生物制藥 ppt課件

1、第六章 核酸類藥物 本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容 核酸類物質(zhì)的分別提取及其發(fā)酵消費核酸類物質(zhì)的分別提取及其發(fā)酵消費 主要核酸類藥物的消費工藝主要核酸類藥物的消費工藝本章要求本章要求1 1掌握酶解法制備核苷酸的方法掌握酶解法制備核苷酸的方法2 2掌握發(fā)酵法消費肌苷酸的根本方法；掌握發(fā)酵法消費肌苷酸的根本方法；3 3了解疊氮胸苷、阿糖腺苷等的消費方法；了解疊氮胸苷、阿糖腺苷等的消費方法；4 4了解核酸類藥物的分類以及主要臨床用途了解核酸類藥物的分類以及主要臨床用途第一節(jié)第一節(jié) 核酸類物質(zhì)的分別提取及其發(fā)核酸類物質(zhì)的分別提取及其發(fā)酵消費酵消費一、核酸一、核酸DNA與與RNA)的提取與制備的提取與制備 了

2、解了解 1、工業(yè)用、工業(yè)用RNA的提取的提取1RNA及其工業(yè)來源及其工業(yè)來源 2高高RNA含量酵母菌株的挑選含量酵母菌株的挑選 1.從自然界挑選從自然界挑選 2.誘變育種誘變育種3用工業(yè)廢水培育高含量用工業(yè)廢水培育高含量RNA酵母酵母 菌體在味精廢水中菌體在味精廢水中 復(fù)原糖復(fù)原糖0.7 總糖總糖 1.2 總氮總氮0.2 總磷總磷0.5 無機(jī)鹽無機(jī)鹽 0.1-0.2 馴化培育，發(fā)馴化培育，發(fā)酵酵24小時，小時，RNA含量含量8-10酵母菌主要生長在偏酸性的潮濕的含酵母菌主要生長在偏酸性的潮濕的含糖環(huán)境中，例如，在水果、蔬菜、蜜糖環(huán)境中，例如，在水果、蔬菜、蜜餞的內(nèi)部和外表以及在果園土壤中最餞的

3、內(nèi)部和外表以及在果園土壤中最為常見。為常見。 物理誘變：射線、離子束、微波、超聲波物理誘變：射線、離子束、微波、超聲波化學(xué)化學(xué) 誘變：硫酸二乙酯誘變：硫酸二乙酯DFS亞硝基胍亞硝基胍NTG等等 生物誘變：病原微生物誘變，轉(zhuǎn)基因誘變生物誘變：病原微生物誘變，轉(zhuǎn)基因誘變 4RNA提取實例提取實例 堿解堿解230ml1.3%NaOH堿解液堿解液100g壓榨啤酒酵母6mol/LHCL，pH7,15min 20,30min清液清液沉淀沉淀10，Ph2.56mol/LHCL離心置冷過夜置冷過夜1.8gRNA純度80中和，離心 二二DNA的提取與制備的提取與制備 1工業(yè)用工業(yè)用DNA的提取的提取 粉碎新穎冷

4、凍魚精新穎冷凍魚精水，10015min漿狀漿狀魚精魚精加熱去雜蛋白，離心含熱變性含熱變性DNA溶液溶液乙醇，丙酮纖維狀纖維狀DNA沉淀，離心95乙醇洗滌，減壓枯燥DNA粗品粗品含含50-60熱變性熱變性DNA)2、生物活性、生物活性DNA的制備的制備 肝、脾、胸腺4倍生理鹽水搗碎，勻漿勻漿液離心2500r/pm,30min沉淀1洗滌3次，懸浮生理鹽水懸浮液搗碎，離心3min, 5SDS,攪拌攪拌2-3h, 0,2500r/pm上清液冷95乙醇離心纖維狀DNA洗滌冷乙醇、丙酮減壓、低溫枯燥DNA粗品粗品粗品DNA蒸餾水，5SDS攪拌1h離心5000r/pm清液NaCL，95冷乙醇沉淀DNA沉淀洗

