酶生物傳感器講述

1、酶生物傳感器的應(yīng)用進(jìn)展摘要：酶生物傳感器是將酶作為生物敏感基元,通過各種物理、化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器捕捉目標(biāo)物與敏感基元之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的與目標(biāo)物濃度成比例關(guān)系的可測(cè)信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物定量測(cè)定的分析儀器。與傳統(tǒng)分析方法相比,酶生物傳感器具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):選擇性高、 反復(fù)多次使用、響應(yīng)快、體積小、可實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)、成本低，便于推廣普及。本文主要論述生物酶?jìng)鞲衅鞯奶卣?、發(fā)展及酶?jìng)鞲衅髦袘?yīng)用的新技術(shù)。關(guān)鍵詞：酶生物傳感器;進(jìn)展;應(yīng)用新技術(shù)1概述生物傳感器(Biosensor)是一類特殊的化學(xué)傳感器,通過各種物理、化學(xué)型信號(hào)轉(zhuǎn)換器捕捉目標(biāo)物與敏感基元之間的反應(yīng),然后將反應(yīng)的程度用離散或連續(xù)的信號(hào)表達(dá)出來,從而得出

2、被測(cè)物的濃度1。自1962年Clark2等人提出把酶與電極結(jié)合來測(cè)定酶底物的設(shè)想后，1967年Updike和Hicks3研制出世界上第一支葡萄糖氧化酶電極2，用于定量檢測(cè)血清中葡萄糖含量.此后，酶生物傳感器引起了各領(lǐng)域科學(xué)家的高度重視和廣泛研究，得到了迅速發(fā)展.酶生物傳感器是將酶作為生物敏感基元，通過各種物理、化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器捕捉目標(biāo)物與敏感基元之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的與目標(biāo)物濃度成比例關(guān)系的可測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物定量測(cè)定的分析儀器.與傳統(tǒng)分析方法相比，酶生物傳感輯是由固定化的生物敏感膜和與之密切結(jié)合的換能系統(tǒng)組成，它把固化酶和電化學(xué)傳感器結(jié)合在一起，因而具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：(1)它既有不溶性酶體系的優(yōu)點(diǎn)

3、，又具有電化學(xué)電極的高靈敏度;(2)由于酶的專屬反應(yīng)性，使其具有高的選擇性，能夠直接在復(fù)雜試樣中進(jìn)行測(cè)定.因此，酶生物傳感器在生物傳感器領(lǐng)域中占有非常重要的地位. 生物傳感器具有多樣性、無試劑分析、操作簡(jiǎn)便、靈敏、快速、價(jià)廉、可重復(fù)連續(xù)使用等特點(diǎn),已在食品發(fā)酵工業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、軍事科學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出十分廣闊的應(yīng)用前景4-9。2酶生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)酶生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)單元是由物質(zhì)識(shí)別元件(固定化酶膜)和信號(hào)轉(zhuǎn)換器(基體電極)組成.當(dāng)酶膜上發(fā)生酶促反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生的電活性物質(zhì)由基體電極對(duì)其響應(yīng).基體電極的作用是使化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，從而加以檢測(cè)，基體電極可采用碳質(zhì)電極(石噩電板、玻碳電極、

4、碳棚電極)、R電極及相應(yīng)的修飾電極.3酶生物傳感器的分類生物傳感器按換能方式可分為電化學(xué)生物傳感器和光化學(xué)生物傳感器2種。3.1電化學(xué)酶?jìng)鞲衅骰陔娮用浇轶w的葡萄糖傳感器,具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性好、壽命長(zhǎng)、抗干擾性能好等優(yōu)點(diǎn),尤為受到重視。二茂鐵由于有不溶于水、氧化還原可逆性好、電子傳遞速率高等優(yōu)點(diǎn),得到了廣泛的研究和應(yīng)用。目前研究的重點(diǎn)是防止二茂鐵等電子媒介體的流失,從而提高生物傳感器的穩(wěn)定性和壽命。提高傳感器穩(wěn)定性的主要方法是利用環(huán)糊精作為載體,形成主客體結(jié)構(gòu)。如孫康等10以-環(huán)糊精與戊二醛縮合而成的聚合物(-CDP)為主體,電子媒介體二茂鐵為客體,形成穩(wěn)定的包絡(luò)物,制成了葡萄糖

