實(shí)驗(yàn)十水中大腸菌群含量測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)十實(shí)驗(yàn)十 水中大腸水中大腸菌群的測(cè)定（綜合性菌群的測(cè)定（綜合性實(shí)驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)）一、目的要求一、目的要求 1 1學(xué)習(xí)測(cè)定水中大腸菌群數(shù)量的多管學(xué)習(xí)測(cè)定水中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法。發(fā)酵法。 2 2了解大腸菌群的檢測(cè)作為飲水衛(wèi)生了解大腸菌群的檢測(cè)作為飲水衛(wèi)生指標(biāo)的重要性。指標(biāo)的重要性。二、基本原理二、基本原理 多管發(fā)酵法包括初（步）發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離多管發(fā)酵法包括初（步）發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)三個(gè)部分。和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)三個(gè)部分。 1 1初（步）發(fā)酵試驗(yàn)初（步）發(fā)酵試驗(yàn) 發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用

2、，因。乳糖能起選擇作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵為很多細(xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。為便于觀察細(xì)菌的產(chǎn)酸情況，乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。為便于觀察細(xì)菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為pHpH指示劑，指示劑，細(xì)菌產(chǎn)細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來(lái)的紫色變?yōu)辄S色酸后，培養(yǎng)基即由原來(lái)的紫色變?yōu)辄S色。溴甲。溴甲酚紫還有抑制其他細(xì)菌如芽胞菌生長(zhǎng)的作用。酚紫還有抑制其他細(xì)菌如芽胞菌生長(zhǎng)的作用。 水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，3737下培養(yǎng)，下培養(yǎng)，2424小時(shí)小時(shí)內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改

3、變，說(shuō)明水中存在大腸菌群，為陽(yáng)性結(jié)果，色改變，說(shuō)明水中存在大腸菌群，為陽(yáng)性結(jié)果，但也有個(gè)別其他類型的細(xì)菌在此條件下也可能但也有個(gè)別其他類型的細(xì)菌在此條件下也可能產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說(shuō)明是陰產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說(shuō)明是陰性結(jié)果。在量少的情況下，也可能延遲到性結(jié)果。在量少的情況下，也可能延遲到4848小小時(shí)后才產(chǎn)氣，此時(shí)應(yīng)視為可疑結(jié)果，因此，以時(shí)后才產(chǎn)氣，此時(shí)應(yīng)視為可疑結(jié)果，因此，以上兩種結(jié)果均需繼續(xù)做下面兩部分實(shí)驗(yàn)，才能上兩種結(jié)果均需繼續(xù)做下面兩部分實(shí)驗(yàn)，才能確定是否是大腸菌群。確定是否是大腸菌群。4848小時(shí)后仍不產(chǎn)氣的為小時(shí)后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。陰性結(jié)果。 2 2平板

4、分離平板分離 平板培養(yǎng)基一般使用復(fù)紅亞硫酸鈉瓊平板培養(yǎng)基一般使用復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂（遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基，脂（遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基，EndoEndos mediums medium）或）或伊伊紅美藍(lán)瓊脂紅美藍(lán)瓊脂（eosin methylene blueagareosin methylene blueagar，EMB agarEMB agar），前者含有堿性復(fù)紅染料，在此），前者含有堿性復(fù)紅染料，在此作為指示劑，它可被培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉脫作為指示劑，它可被培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉脫色，使培養(yǎng)基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳色，使培養(yǎng)基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳糖后產(chǎn)生的酸和乙醛即和復(fù)紅反應(yīng)，形成深糖后產(chǎn)生的酸和乙醛即和復(fù)

5、紅反應(yīng)，形成深紅色復(fù)合物，使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟饧t色復(fù)合物，使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟鉂傻纳罴t色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的澤的深紅色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長(zhǎng)。生長(zhǎng)。 伊紅美藍(lán)瓊脂平板含有伊紅與美藍(lán)染料，在伊紅美藍(lán)瓊脂平板含有伊紅與美藍(lán)染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)，該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸環(huán)境時(shí)，該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生與遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基上相似的、菌群產(chǎn)生與遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基上相似的、帶核心的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色（龍膽紫的紫色）菌落有金屬光澤的深紫色（龍膽紫的紫色）菌落。初發(fā)酵管初發(fā)酵管242

6、4小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和4848小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。的均需在以上平板上劃線分離菌落。 3 3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 以上大腸菌群陽(yáng)性菌落，以上大腸菌群陽(yáng)性菌落，經(jīng)涂片染色為經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌者，通過(guò)此試驗(yàn)再進(jìn)一革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌者，通過(guò)此試驗(yàn)再進(jìn)一步證實(shí)。原理與初發(fā)酵試驗(yàn)相同，步證實(shí)。原理與初發(fā)酵試驗(yàn)相同，經(jīng)經(jīng)2424小時(shí)培小時(shí)培養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽(yáng)性結(jié)養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽(yáng)性結(jié)果。果。三、器材三、器材 1 1、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基 乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)