5、滌、真空枯燥乙醇、丙酮活性DNA二、核苷酸的制備方法熟習(xí)二、核苷酸的制備方法熟習(xí) 水解法水解法DNA或或RNA經(jīng)酶或堿水解經(jīng)酶或堿水解發(fā)酵法發(fā)酵法半合成法半合成法一酶解法及堿水解法制備核苷酸一酶解法及堿水解法制備核苷酸1.酶解法制備脫氧核苷酸酶解法制備脫氧核苷酸桔青霉產(chǎn)生核酸酶桔青霉產(chǎn)生核酸酶P1核酸酶核酸酶P1 酶法消費酶法消費5核苷酸的主要工業(yè)用酶核苷酸的主要工業(yè)用酶 來源：桔青霉來源：桔青霉(Penicillium citrinum)發(fā)酵發(fā)酵 催化特性：催化特性：1水解單鏈水解單鏈RNA和和DNA中的中的3-5磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯酶活力強(qiáng)磷酸二酯酶活力強(qiáng)2水解單核苷酸和寡核苷酸中

6、的水解單核苷酸和寡核苷酸中的3-磷酸單酯鍵磷酸單酯鍵2、酶解法制備、酶解法制備5單核苷酸單核苷酸 CMPCMPCMPCMP3、雙酶法消費肌苷酸和鳥苷酸、雙酶法消費肌苷酸和鳥苷酸IG I+G：呈味核苷酸：呈味核苷酸4菌體自溶法消費核苷酸菌體自溶法消費核苷酸 原理：磷酸二酯酶在適宜的條件下降解細(xì)胞內(nèi)的原理：磷酸二酯酶在適宜的條件下降解細(xì)胞內(nèi)的RNA可產(chǎn)生可產(chǎn)生5-核苷酸。核苷酸。1谷氨酸產(chǎn)生菌體自溶法消費谷氨酸產(chǎn)生菌體自溶法消費5-核苷酸工藝流程：核苷酸工藝流程：5堿水解法消費堿水解法消費2，3-混合核苷酸混合核苷酸 RNA水溶液水溶液33.5%堿解0.3mol/lNaoH保溫38，16-20h水

7、解液中和6molL鹽酸鹽酸2，3-核苷酸核苷酸2,3環(huán)狀磷酸酯分解RNA留意：酶法降解留意：酶法降解RNA得到的是得到的是5核苷酸核苷酸 堿水解法降解堿水解法降解RNA消費消費2，3混合核苷酸混合核苷酸二發(fā)酵法消費核苷酸二發(fā)酵法消費核苷酸 1發(fā)酵法消費肌苷酸發(fā)酵法消費肌苷酸IMP 菌種：產(chǎn)氨短桿菌菌種：產(chǎn)氨短桿菌 對菌種的要求：對菌種的要求： 1運用腺嘌呤缺陷型菌株解除腺嘌呤衍生物的反響運用腺嘌呤缺陷型菌株解除腺嘌呤衍生物的反響抑制抑制 2菌體本身的菌體本身的5核苷酸降解酶活力低核苷酸降解酶活力低 3選用選用Mn2+不敏感性變異株培育基中添加限量不敏感性變異株培育基中添加限量Mn2+，以添加細(xì)