5、、乳糖生物傳感器。再如朱邦尚等10以電子媒介體1,1-二甲基二茂鐵為客體與-CDP形成穩(wěn)定的主客體包絡(luò)物。利用二茂鐵也可以制成組織傳感器。如馬全紅等12以二茂鐵為電子媒介體,將含有豐富酪氨酸酶的蘑菇組織肉漿固定在二茂鐵(PVC膜)修飾石墨電極上制成酶電極。其對(duì)L-酪氨酸的線性響應(yīng)范圍為2.0×10-44.5×10-3mol/L,響應(yīng)時(shí)間小于5 min,電極壽命至少30 d,可用于實(shí)際樣品分析。提高傳感器穩(wěn)定性的另一種方法是在電極表面覆蓋一層Nafion膜。如賈能勤等13以基于絲網(wǎng)印刷技術(shù)制作的碳糊電極為基底電極,用二茂鐵為電子媒介體,Nafion修飾厚膜碳糊電極制成了葡萄糖

6、傳感器。Nafion膜既可以防止二茂鐵的流失,又可以防止抗壞血酸、尿酸的干擾,具有防污能力。該傳感器的檢測(cè)上限可達(dá)18 mmol/L,響應(yīng)時(shí)間小于60s。二茂鐵及其衍生物對(duì)抗壞血酸具有催化作用,易受抗壞血酸的干擾。而N-甲基吩嗪則可以消除抗壞血酸等的干擾。李海虹等14通過交聯(lián)方式將辣根過氧化物酶(HRP)固定在Eastman-AQN-甲基吩嗪修飾電極上,制成過氧化氫生物傳感器。將它與GOD和半乳糖苷酶結(jié)合,制成雙酶和三酶體系的生物傳感器,用于葡萄糖和乳糖的測(cè)定。王朝瑾15利用N-甲基吩嗪作為媒介體,通過牛血清白蛋白和戊二醛使其結(jié)合到玻碳電極上制成了HRP生物傳感器。該酶電極對(duì)H2O2有良好的響

7、應(yīng),對(duì)H2O2的線性范圍為1×10-65×10-4mol/L,檢出限為10-7mol/L,響應(yīng)時(shí)間小于10 s。鋨配合物也是一種有效的電子媒介體。龔毅等16研究了鋨-聚乙烯吲哚Os(bpy)2(PVI)10ClCl配位聚合物和Nafion雙層膜修飾玻碳電極的電化學(xué)特性,該膜對(duì)腎上腺素的電化學(xué)氧化有催化作用,對(duì)腎上腺素的線性范圍為1.0×10-68.6×10-5mol/L,相關(guān)系數(shù)為0.9987。此外,常用的媒介體還有苯醌、對(duì)苯二酚和甲苯胺蘭等。3.2光化學(xué)酶?jìng)鞲衅魉握A等將具有分子識(shí)別功能的-葡萄糖甙酶和能進(jìn)行換能反應(yīng)的Luminol分別固定在殼質(zhì)胺和大

8、孔陰離子交換劑的柱中,組成流動(dòng)注射系統(tǒng)。苦杏仁甙在-葡萄糖甙酶催化下分解生成的CN-(分子識(shí)別反應(yīng))與溶解氧反應(yīng)生成超氧陰離子自由基,繼而同Luminol反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(換能反應(yīng))。這一新型生物傳感器的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與苦杏仁甙量在1200g之間呈良好線性關(guān)系,檢出限為0.3g,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%,并具有良好選擇性。李瑛等首次以碳糊為固定化載體,將GOD固定在碳糊電極上,制成了光導(dǎo)纖維電化學(xué)發(fā)光葡萄糖生物傳感器。葡萄糖的酶催化反應(yīng)、魯米諾的電化學(xué)氧化和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可以在電極表面同時(shí)發(fā)生。該傳感器制作簡(jiǎn)單,響應(yīng)時(shí)間僅為10 s,線性范圍寬,葡萄糖濃度在1.0×10-52.0×

9、;10-2mol/L范圍內(nèi)與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系,檢出限為6.4×10-6mol/L,可應(yīng)用于市售飲料中葡萄糖的測(cè)定。4酶生物傳感器的工作原理 當(dāng)酶電極漫入被測(cè)溶液，待測(cè)底物進(jìn)入酶層的內(nèi)部并參與反應(yīng)，大部分酶反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生或消耗一種可植電極測(cè)定的物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，電話性物質(zhì)的濃度可以通過電位或電流模式進(jìn)行測(cè)定.因此，酶生物傳.器可分為電位型和電流型兩類傳感器.電位型傳感輯是指酶電極與參比電極間輸出的電位信號(hào)，它與被測(cè)物質(zhì)之間服從能斯特關(guān)系.而電流型傳感器是以酶促反應(yīng)所引起的物質(zhì)量的變化轉(zhuǎn)變成電流信號(hào)輸出，輸出電流大小直接與底物濃度有關(guān).電流型傳.器與電位型傳感器相比較具有更簡(jiǎn)單、直

