蛋白質的表達純化

1、整理課件1實驗八實驗八 蛋白質的表達、分離、純化和鑒定蛋白質的表達、分離、純化和鑒定 (1)了解重組蛋白表達的方法和意義。 (2)了解親和層析分離純化的方法。 整理課件2 實驗原理實驗原理 克隆基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理，同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統(tǒng)，其表達外源基因產(chǎn)物的水平遠高于其它基因表達系統(tǒng)，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。整理課件3 本實驗中，攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在37，IPTG誘導下，超量表達攜帶

2、有6個連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。整理課件4 材料與試劑材料與試劑 試劑1 LB液體培養(yǎng)基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸餾水配至1000mL.2 氨芐青霉素：100mg/mL3 上樣緩沖液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM 2-ME, pH8.04 Washing Buffer（UWB

3、）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.35 Elution Buffer(洗脫): 100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.06 IPTG整理課件5實驗步驟實驗步驟 一、氯霉素?；D移酶重組蛋白的誘導一、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的誘導 1. 接種含有重組氯霉素?；D移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5mL LB液體培養(yǎng)基中 （含100ug/mL 氨芐青霉素），37震蕩培養(yǎng)過夜。 2. 轉接1mL過夜培養(yǎng)物于100mL（含100ug/mL 氨芐青霉素）LB液體培養(yǎng)基中，3

4、7震蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l, 37繼續(xù)培養(yǎng)1-3h. 4. 12，000rpm 離心10 min, 棄上清，菌體沉淀保存于-20或-70冰箱中。整理課件6 二、氯霉素?；D移酶重組蛋白的分離，純化二、氯霉素?；D移酶重組蛋白的分離，純化 1.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融50ml菌體沉淀，加入5mL上樣緩沖液GLB, 用吸管抽吸重懸, 4 12000rpm 離心 30 min, 將上清（總蛋白細胞裂解液）吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。 2. NTA層析柱的準備：在層析柱中加入1

5、mL NTA介質，并分別用8mL 去離子水，8mL上樣緩沖液GLB洗滌。(調速0.5ml/3分鐘 ) 。 3. 細胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液。 4.洗脫雜蛋白：用50mL洗滌緩沖液UWB以10-15mL/h流速洗柱，分別取10ul洗滌開始與結束時的樣品用于SDS-PAGE 分析。 5.洗脫目標蛋白：用10mL洗脫緩沖液洗柱，每管0.51 mL，共收集610管，分別取10ul樣品用于SDS-PAGE 分析。整理課件7 1裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。 2制分離膠：按所需的濃度配制12.5分離膠分離膠。30%Acr-Bis Tris-HCl pH

6、8.8 H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120ul20ul 灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠面），等膠自然凝聚后（這時候在膠面與水封之間可以看見清晰的界限）整理課件8 3制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠濃縮膠，配方如下：30%Arc-Bis Tris-HCl pH 6.7 H2O10%APTEMED400ul750ul1800ul50ul10ul整理課件9整理課件10 5加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個加樣孔加樣不宜過多，一般每孔加樣10L。 6電泳：先恒壓80V，待樣品進入分離膠后，調電壓為120V（恒壓）。當溴酚藍移動到離底部約0.5cm時，停止電

7、泳。整理課件117翹開玻璃板，將濃縮膠切掉, 剝下凝膠，準備染色。8 凝膠染色：使用考馬斯亮藍R250染色。兩塊膠（小盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液至回收染液至指定容器指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，75%乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每次10分鐘。整理課件12注意事項注意事項 (1) Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時應戴手套和口罩。 (2) 玻璃板表面應光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣泡。 (3) 樣品槽模板梳齒應平整光滑。 (4) 灌凝膠時不能有氣泡，以免

8、影響電泳時電流的通過。 (5) 切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區(qū)帶扭曲。（6）電泳時應選用合適的電流、電壓，過高或者過低都會影響電泳效果。 (7) 稀釋5SDS/電泳緩沖液至1濃度灌入電泳槽，需800毫升。整理課件131.將紅色玻璃夾子底座朝下、卡口打開呈直角狀，放入厚薄兩片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭頭向上，旁邊兩條小玻璃條與薄玻璃接觸，使之形成一個間隙。2.在平整的桌面上放下玻璃與夾子，使玻璃和夾子的底面完全對齊，向外扳動塑料卡口，關緊夾子。 整理課件143.將做好的玻璃夾放在制膠架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭頭向上。按彈簧夾，將玻璃夾卡入制膠架。在玻璃的間隙內灌膠，放上梳子，待膠凝固。 4.取出制好的玻璃（連帶膠），將玻璃放入電極架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向電極架，厚玻璃的箭頭朝上，玻璃與紅色橡膠條必須完全緊貼。（需同時放置兩塊制好的膠，如只使用一塊則另一面須用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必須使塑料板與橡膠條完全緊貼。）正常安裝則會形成一個密