8、胞膜的通透性，使肌苷酸在胞外大量，以添加細(xì)胞膜的通透性，使肌苷酸在胞外大量合成合成三半合成法制備核苷酸三半合成法制備核苷酸 工業(yè)消費的呈味核苷酸約有工業(yè)消費的呈味核苷酸約有40-50是由半合成法而制得是由半合成法而制得 半合成法制備核苷酸的根本道路：半合成法制備核苷酸的根本道路： 發(fā)酵法消費核苷發(fā)酵法消費核苷提取、精制提取、精制 磷酸化磷酸化 5-核苷酸核苷酸肌苷 氯化氧磷磷酸三乙酯，水磷酸化反響，2h5-IMP(產(chǎn)率91發(fā)酵三、核苷的制備三、核苷的制備 化學(xué)法化學(xué)法 發(fā)酵法發(fā)酵法 RNA化學(xué)水解法制備核苷化學(xué)水解法制備核苷1核苷消費工藝流程圖核苷消費工藝流程圖148 圖圖14.8 RNA經(jīng)甲

9、酰胺化學(xué)水解制備核苷消費工藝流程圖經(jīng)甲酰胺化學(xué)水解制備核苷消費工藝流程圖1.水解水解2.離子交換分別離子交換分別3.濃縮濃縮4.結(jié)晶結(jié)晶鳥苷腺苷尿苷胞苷磷酸鳥苷腺苷尿苷胞苷磷酸腺苷尿苷胞苷腺苷尿苷胞苷陽離子交換陽離子交換陰離子交換陰離子交換 陰離子交換陰離子交換二發(fā)酵法消費核苷二發(fā)酵法消費核苷 規(guī)模：規(guī)模： 千噸千噸/年年 優(yōu)點：產(chǎn)量大，周期短，易控制。優(yōu)點：產(chǎn)量大，周期短，易控制。 產(chǎn)核苷菌株的共同特點：產(chǎn)核苷菌株的共同特點： 選用磷酸單酯酶活力強(qiáng)的枯草芽孢桿菌或短小芽抱桿選用磷酸單酯酶活力強(qiáng)的枯草芽孢桿菌或短小芽抱桿菌的誘變出發(fā)菌株；菌的誘變出發(fā)菌株； 用物理或化學(xué)法挑選出誘變菌用物理或化

10、學(xué)法挑選出誘變菌 發(fā)酵培育時必需提供限量的生長要素，并且好氧，在發(fā)酵培育時必需提供限量的生長要素，并且好氧，在某一特定的范圍內(nèi)累積大量核苷。某一特定的范圍內(nèi)累積大量核苷。1發(fā)酵法消費肌苷發(fā)酵法消費肌苷 菌種：枯草桿菌菌種：枯草桿菌保藏斜面菌種32活化,20h消費斜面種32,15h一級種子液1%接種量32,8h二級種子液10%接種量1.2L發(fā)酵罐發(fā)酵液過濾，除菌體發(fā)酵清液陽離子交換樹脂洗脫液活性炭吸附洗脫液減壓濃縮、冷凍結(jié)晶肌苷粗品其它產(chǎn)肌苷菌種：產(chǎn)氨短桿菌第二節(jié)第二節(jié) 核酸類藥物核酸類藥物 核酸類藥物的分類：核酸類藥物的分類： 第一類：天然核酸類物質(zhì)第一類：天然核酸類物質(zhì) 與代謝妨礙疾病有關(guān)與

11、代謝妨礙疾病有關(guān) 第二類：自然構(gòu)造堿基、核苷、核苷酸構(gòu)造的類似物或第二類：自然構(gòu)造堿基、核苷、核苷酸構(gòu)造的類似物或聚合物聚合物 抗病毒、腫瘤、艾滋病藥物，產(chǎn)生干擾素、免疫抑制抗病毒、腫瘤、艾滋病藥物，產(chǎn)生干擾素、免疫抑制一、疊氮胸苷一、疊氮胸苷Azidothymidine，AZT一構(gòu)造與性質(zhì)一構(gòu)造與性質(zhì) AZT是是1987美國美國FDA贊同的治療艾滋病藥贊同的治療艾滋病藥 二消費工藝二消費工藝 以胸苷為起始原料進(jìn)展化學(xué)合成以胸苷為起始原料進(jìn)展化學(xué)合成 工藝特點：原料來源少，合成道路復(fù)雜，本錢高。工藝特點：原料來源少，合成道路復(fù)雜，本錢高。疊氮胸苷的合成工藝道路疊氮胸苷的合成工藝道路 起始原料胸