10、觀的效果.5酶生物傳感器的發(fā)展5.1第一代酶生物傳感器第一代酶生物傳感器是以氧為中繼體的電催化。缺點(diǎn)是：(1)響應(yīng)信號(hào)與氧分壓或溶解氧關(guān)系較大，溶解氧的變化可能引起電極響應(yīng)的波動(dòng)；(2)由于氧的糟解度有限，當(dāng)溶解氧貧乏時(shí)，難以對(duì)高含量底物進(jìn)行測(cè)定；(3)當(dāng)由酶促反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫以足夠高的濃度存在時(shí)，可能會(huì)使很多酶去活化；(4)需采用較正的電位，抗壞血酸和尿酸等電活性物質(zhì)也會(huì)披氧化，產(chǎn)生干擾信號(hào).5.2第二代酶生物傳感器為了改進(jìn)第一代酶生物傳感器的缺點(diǎn)，現(xiàn)在普遍采用的是第二代酶生物傳感器。第二代生物傳感器采用了含有電子媒介體的化學(xué)修飾層.此化學(xué)修飾層不僅能促進(jìn)電子傳遞過程，使得響應(yīng)的線性范圍拓

11、寬，電極的工作電位降低，同時(shí)，噪聲、背景電流及干擾信號(hào)均小，且由于排除了過氧化氫，使得酶生物傳感器的工作壽命延長(zhǎng).電子媒介體在近十年以來得到迅速發(fā)展，使用的媒介體種類也越不越多。5.3第三代酶生物傳感器 第三代酶生物傳感器是酶與電極間進(jìn)行直接電子傳遞，是生物傳感器構(gòu)造中的理想手段.這種傳感器與氧或其它電子受體無關(guān)，無需媒介體，即所謂無媒介體傳感器，但由于酶分子的電話性中心深埋在分子的內(nèi)部，且在電極表面吸附后易發(fā)生變形，使得酶與電極間難以進(jìn)行直接電子轉(zhuǎn)移，因此采用這種方法制作生物傳感器有一定難度.到目前為止，只發(fā)現(xiàn)過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、醋氨酸酶、細(xì)胞色素C過氧化物酶、超氧化物歧化酶、黃嘿嶺氧

12、化酶、微過氧化物酶等少數(shù)物質(zhì)能在合適的電板上進(jìn)行直接電催化.6酶?jìng)鞲衅髦袘?yīng)用的新技術(shù)6.1納米技術(shù)固定化酶時(shí)引入納米顆粒能夠增加酶的催化活性,提高電極的響應(yīng)電流值。首先,納米顆粒增強(qiáng)GOD在載體表面上的固定作用;其次是定向作用,分子在定向之后,其功能會(huì)有所改善;第三,由于金、鉑納米顆粒具有良好的導(dǎo)電性和宏觀隧道效應(yīng),可以作為固定化酶之間、固定化酶與電極之間有效的電子媒介體,從而使得GOD的氧化還原中心與鉑電極間通過金屬顆粒進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移成為可能,酶與電極間可以近似看作是一種導(dǎo)線來聯(lián)系的。這樣就有效地提高了傳感器的電流響應(yīng)靈敏度。孟憲偉等17首次研究了二氧化硅和金或鉑組成的復(fù)合納米顆粒對(duì)葡萄糖生物

13、傳感器電流響應(yīng)的影響,其效果明顯優(yōu)于這3種納米顆粒單獨(dú)使用時(shí)對(duì)葡萄糖生物傳感器的增強(qiáng)作用。其原因是納米粒子具有吸附濃縮效應(yīng)、吸附定向和量子尺寸顆粒效應(yīng),復(fù)合納米顆粒比單獨(dú)一種納米顆粒更易于形成連續(xù)勢(shì)場(chǎng),降低電子在電極和固定化酶間的遷移阻力,提高電子遷移率,有效地加速了酶的再生過程,因此復(fù)合納米顆?？梢燥@著增強(qiáng)傳感器的電流響應(yīng)6.2基因重組技術(shù)周亞鳳等18將黑曲霉GOD基因重組進(jìn)大腸桿菌、酵母穿梭質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化甲基營(yíng)養(yǎng)酵母,構(gòu)建出GOD。GOD力達(dá)426.63 u/mg蛋白,是商品黑曲霉GOD的1.6倍,催化效率更高。重組酵母GOD的高活力特性可有效提高葡萄糖傳感器的線性檢測(cè)范圍。6.3溶膠-凝膠技

