甘草酸苷對(duì)急性肝壞死小鼠腸分泌成分表達(dá)減少的影響及機(jī)制

1、甘草酸苷對(duì)急性肝壞死小鼠腸分泌成分表達(dá)減少的影響及機(jī)制目的急性肝壞死(acute liver failure, ALF) 時(shí)繼發(fā)的感染主要由腸道細(xì)菌易位所致, 而腸道免疫屏障遭到破壞是發(fā)生腸道細(xì)菌易位的重要原因。分泌成分 (secretory component, SC) 是多聚免疫球蛋白受體(polymeric Igreceptor, pIgR)的胞外段部分,主要負(fù)責(zé)pIgA的轉(zhuǎn)運(yùn)和SIgA曲形成,在維護(hù)腸 粘膜免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，ALF時(shí)腸道pIgR/SC表達(dá)減少， 從而可導(dǎo)致SIgA分泌合成的減少，使其不能正常地在粘膜表面形成完整的SIgA屏障層 , 而導(dǎo)致腸源性感染的

2、發(fā)生甘草酸苷(glycyrrhizin), 是甘草類(lèi)制劑的典型代表藥物, 具有抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏及類(lèi)固醇激素樣作用, 被廣泛用于治療肝病及皮膚病等領(lǐng)域，是否glycyrrhizin能影響肝壞死時(shí)腸SC的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)肝壞死模型觀察 glycyrrhizin預(yù)先保護(hù)組小鼠腸道SC表達(dá)變化探索glycyrrhizin在預(yù)防急性肝壞死小鼠腸道SC表達(dá)減少中的作用，通過(guò)觀察人結(jié)腸上皮細(xì)胞系Caco-2 在 glycyrrhizin 或在聯(lián)合糖皮質(zhì)激素受體抑制劑(RU486)的作用下，細(xì)胞內(nèi)SC蛋白和SC mRNA勺表達(dá)情況以及glycyrrhizin 對(duì) SC啟動(dòng)子活性,SC啟動(dòng)子結(jié)合轉(zhuǎn)

3、錄因子-上游刺激因子(USF)的影響，探討 glycyrrhizin 影響SC表達(dá)的作用機(jī)制，為研究預(yù)防及治療肝壞死時(shí)腸粘膜免疫 功能失調(diào)提供新的途徑和理論依據(jù)。材料與方法一、材料1、動(dòng)物：雄性Balb/c小鼠,6-8周，體重18-25克。2、細(xì)胞：Caco-2細(xì)胞。3、試劑：GalN;LPS (Ecoli O127:B8); Glycyrrhizin; 山羊抗小鼠pIgR/SC 抗體；小鼠抗小鼠B -actin單克隆抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊二抗；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo) 記兔抗小鼠二抗；兔抗山羊 SP試劑盒；BCAS白濃度測(cè)定液；SYBR RPrimeScriptTM RT-PCR Kit試

4、劑盒；DEX山羊抗人pIgR/SC抗體；兔抗人 B -actin多克隆抗體；兔抗人USF1多克隆抗體；兔抗人USF2克隆抗體；辣 根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊二抗；FITC標(biāo)記兔抗山羊二抗；胎牛血清；DMSO; RU486二、方法1、動(dòng)物分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 為雄性Balb/c小鼠，隨機(jī)分為5組。1組：生理鹽水(NS)對(duì)照組60只；2組： 脂多糖(LPS)對(duì)照組60只；3組：D氨基半乳糖(GalN)對(duì)照組60只；4組：急 性肝壞死(ALF)模型組60只；5組：Glycyrrhizin預(yù)保護(hù)組(LPS/GalN/glycyrrhizin) 60 只。2、細(xì)胞培養(yǎng)及分組：參照

5、Liu 等的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。觀察濃度影響：取 6組非同代生長(zhǎng)達(dá)融合的細(xì)胞，分別添加 0 a g/mL,4 a g/mL,20 a g/mL, 100 a g/mL 500 a g/mL,1000 a g/mL glycyrrhizin 培養(yǎng)24h,提取總蛋白和總RNA-130c保存；觀察時(shí)間影響：取 5組非同代生 長(zhǎng)達(dá)融合的細(xì)胞，以 100N g/mL glycyrrhizin分別處理 0h、4h、8h、16h、24h,收集Caco-2細(xì)胞爬片甲醛固定及提取總蛋白和總 RNA130c保存；取6組非 同代生長(zhǎng)達(dá)融合的細(xì)胞，添加RU486 (50nMX合20 g/mL glycyrrhizin

6、或 100nM DEXft培養(yǎng)24h,收集Caco-2細(xì)胞提取總蛋白和總 RNA130c保存。3、 應(yīng)用HE染色觀察肝臟病理改變和電鏡觀察腸組織病理變化。4、應(yīng)用免疫組化染色、 western blot 和 real-time PCR 方法觀察glycyrrhizin 對(duì)急性肝壞死小鼠腸道SC表達(dá)下降的影響。5、應(yīng)用免疫熒光染色、western blot和realtime PCR方法檢測(cè)glycyrrhizin 對(duì)Caco-2細(xì)胞SC蛋白及 mRNA!達(dá)的影響。6、應(yīng)用western blot 和 real-time PCR 方法研究糖皮質(zhì)激素受體抑制劑（RU486）對(duì)glycyrrhizin