12、苷的制備方法：起始原料胸苷的制備方法： DNA水解法水解法 主要方法主要方法 2-脫氧胞苷脫氧胞苷2-脫氧鳥苷脫氧鳥苷2-脫氧腺苷+胸腺嘧啶胸腺嘧啶大腸桿菌磷酸化酶胸苷鳥苷 胸腺嘧啶胸腺嘧啶嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶5-甲基尿苷甲基尿苷胸苷化學(xué)法二、阿糖腺苷二、阿糖腺苷Adenine arabinoside一構(gòu)造與性質(zhì)一構(gòu)造與性質(zhì) 化學(xué)名：化學(xué)名：9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或稱腺嘌呤阿拉阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或稱腺嘌呤阿拉伯糖苷。伯糖苷。 已有合成方法：已有合成方法： 發(fā)酵法發(fā)酵法 酶轉(zhuǎn)化法酶轉(zhuǎn)化法 阿糖脲苷阿糖脲苷尿嘧啶磷酸化酶尿嘧啶磷酸化酶嘌呤核苷磷酸

13、化酶嘌呤核苷磷酸化酶阿糖腺苷阿糖腺苷二消費工藝二消費工藝1、酶、酶-化學(xué)合成法化學(xué)合成法 原料：尿苷原料：尿苷 過程：氧氯化磷和二甲基甲酰胺反響、水解反響、酶過程：氧氯化磷和二甲基甲酰胺反響、水解反響、酶法轉(zhuǎn)化。法轉(zhuǎn)化。 氧氯化磷氧氯化磷二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺氧橋化合物氧橋化合物水解水解原料原料1原料原料2酶酶-化學(xué)合成法制備阿糖尿苷工藝道路化學(xué)合成法制備阿糖尿苷工藝道路化學(xué)催化化學(xué)催化酶催化酶催化酶催化酶催化三作用與用途三作用與用途 作用：廣譜作用：廣譜DNA病毒抑制劑，對單純皰疹病毒抑制劑，對單純皰疹、型，型，帶狀皰疹，巨細(xì)，牛痘等帶狀皰疹，巨細(xì)，牛痘等DNA病毒，在體內(nèi)外都有明病毒，在

14、體內(nèi)外都有明顯抑制造用顯抑制造用 用途：治療單純皰疹腦炎最好的抗病毒藥物。用途：治療單純皰疹腦炎最好的抗病毒藥物。 三、三氮唑核苷熟習(xí)三、三氮唑核苷熟習(xí)一構(gòu)造與性質(zhì)一構(gòu)造與性質(zhì) 商品名病毒唑，對商品名病毒唑，對DNA病毒、病毒、RNA病毒均有廣泛作用。病毒均有廣泛作用。 性質(zhì)：白色結(jié)晶，熔點性質(zhì)：白色結(jié)晶，熔點174176，易溶于水。，易溶于水。 特點：毒副作用小于特點：毒副作用小于AZT疊氮胸苷，價錢低廉，疊氮胸苷，價錢低廉， 不易產(chǎn)生抗藥性不易產(chǎn)生抗藥性二消費工藝二消費工藝 1.酶合成法酶合成法 微生物：產(chǎn)氣腸桿菌微生物：產(chǎn)氣腸桿菌底物：肌苷尿苷、鳥苷和三疊氮羧基酰胺底物：肌苷尿苷、鳥苷和