7、有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（瓶）（內(nèi)有倒置小套管），伊紅美藍(lán)瓊脂平板，滅菌水；管（瓶）（內(nèi)有倒置小套管），伊紅美藍(lán)瓊脂平板，滅菌水； 2 2、儀器或其他用具、儀器或其他用具 載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管等。載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管等。四、操作步驟四、操作步驟 1 1水樣的采取水樣的采取 1)1)自來(lái)水自來(lái)水 先將自來(lái)水龍頭用火焰燒灼先將自來(lái)水龍頭用火焰燒灼3min3min滅菌，再開(kāi)放水滅菌，再開(kāi)放水龍頭使水流龍頭使水流5min5min后，以滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。后，以滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。 2 2）池水、河水或湖水）池水、河

8、水或湖水 應(yīng)取距水面應(yīng)取距水面101015cm15cm的深層水樣，的深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃谐ゲＡ?，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕?。最好立即檢查，否則需放入冰箱充分冷卻。取出。最好立即檢查，否則需放入冰箱充分冷卻。 2 2自來(lái)水檢查自來(lái)水檢查（1 1）初（步）發(fā)酵試驗(yàn)在）初（步）發(fā)酵試驗(yàn)在2 2個(gè)含有個(gè)含有50ml50ml三倍濃縮的乳糖蛋白胨發(fā)酵燒瓶中，各加入三倍濃縮的乳糖蛋白胨發(fā)酵燒瓶中，各加入100ml100ml水樣。在水樣

9、。在1010支含有支含有5ml5ml三倍濃縮乳糖蛋三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入白胨發(fā)酵管中，各加入10ml10ml水樣（如圖水樣（如圖-1-1）?；靹蚝?，）。混勻后，3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時(shí)，小時(shí)，2424小小時(shí)未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至?xí)r未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至4848小時(shí)。小時(shí)。（2 2）平板分離經(jīng)）平板分離經(jīng)2424小時(shí)培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸小時(shí)培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及產(chǎn)氣及4848小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（瓶），分小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，再于別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，再于3737下培養(yǎng)下培養(yǎng) 18182424小時(shí)，將符合下列特征小時(shí)，將符合下列特征的菌落的一小部

10、分，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，的菌落的一小部分，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。鏡檢。 （a a）深紫黑色、有金屬光澤。）深紫黑色、有金屬光澤。（b b）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。（c c）淡紫紅色、中心顏色較深。）淡紫紅色、中心顏色較深。 （3 3）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來(lái)自同一初發(fā)酵管的同類型菌中，每管可接種來(lái)自同一初發(fā)酵管的同類型菌落落1 1

11、3 3個(gè)，個(gè)， 3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時(shí)，結(jié)果若產(chǎn)酸又小時(shí)，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實(shí)有大腸菌群存在。產(chǎn)氣，即證實(shí)有大腸菌群存在。 證實(shí)有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試證實(shí)有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗(yàn)的陽(yáng)性管（瓶）數(shù)查表驗(yàn)的陽(yáng)性管（瓶）數(shù)查表-2-2，即得大腸菌，即得大腸菌群數(shù)。群數(shù)。 3 3池水、河水或湖水等的檢查池水、河水或湖水等的檢查（1 1）將水樣稀釋成）將水樣稀釋成1010-1-1與與1010-2-2。（2 2）分別吸?。┓謩e吸取1ml101ml10-2-2、1010-1-1的稀的稀釋水樣和釋水樣和1ml1ml原水樣，各裝入有原水樣，各裝入有10ml10ml普普通濃度乳糖蛋白

12、胨發(fā)酵管中。另取通濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另取10ml10ml和和100ml100ml原水樣，分別注入裝有原水樣，分別注入裝有 5 5 mlml和和50ml50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵液三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵液的試管（瓶）中。的試管（瓶）中。 （3 3）以下步驟同上述自來(lái)水的平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。）以下步驟同上述自來(lái)水的平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。（4 4）將）將100100、1010、1 1、0.10.1（1010-1-1）mlml水樣的發(fā)酵管水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表結(jié)果查表-3-3，將，將1010、1 1、0.10.1（1010-1-1）、）、0.010.01（1010-2-2）mlml水樣的發(fā)酵

13、管結(jié)果查表水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表-4-4，即得每升水樣中的大，即得每升水樣中的大腸菌群數(shù)。腸菌群數(shù)。初發(fā)酵前初發(fā)酵后陽(yáng)性管-產(chǎn)酸、產(chǎn)氣結(jié)果EMB平板分離典型結(jié)果1-綠色金屬光澤菌落EMB平板分離典型結(jié)果2-黑紫色不帶或略帶金屬光澤菌落EMB平板分離典型結(jié)果3-淡紫紅色中心顏色較深菌落復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果-產(chǎn)酸、產(chǎn)氣五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 （1 1）自來(lái)水）自來(lái)水100ml100ml水樣的陽(yáng)性管數(shù)是多少？水樣的陽(yáng)性管數(shù)是多少？10ml10ml水樣的陽(yáng)性管數(shù)是多少？水樣的陽(yáng)性管數(shù)是多少？查表查表-2-2得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？（2 2）池水、河水或湖水）池水、河水或湖水 陽(yáng)性結(jié)果記陽(yáng)性結(jié)果記“+ +”；陰性結(jié)果記；陰性結(jié)果記“- -”。 查表查表-3-3得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？ 查表查表-4-4得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？得每升水樣中大腸