2019實(shí)驗(yàn)八不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳ppt課件

1、http:/ 分離膠的配制分離膠的配制http:/ 5http:/ 濃縮膠的配制濃縮膠的配制http:/ 安裝、加樣、電泳安裝、加樣、電泳http:/ 2.1 電泳的概念電泳的概念http:/ 2.2 電泳的基本原理電泳的基本原理http:/ 2.3 電泳分離蛋白質(zhì)的原理電泳分離蛋白質(zhì)的原理http:/ 實(shí)驗(yàn)室中常用到的電泳方法實(shí)驗(yàn)室中常用到的電泳方法 （以介質(zhì)分類(lèi)）（以介質(zhì)分類(lèi)）http:/ 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠電泳原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)，簡(jiǎn)稱(chēng)PAGE)是以聚是以聚丙烯酰胺凝膠作為

2、支持介質(zhì)的一種常用丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。電泳技術(shù)。 1、聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和、聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲基雙丙烯酰胺聚合而形成的三維網(wǎng)狀甲基雙丙烯酰胺聚合而形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，聚合過(guò)程由自由基催化完成。結(jié)構(gòu)，聚合過(guò)程由自由基催化完成。 2、催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)、催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法。聚合法和光聚合法。 (1)在化學(xué)聚合過(guò)程中，以過(guò)硫酸銨在化學(xué)聚合過(guò)程中，以過(guò)硫酸銨AP為催化劑，以四甲基乙二胺為催化劑，以四甲基乙二胺TEMED為加速劑為加速劑, TEMED催化催化AP產(chǎn)生自由基；產(chǎn)生自由基； (2)在光聚合過(guò)程中，以核黃素

3、為催化劑，在光聚合過(guò)程中，以核黃素為催化劑，光催化核黃素產(chǎn)生自由基。自由基引發(fā)光催化核黃素產(chǎn)生自由基。自由基引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲基雙丙烯酰丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲基雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲基鍵交聯(lián)，從胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲基鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。http:/ 聚丙烯酰胺凝膠的特性聚丙烯酰胺凝膠的特性(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；在很多溶劑中不溶；(3)對(duì)對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；和溫度變化較穩(wěn)

4、定；(4)幾乎無(wú)吸附和電滲作用，只要幾乎無(wú)吸附和電滲作用，只要Acr純度高，純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過(guò)改變單體及交聯(lián)劑的選擇合適的濃度，通過(guò)改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電

5、泳、瓊脂糖電泳等有更高的分酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。辨率。http:/ 聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類(lèi)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類(lèi)1. 根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為：根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為：（1連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng) （2不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳

6、動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。 2. 根據(jù)蛋白質(zhì)樣品變性與否，分為：根據(jù)蛋白質(zhì)樣品變性與否，分為：（1變性電泳變性電泳也就是也就是SDS-PAGE，蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)失去二三級(jí)結(jié)構(gòu)；失去二三級(jí)結(jié)構(gòu)；（2非變性電泳非變性電泳 蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開(kāi)。及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開(kāi)。3.根據(jù)電泳槽體系的類(lèi)型，分為：根據(jù)電泳槽體系的類(lèi)型，分

7、為： （1圓盤(pán)電泳圓盤(pán)電泳（2板狀電泳板狀電泳兩者電泳原理完全相同。兩者電泳原理完全相同。 http:/ SDS-PAGE SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開(kāi)蛋白質(zhì)。該技術(shù)僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開(kāi)蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由最初由shapiroshapiro于于19671967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小可以忽略電荷因素），其原理在于：子量的大小可以忽略電荷因素），其原理在

8、于：1.1.去電荷：由于去電荷：由于SDSSDS十二烷基硫酸鈉產(chǎn)生的十二烷基硫酸根帶負(fù)電，十二烷基硫酸鈉產(chǎn)生的十二烷基硫酸根帶負(fù)電，使各種蛋白質(zhì)使各種蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過(guò)了蛋復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原的電荷量，白質(zhì)分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別；因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別； 2.2.破壞結(jié)構(gòu)：破壞結(jié)構(gòu)：SDSSDS能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中白分子的

9、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會(huì)形成分別對(duì)應(yīng)于各個(gè)亞基的幾條帶；可能會(huì)形成分別對(duì)應(yīng)于各個(gè)亞基的幾條帶； 3.3.統(tǒng)一構(gòu)象：統(tǒng)一構(gòu)象：SDSSDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合復(fù)合物形成近似物形成近似“雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDSSDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣，約為度都一樣，約為18A18A； 這樣的蛋白質(zhì)這樣的蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原來(lái)的復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原來(lái)的電荷和形狀的影響，而取決

10、于分子量的大小。電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小。SDS-PAGESDS-PAGE的原理的原理http:/ 4.1 不連續(xù)不連續(xù)PAGEPAGE的原理的原理http:/ 不連續(xù)體系的組份不連續(xù)體系的組份 不連續(xù)體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液所不連續(xù)體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液所組成。組成。1. 濃縮膠是由核黃素催化聚合而成的大孔膠，濃縮膠是由核黃素催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為凝膠緩沖液為pH6.7的的Tris-HC1。2. 分離膠是由分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為緩沖液為pH8.9 Tris-HC1。3. 電極緩沖液是電極緩沖液是p

11、H8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。甘氨酸緩沖液。 2種孔徑的凝膠、種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、種緩沖體系、3種種pH值使不值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。http:/ 樣品濃縮效應(yīng)樣品濃縮效應(yīng)1.凝膠孔徑不連續(xù)性；凝膠孔徑不連續(xù)性；2.緩沖體系離子成分及緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；值的不連續(xù)性；在在pH6.7的凝膠緩沖體系中的凝膠緩沖體系中 前導(dǎo)離子或快離子：前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根解離出的氯根(C1-) 尾隨離子尾隨離子(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根或慢離子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，代表氯根，P代代表蛋白質(zhì)，表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根代表甘氨酸根)有效遷移率有效遷移率=m，m為遷移率，為遷移率，為解離度為解離度)當(dāng)進(jìn)入當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，的分離膠時(shí)，甘