15、三疊氮羧基酰胺TCAN N尿苷尿苷核糖核糖1-磷酸磷酸嘧啶核苷嘧啶核苷磷酸化酶磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶尿尿苷苷 酶促法直接消費三氮唑核苷的方法：酶促法直接消費三氮唑核苷的方法： 1. 1. 雙酶法：雙酶法： 采用前段與后段由兩個不同的酶催化，即前段采用前段與后段由兩個不同的酶催化，即前段運用嘧啶核苷磷酸化酶運用嘧啶核苷磷酸化酶urose)urose)，后段運用嘌呤，后段運用嘌呤核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶pynpasepynpase兩種酶可同時由產(chǎn)氣兩種酶可同時由產(chǎn)氣腸桿菌培育獲得腸桿菌培育獲得 2. 2.單酶法：單酶法： 前段及后段反響都利用嘌呤核苷磷酸化酶由前段及后段反響都利用

16、嘌呤核苷磷酸化酶由乙酰短桿菌培育獲得乙酰短桿菌培育獲得2. 化學(xué)合成法目前國內(nèi)工業(yè)消費多采用化學(xué)合成法目前國內(nèi)工業(yè)消費多采用肌苷法肌苷法三步：三步： 1.乙?；佐姿嵋阴；佐姿?2. 融熔縮合融熔縮合160-165，減壓，減壓 3.氨解甲醇溶液氨解甲醇溶液三廢處置：三廢處置： 催化劑、氨氣、甲醇和副產(chǎn)物催化劑、氨氣、甲醇和副產(chǎn)物 肌苷肌苷四乙酰核糖四乙酰核糖TCA雙磷酸酯催化雙磷酸酯催化三氮唑核苷三氮唑核苷鳥苷法：鳥苷法：三氮唑核苷收率三氮唑核苷收率50%3-3.5kg1kg水解鳥苷醋酐與冰醋酸水解核糖1-磷酸+TCA雙磷酸酯縮合80%縮合物氨解鳥苷酸 3.發(fā)酵法日本報導(dǎo)發(fā)酵法日本報

17、導(dǎo) 培育基：培育基：1，2，4-三唑三唑-3-羧酰胺羧酰胺TCA、D-葡萄糖葡萄糖菌種：短桿菌、棒狀桿菌、節(jié)核桿菌、微球菌或桿菌菌種：短桿菌、棒狀桿菌、節(jié)核桿菌、微球菌或桿菌培育條件：室溫培育培育條件：室溫培育2-8天天 轉(zhuǎn)化率為轉(zhuǎn)化率為40-60%。 優(yōu)點：直接從優(yōu)點：直接從D-葡萄糖制備，三廢易于治理。葡萄糖制備，三廢易于治理。 缺陷：原資料單耗較大，葡萄糖用量為缺陷：原資料單耗較大，葡萄糖用量為1:560，TCA為為1:19。三作用與用途三作用與用途 廣譜抗病毒廣譜抗病毒DNA和和RNA病毒和抗腫瘤作用病毒和抗腫瘤作用 臨床用于治療流感、皰疹、腫瘤和肝炎臨床用于治療流感、皰疹、腫瘤和肝炎

18、四、阿糖胞苷四、阿糖胞苷 一構(gòu)造與性質(zhì)一構(gòu)造與性質(zhì) 別名：胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的組成部分是阿拉伯糖。別名：胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的組成部分是阿拉伯糖。 白色或類自色結(jié)晶性粉末，無臭，易溶于水，略溶于白色或類自色結(jié)晶性粉末，無臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中極微溶。甲醇、乙醇中，乙醚中極微溶。二消費工藝二消費工藝 1以以5CMP為原料的合成法為原料的合成法1工藝道路：工藝道路：2、工藝過程：、工藝過程： 水解：參與處置好的水解：參與處置好的6.5L 氫氧化鑭凝膠，總體積為氫氧化鑭凝膠，總體積為7.5L，升溫至，升溫至90，在不斷攪拌下，于，在不斷攪拌下，于pH9下進(jìn)展水下進(jìn)展水解。解。氧橋