7、上調(diào)腸上皮細(xì)胞SC表達(dá)的影響。7、將重組質(zhì)粒PGL2-SC promoter轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá) 活性，說(shuō)明glycyrrhizinXt SC基因啟動(dòng)子活性的影響。8、應(yīng)用western blot和real-time PCR 方法研究上游刺激因子（USF）及其mRNAg達(dá)，說(shuō)明 glycyrrhizin是否通過(guò)影響USFS達(dá)影響SC基因啟動(dòng)子活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、肝臟HE染色觀察：NS組肝細(xì)胞完整，肝血竇清晰；ALF模型組可見(jiàn)呈片的出血性 壞死，壞死區(qū)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞，殘存的肝細(xì)胞月中脹；glycyrrhizin預(yù)保護(hù)組肝臟出血壞死明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少

8、。2、腸組織電鏡觀察：NS組腸上皮 細(xì)胞膜完整，微絨毛排列整齊，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)正常；ALF模型組可見(jiàn)腸上皮細(xì)胞結(jié) 構(gòu)破壞，微絨毛稀疏、斷裂、脫落，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，線(xiàn)粒體空泡變形，崎破壞 消失；glycyrrhizin預(yù)保護(hù)組腸上皮微絨毛僅有少量脫落，線(xiàn)粒體空泡變形明顯減輕，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較完整。3、腸組織pIgR/SC免疫組化染色：PIgR/SC表達(dá) 主要定位于腸上皮細(xì)胞胞漿和胞膜上。PIgR/SC染色可見(jiàn)NS組呈棕黃色強(qiáng)陽(yáng) 性；ALF模型組小鼠腸組織上皮細(xì)胞漿和膜棕黃色陽(yáng)性染色明顯減弱，甚至難見(jiàn);glycyrrhizin預(yù)先保護(hù)組腸組織腸上皮細(xì)胞漿和膜上呈棕黃色陽(yáng)性。4、腸組織SC蛋白表達(dá)west

9、ern blot半定量分析：ALF模型組SC表達(dá)較對(duì)照組明 顯降低（P < 0.05）, glycyrrhizin預(yù)先保護(hù)組能有效預(yù)防急性肝壞小鼠SC表達(dá)減少，與ALF模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）5、腸組織SC mRN相對(duì)含量 real-time PCR 方法檢測(cè)：ALF組中,SC mRNA勺表達(dá)量明顯減少，與NS組有顯 著差異（P0.05）。10、螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)SC基因啟動(dòng)子活性：Glycyrrhizin處理后海腎熒光素酶活性無(wú)明顯改變,4h就可以看螢火蟲(chóng)熒光素酶活性明顯增高，4h、8h、16h、24h組與對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）, 與對(duì)照組相比，各

10、組細(xì)胞USF1及USF2 mRNA達(dá)也均未見(jiàn)明顯變化（P>0.05）。 結(jié)論1. Glycyrrhizin可以有效預(yù)防肝壞死小鼠腸上皮細(xì)胞損傷；2.Glycyrrhizin 可以有效預(yù)防肝壞死小鼠腸 SC蛋白表達(dá)減少，改善肝壞死小鼠腸 粘膜免疫穩(wěn)態(tài)失調(diào)，從而保護(hù)腸粘膜上皮細(xì)胞損傷；3. Glycyrrhizin 誘導(dǎo)了肝 壞死小鼠腸SC基因表達(dá)，使SC蛋白合成增加；4. Glycyrrhizin 使得Caco-2 細(xì)胞pIgR/SC陽(yáng)性細(xì)胞比例及pIgR/SC熒光強(qiáng)度增加；5. Glycyrrhizin 劑量 依賴(lài)性及時(shí)間依賴(lài)性上調(diào) Caco-2細(xì)胞SC蛋白表達(dá)；6. Glycyrrhi

11、zin 通過(guò)誘 導(dǎo)Caco-2細(xì)胞SC mRNAK平，增加SC蛋白表達(dá)；7. Glycyrrhizin 上調(diào)腸上皮 細(xì)胞SC表達(dá)并非通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體；8. Glycyrrhizin 可通過(guò)增強(qiáng)SC基因 啟動(dòng)子活性來(lái)誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞SC mRN照錄，促使SC蛋白表達(dá)增加；9.Glycyrrhizin并非通過(guò)上調(diào)上游刺激因子（USF）的表達(dá)增強(qiáng)SC基因啟動(dòng)子活性。同主題文章' 1.吳俊玲.人臍血移植的小鼠模型J. 國(guó)外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè). 1998.（01）2 .利用復(fù)發(fā)性尿路感染建立PBC小鼠模型'J.現(xiàn)代醫(yī)院.2008.（08）3 .高春芳.系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型的研究近況J. 國(guó)外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊(cè).1995.(04)4 .孔琪.表達(dá)人源VEGF-A、鼠模型的建立及抗VEGF®：體研究J. 中 國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào).2007.(02)5 .趙國(guó)際，楊郁菁，張瑞忠，顧堅(jiān)忠，徐平.疑似白內(nèi)障小鼠模型培育初報(bào)J.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué).2008.(03)6 .趙國(guó)際，楊郁菁，張瑞忠，顧堅(jiān)忠，徐平，鮑世民.遺傳性BALB/c白內(nèi)障 小鼠模型培育初報(bào)J. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志.2009.(08)7 .生物醫(yī)學(xué)研究應(yīng)慎用小鼠模型J. 廣西科學(xué).2008.(02)8 .寶福凱.在小鼠模型中探索多發(fā)性硬化的治療'J.生理科學(xué)進(jìn)展.1995.(02