實(shí)驗(yàn)十微生物的生理生化反應(yīng)

1、實(shí)驗(yàn)九、十微生物的生理生化反應(yīng)一、目的要求 1.了解細(xì)菌的一般生化反應(yīng)； 2.了解細(xì)菌的生化鑒定方法其原理。 二、實(shí)驗(yàn)材料 菌種：大腸桿菌；枯草桿菌；變形桿菌；自己分離的大腸桿菌。 培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖）(紫色液體內(nèi)帶指管）； H2S試驗(yàn)用培養(yǎng)基（黃色固體）； 蛋白胨水培養(yǎng)基（黃色液體，吲哚試驗(yàn)用）； 淀粉培養(yǎng)基（黃色固體需融化倒平板）； 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（黃色液體，甲基紅，VP試驗(yàn)用）*。試劑：吲哚試劑；碘液；甲基紅試劑；VP試劑。三、實(shí)驗(yàn)原理及方法 由于各種微生物的新陳代謝類型不同，因此，對各種物質(zhì)利用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，我們可以用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，這種反應(yīng)

2、稱為生化反應(yīng)。 生化反應(yīng)常用來鑒別在形態(tài)或其它方面不易區(qū)別的微生物，例如：腸道細(xì)菌中，大腸桿菌和傷寒桿菌，二者在形態(tài)上不易區(qū)分，但前者能發(fā)酵乳糖，后者不能。因此可以從它們能否發(fā)酵乳糖來區(qū)別它們，所以微生物的生化反應(yīng)是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。 1.糖發(fā)酵試驗(yàn)： 糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要，絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為能源及碳源，但是細(xì)菌的分解糖類的能力上有相當(dāng)大的差異，某些菌能使某些單糖或雙糖分解，并產(chǎn)酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（甲烷、氫、二氧化碳），或者只產(chǎn)酸而不產(chǎn)生氣體。酸和氣體的產(chǎn)生與否，可以由培養(yǎng)后試管指示劑的顏色變化和小套管內(nèi)氣泡的有無來判定。當(dāng)發(fā)

3、酵產(chǎn)酸時(shí)，指示劑溴甲酚紫由紫色（pH6.8）變?yōu)辄S色（pH5.2）。其步驟如下： （1）取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管四支（內(nèi)裝有小套管），一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，作空白對照。在各試管上標(biāo)明菌名和組別，置37培養(yǎng)24小時(shí)觀察。大腸桿菌、自己分離的大腸桿菌、枯草桿菌、對照。 （2）觀察結(jié)果：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色者表示為陽性，同時(shí)觀察小套管中有無氣泡產(chǎn)生?！? +”表示產(chǎn)酸；“”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；“- -”表示陰性。 2 2吲哚試驗(yàn) 某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚。吲哚與對二甲基氨苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，此為紅色化合物，其反應(yīng)變化如下：

4、（1 1）取蛋白胨水培養(yǎng)基試管四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上注明菌名和組別，置3737培養(yǎng)2424小時(shí)。 （2 2）培養(yǎng)后取出，在培養(yǎng)液中先加入乙醚約1 1毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時(shí)再沿管壁慢慢加入吲哚試劑5 51010滴，觀察有無紅色出現(xiàn)。有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽性，黃色者為陰性。 （注意：加入試劑后不可再搖動，否則被混合，紅色不明顯。） 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。3 3產(chǎn)硫化氫試驗(yàn) 某些菌能分解含硫的有機(jī)物或無機(jī)物產(chǎn)生硫化氫（H H2 2S S），H H

5、2 2S S遇金屬鹽類，如鉛鹽、鐵鹽等，則形成黑色的硫化鉛或硫化鐵的沉淀物。從而可斷定H H2 2S S的產(chǎn)生與否。 其測定方法有兩種： 一種是用含有檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，看是否有黑色沉淀（本實(shí)驗(yàn)采用）； 另一種是在盛有液體培養(yǎng)基的試管中接種菌以后，在試管的棉塞下吊一片醋酸鉛試紙，經(jīng)培養(yǎng)后看醋酸鉛試紙是否變黑。其步驟如下： （1 1）取H H2 2S S試驗(yàn)用培養(yǎng)基四支（內(nèi)含有檸檬酸鐵銨），分別用穿刺法接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌和變形桿菌，留一支空白，試管上注明菌名和組別，置3737培養(yǎng)2424小時(shí)。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，變形桿菌，空白對照。（2 2）培養(yǎng)后取出觀察，看有