14、術(shù)溶膠-凝膠應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域具有如下一些優(yōu)點(diǎn)19:(1)基質(zhì)在可見光區(qū)是透明的,適于光化學(xué)生物傳感器的制作;(2)基質(zhì)具有一定的剛性,提高了生物活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性;(3)基質(zhì)熱穩(wěn)定性好,并且呈化學(xué)惰性,對(duì)生物活性物質(zhì)的失活作用很小,保持了活性;(4)通過溶膠-凝膠制備條件的優(yōu)化,可控制基質(zhì)的孔徑大小和分布,使酶分子有足夠的自由活動(dòng)空間而又不至于從基質(zhì)中流失,從而提高傳感器的使用壽命;(5)溶膠-凝膠材料還具有生物相容性,為微電極植入人體提供了新的可能性;(6)還可通過對(duì)先驅(qū)體的功能化賦予溶膠-凝膠新的性能;(7)溶膠-凝膠的制備條件十分溫和,生物分子可以在不同的制備階段加入,并且可以制成不

15、同大小與形狀的修飾電極等。溶膠-凝膠材料作為酶固定化載體,開辟了制備生物傳感器的新領(lǐng)域。以溶膠-凝膠技術(shù)固定生物活性物質(zhì)的生物傳感器的基本構(gòu)型有電極型生物傳感器和導(dǎo)波傳感器等。有關(guān)溶膠-凝膠法制作生物傳感器的文章多見報(bào)道,但大多處于實(shí)驗(yàn)室階段。5.4提高傳感器綜合性能的其他技術(shù)提高固定化酶活力的根本方法是保持酶的空間構(gòu)象不發(fā)生改變。如唐芳瓊等考察了磺基琥珀酸雙2-乙基己基酯鈉鹽(AOT)反膠束包埋酶對(duì)GOD構(gòu)象和化活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨GOD/AOT比值的減小,響應(yīng)電流大大增加,這意味著大大增加了酶的催化活性和酶構(gòu)象的穩(wěn)定性。原因是表面活性劑可以保護(hù)酶的構(gòu)象不被破壞,進(jìn)而保護(hù)酶的催化活性,使酶

16、電極的電流響應(yīng)具有穩(wěn)定性和寬的響應(yīng)范圍。改變“手臂”分子長(zhǎng)度是獲得固定化酶高活力的主要方法。如周祖新通過更換烷基化試劑,即用三乙基氧嗡四氟化硼代替硫酸二甲酯,使固定化過氧化氫酶膜的性能有很大改善。原因是前者的“手臂”分子長(zhǎng),與其他欲連接的基團(tuán)接觸容易,最后使單位面積上固定化酶的數(shù)目增加,性能良好。制備多電子媒介體和聯(lián)酶的生物傳感器也是提高生物傳感器綜合性能的重要方法。如郭鼎力等31研制了以四氰二甲苯醌等和四甲聯(lián)苯胺等為介體的雙介體多酶生物催化-氧化還原體系構(gòu)成的電流型生物傳感系統(tǒng),具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、取樣少、測(cè)量迅速的夾心式生物傳感器。該傳感器對(duì)正常到高度異常的血糖含量,測(cè)量相對(duì)誤差是3.

17、9%7.5%,相關(guān)系數(shù)為0.9881;而對(duì)膽固醇的測(cè)量相對(duì)誤差和相關(guān)系數(shù)分別為5.8%7.6%和0.9549。7結(jié)束語酶生物傳感器自產(chǎn)生以后得到了迅速發(fā)展20,實(shí)現(xiàn)酶氧化還原活性中心與電極之間的直接電子傳遞是發(fā)展第三代酶生物傳感器的研究重點(diǎn)之一,此問題的關(guān)鍵是要縮短電子隧道距離。就目前酶生物傳感器的發(fā)展來看,由電化學(xué)法控制有機(jī)導(dǎo)電高分子材料制作酶生物傳感器,是一種很有發(fā)展前途的酶生物傳感器;通過納米復(fù)合材料來增強(qiáng)酶生物傳感器的響應(yīng)信號(hào)和穩(wěn)定性也是一種行之有效的方法。但這2種研究均處于初步階段,還需要對(duì)它們進(jìn)行大量的研究工作。如果能將這2種方法有效地結(jié)合起來,可能會(huì)推動(dòng)第三代生物傳感器的研究。例

18、如:在導(dǎo)電單體成膜之前,探討在合適條件下,向底液中加入改性的納米二氧化硅粒子,通過電化學(xué)法有效地控制電極上導(dǎo)電復(fù)合材料膜的厚度,同時(shí),利用納米二氧化硅大的比表面積具有吸附生物酶的特性,實(shí)現(xiàn)響應(yīng)速度快的第三代酶生物傳感器的研制。參考文獻(xiàn)：1司士輝.生物傳感器M.第一版.北京:化學(xué)工業(yè)出社,2003:1.2 Clark L C, Lyons C. Electrode systems for continuousmonitoringin cardinovascular surgeryJ.AnnNYAcad Sc,i 1962, 102: 29.3 Updike S J,HicksG P. The e

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