、擦拭臺面。(9)盡可能減少開蓋時間。(10)隨時擦去任何溢出物。六、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法一:組織塊培養(yǎng)法(主要用于肌肉組織的培養(yǎng))(1) 選取身體健康,無病的幼魚,用解剖針進(jìn)行頭顱穿刺法殺魚,70% 酒精消毒體表,然后放在無菌的培養(yǎng)皿中,待用。(2)解剖魚體,拿入無菌操作臺中,用無塵紙墊在魚體下,用直頭解 剖剪剔除皮膚,取體表肌肉組織,然后剝?nèi)?nèi)臟膜取肝臟組織并 刮去多余的外膜,放入培養(yǎng)皿,用 PBS清洗三遍,放入70%酒 精中消毒34mim,再用PBS清洗3遍,除去血塊,用加入雙抗 的無血清培養(yǎng)基清洗一遍。(3)切割組織塊,用解剖刀在培養(yǎng)皿上切割組織,切割過程中,加入 適量的培養(yǎng)液保持組織濕潤。
10、(4)懸浮移瓶,切割完成后用新鮮的培養(yǎng)基懸浮小組織塊, 用移液槍 移入培養(yǎng)瓶中,吸棄上清液,保留少量培養(yǎng)液,蓋上瓶蓋,輕輕 晃動瓶子,使組織塊在瓶底均勻鋪展開,用玻璃棒調(diào)整組織塊使 其均勻分布,組織塊間隔0.5cm為宜,25cm2培養(yǎng)瓶中加入2030 個組織塊。(5)細(xì)胞貼壁,將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱中平放2小時,使組織貼壁,然后 側(cè)放半個小時,使液體浸出,然后吸出液體。(6)細(xì)胞培養(yǎng),從培養(yǎng)瓶邊角加入 3ml培養(yǎng)基,蓋上瓶蓋,滿滿放 入培養(yǎng)箱中平放培養(yǎng)。如有懸浮,需重新貼壁。(7)初始培養(yǎng)5天后換一次培養(yǎng)基,后期每隔 2-4天換一次培養(yǎng)基。 換培養(yǎng)基的時候,吸走一半舊的培 養(yǎng)基, 再加入一半新的培
11、養(yǎng)基。(8)觀察、記錄細(xì)胞遷出情況,適時拍照。13天內(nèi)遷出較少,盡量 不要觀察。方法二 酶消化解離法(除肌肉和結(jié)締組織之外)(1) 選取身體健康,無病的幼魚,用解剖針進(jìn)行頭顱穿刺法殺魚,70% 酒精消毒體表,然后放在無菌的培養(yǎng)皿中,待用。(2) 解剖魚體,拿入無菌操作臺中,用無塵紙墊在魚體下,用解剖剪 打開腹腔(注意不能碰破腸道),剝?nèi)?nèi)臟膜取肝臟組織并刮去 多余的外膜,放入培養(yǎng)皿,用 PBS清洗三遍,放入70%酒精中 消毒34mim,再用PBS清洗3遍,除去血塊,使肝臟呈灰白 色,用加入雙抗的無血清培養(yǎng)基清洗一遍。(3) 胰酶消化,將組織切割成 1mm3大小,用1ml0.25%胰蛋白酶- 0.02% EDTA消化液消化20min后添加3ml完全培養(yǎng)基終止消 化,收集含有組織塊的細(xì)胞懸液,以 2200rpm離心2min;將所 得沉淀用1
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