6、無黑色沉淀產(chǎn)生。4 4伏一普（Voges-proskauerVoges-proskauer）試驗(yàn)， 即V VP P反應(yīng)某些菌生長于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸又可縮合、脫羧而轉(zhuǎn)化成乙酰甲基甲醇，如加入強(qiáng)堿液，即與空氣中的氧起作用產(chǎn)生二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的含胍基成分作用生成紅色化合物，稱陽性反應(yīng)，沒有紅色化合物產(chǎn)生則稱陰性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟：（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上注明菌名和組別。置3737培養(yǎng)2424小時(shí)。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。（2 2）培養(yǎng)后取出，

7、加入5-105-10滴40%KOH40%KOH及等量的V VP P試劑液，用 力振蕩，放置3737溫室15-3015-30分鐘，呈紅色者為陽性，不呈 紅色者為陰性。 5 5甲基紅試驗(yàn)（M MR R試驗(yàn)） 某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能產(chǎn)生大量的酸，使pHpH降低至4 45 5，它先產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、乳酸等。酸的產(chǎn)生可由加入甲基紅指示劑的變色而指示（有效pHpH范圍為4.24.26.36.3）。 細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液由原來的桔黃色，變?yōu)榧t色，即為甲基紅反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)步驟： （1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接

8、枯草桿菌，第四支不接種，作空白對照。在各試管上標(biāo)明菌名和組別，置37培養(yǎng)24小時(shí)。大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。（2 2）培養(yǎng)后取出，沿管壁加入甲基紅指示劑3 34 4滴上層呈紅色者為陽性。 6 6淀粉水解試驗(yàn) 某些細(xì)菌可以產(chǎn)生能水解培養(yǎng)基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細(xì)菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。 實(shí)驗(yàn)步驟： （1 1）淀粉培養(yǎng)基在水浴中融化后，冷至5050，以無菌操作制成平板。用接種環(huán)取少量枯草桿菌在平板的一邊劃“+ +”字形接種（或點(diǎn)種），另取少量大腸桿菌菌在平板的另一邊接種，在各培養(yǎng)皿底部標(biāo)明菌名和組別。置3737溫箱中培養(yǎng)1

9、6162020小時(shí)。大腸桿菌，枯草桿菌。 （2 2）觀察結(jié)果：打開皿蓋，滴加少量碘液于培養(yǎng)基上，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使碘液均勻鋪滿整個平板。如果在菌周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉被水解。透明圈大小說明該菌水解淀粉能力的大小。 五、結(jié)果與思考題1 1將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填于書P120P120表中試驗(yàn)結(jié)果：“+ +”表示陽性反應(yīng)；“- -”表示陰性反應(yīng)。 2 2細(xì)菌的生化反應(yīng)試驗(yàn)意義何在？ 、糖發(fā)酵試驗(yàn)：糖發(fā)酵培養(yǎng)基， 大腸桿菌、自己分離的大腸桿菌、枯草桿菌、空白對照。 2、H2S試驗(yàn)：半固體培養(yǎng)基， 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，變形桿菌，空白對照。3 3、吲哚試驗(yàn)：蛋白胨水培養(yǎng)基； 大腸桿菌，自己分離的大腸桿

10、菌，枯草桿菌，空白對照。4 4、淀粉水解試驗(yàn)：淀粉培養(yǎng)基到平板； 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。5、V VP P反應(yīng)：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基*。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。6 6、甲基紅試驗(yàn)（M MR R試驗(yàn)）：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基*。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。.糖發(fā)酵試驗(yàn)：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色者表示為陽性，同時(shí)觀察小套管中 有無氣泡產(chǎn)生?！? +”表示產(chǎn)酸；“”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；“- -”表示陰性。 2.H2S試驗(yàn)：培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀產(chǎn)生. .有“+ +”3.3.吲哚試驗(yàn)：在培養(yǎng)液中先加入乙醚約1 1毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振 蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時(shí)再沿 管壁慢慢加入吲哚試劑5 51010滴，觀察有無紅色出