19、化：冰鹽浴中進(jìn)展氧橋化：冰鹽浴中進(jìn)展 氨解：使氧橋斷裂氨解：使氧橋斷裂3，5-乙?；懵湟阴；懵?。成鹽：成鹽： 2鹽酸鹽酸-甲醇甲醇 2、以葡萄糖酸鈣為原料的合成道路、以葡萄糖酸鈣為原料的合成道路 略略五、聚肌胞苷酸聚肌胞五、聚肌胞苷酸聚肌胞Poyinosinic，Polycytidylic Acid，Poly1：C一構(gòu)造與性質(zhì)一構(gòu)造與性質(zhì)干擾素誘導(dǎo)劑，由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸組成的雙干擾素誘導(dǎo)劑，由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸組成的雙股多聚核苷酸。具有廣譜抗病毒作用股多聚核苷酸。具有廣譜抗病毒作用 可溶于可溶于0.85氯化鈉溶液。氯化鈉溶液。二消費工藝二消費工藝1、底物、底物5-核苷二磷酸吡啶

20、鹽的制備核苷二磷酸吡啶鹽的制備5核苷酸核苷酸 5肌苷酸或肌苷酸或5胞苷酸嗎啡啉雙環(huán)胞苷酸嗎啡啉雙環(huán)己基碳二亞胺己基碳二亞胺 5核苷酸嗎啡啉鹽核苷酸嗎啡啉鹽三正丁胺磷酸鹽無水吡啶三正丁胺磷酸鹽無水吡啶5核苷酸二磷酸吡啶核苷酸二磷酸吡啶鹽即鹽即CDP吡啶鹽，吡啶鹽，IDP吡啶鹽吡啶鹽乙醇83回流2.固定化多核苷酸磷酸化酶的制備固定化多核苷酸磷酸化酶的制備 3將分別純化的酶液滴參與冰浴中的載體，得到共價結(jié)合的固定化多核苷酸磷酸化。3、Poly I：C制備制備1底物預(yù)處置：底物預(yù)處置：CDP吡啶鹽轉(zhuǎn)成鋰鹽，吡啶鹽轉(zhuǎn)成鋰鹽，IDP轉(zhuǎn)成鈉鹽。轉(zhuǎn)成鈉鹽。2酶促反響：酶促反響： 每毫升反響液含每毫升反響液含m

21、olL數(shù)數(shù)IDP或或CDP 15；Tris 150；MgC126； EDTA 1；聚合；聚合酶酶5單位，單位，pH9.0，37，34小時。小時。用鹽酸調(diào)用鹽酸調(diào)pH1.52.0，使，使PolyI或或Poly C沉淀，立沉淀，立刻離心。以后在磷酸液沖液中溶解，等摩爾刻離心。以后在磷酸液沖液中溶解，等摩爾Poly I與與Poly C混合，生成產(chǎn)品混合，生成產(chǎn)品 。六、胞二磷膽堿六、胞二磷膽堿CDP-膽堿膽堿 Citico line，CDPcholine，Cytidine diphosphocholine 一構(gòu)造與性質(zhì)一構(gòu)造與性質(zhì) 化學(xué)名：胞嘧啶核苷化學(xué)名：胞嘧啶核苷-5-二磷酸膽堿鈉鹽二磷酸膽堿鈉鹽性質(zhì)：白色無定形粉末，易吸濕，易溶于水，幾不溶性質(zhì)：白色無定形粉末，易吸濕，易溶于水，幾不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多數(shù)有機(jī)溶劑。于乙醇、氯仿、丙酮等多數(shù)有機(jī)溶劑。二消費工藝二消費工藝1、酶合成法、酶合成法 反響體系為：反響體系為： 產(chǎn)酶菌體：酵母泥產(chǎn)酶菌體：酵母泥 550mgm1底物：底物：CMP 20molml， 磷酰膽堿磷酰膽堿 30molml，KH2PO4NaOH緩沖液緩沖液pH8.0200molml，葡萄糖葡萄糖 1000