實(shí)驗(yàn)a淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測(cè)浙科選修

1、知識(shí)回顧：知識(shí)回顧：1 1、在果汁生產(chǎn)中利用、在果汁生產(chǎn)中利用_，可以提高果汁的，可以提高果汁的產(chǎn)量和質(zhì)量，其原理是產(chǎn)量和質(zhì)量，其原理是_。你還能畫出出汁量和溫度關(guān)系的曲線嗎？你還能畫出出汁量和溫度關(guān)系的曲線嗎？2 2、洗衣粉中添加、洗衣粉中添加_，可以更有效地清除，可以更有效地清除頑漬。常用的酶制劑有頑漬。常用的酶制劑有_四類。四類。在食品、化工、輕紡、醫(yī)藥等領(lǐng)域大規(guī)在食品、化工、輕紡、醫(yī)藥等領(lǐng)域大規(guī)模使用酶制劑，說(shuō)明酶制劑使用有很多模使用酶制劑，說(shuō)明酶制劑使用有很多優(yōu)點(diǎn)，你能思考后舉出一些嗎？?jī)?yōu)點(diǎn)，你能思考后舉出一些嗎？催化效率高、低能耗、低污染等。催化效率高、低能耗、低污染等。酶制劑的使

2、用有缺點(diǎn)嗎？酶制劑的使用有缺點(diǎn)嗎？ 1 1、通常對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑、通常對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑等條件非常敏感，容等條件非常敏感，容易失活易失活； 2 2、溶液中的酶很、溶液中的酶很難回收難回收，不能被再次利，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；用，提高了生產(chǎn)成本； 3 3、反應(yīng)后會(huì)混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品、反應(yīng)后會(huì)混在產(chǎn)物中，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。質(zhì)量。( (難分離難分離）1 1、固定化酶技術(shù)。即將酶固定在一定空間、固定化酶技術(shù)。即將酶固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)（如固定在內(nèi)的技術(shù)（如固定在不溶于水的載體不溶于水的載體上）。上）。2 2、固定化酶技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：、固定化酶技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：（1 1）使

3、酶既能與反應(yīng)物接觸，又）使酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物能與產(chǎn)物分離分離；（2 2）固定在載體上的）固定在載體上的酶可酶可以被以被反復(fù)利用反復(fù)利用。（3 3）酶反應(yīng)過(guò)程可）酶反應(yīng)過(guò)程可嚴(yán)格控制嚴(yán)格控制酶的固定化方法主要可分為四類：酶的固定化方法主要可分為四類：吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法交聯(lián)法和包埋法等。吸附法和共價(jià)偶聯(lián)法又可統(tǒng)稱為載等。吸附法和共價(jià)偶聯(lián)法又可統(tǒng)稱為載體結(jié)合法。體結(jié)合法。吸附法吸附法 共價(jià)偶聯(lián)法共價(jià)偶聯(lián)法交聯(lián)法交聯(lián)法 包埋法包埋法吸附法：吸附法：將酶吸附到將酶吸附到固體吸附劑固體吸附劑表面的方法，表面的方法，物理吸附法物理吸附法離子交換法離子交換法對(duì)蛋

4、白質(zhì)有高度的吸附能力、又不對(duì)蛋白質(zhì)有高度的吸附能力、又不引起酶變性且能保持一定酶活性。引起酶變性且能保持一定酶活性。如：如：活性碳、多孔玻璃、石英砂、活性碳、多孔玻璃、石英砂、有機(jī)硅等有機(jī)硅等舉例：舉例：-淀粉酶的固定化淀粉酶的固定化利用蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)，使其帶有電荷的基團(tuán)與離子交換劑利用蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)，使其帶有電荷的基團(tuán)與離子交換劑形成離子鍵，而被交換結(jié)合在交換劑上形成離子鍵，而被交換結(jié)合在交換劑上固體吸附劑固體吸附劑酶酶 但必須注意，參加共價(jià)結(jié)但必須注意，參加共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是酶酶催化活性非必需基團(tuán)催化活性非必需基團(tuán)，如，如若共價(jià)結(jié)合包括了酶活性若共價(jià)結(jié)合包括

5、了酶活性中心有關(guān)的基團(tuán)，會(huì)導(dǎo)致中心有關(guān)的基團(tuán)，會(huì)導(dǎo)致酶的活力損失。酶的活力損失。是將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。是將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。酶中的酶中的氨基、羧基氨基、羧基、巰基、羥基、咪唑基、吲哚基、苯、巰基、羥基、咪唑基、吲哚基、苯環(huán)等常與載體共價(jià)結(jié)合環(huán)等常與載體共價(jià)結(jié)合交聯(lián)法：是使用雙功能或多功能試劑使酶分子交聯(lián)法：是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。其中使用最廣泛的是其中使用最廣泛的是戊二醛戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生反應(yīng)，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形

6、成固定化酶。反應(yīng)，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。戊二醛戊二醛但是交聯(lián)法中酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使但是交聯(lián)法中酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯酶失活明顯。常用的載體有常用的載體有海藻酸鈉凝膠海藻酸鈉凝膠微膠囊包埋法，微膠囊包埋法，酶被包埋成微酶被包埋成微膠囊型膠囊型凝膠包埋法，酶凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型被包埋成網(wǎng)格型常用的載體有常用的載體有聚酰胺、聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素火棉膠、醋酸纖維素四、四、“-淀粉酶固定化淀粉酶固定化”實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?、制備固定化的、制備固定化的 淀粉淀粉 糊精糊精葡萄糖葡萄糖 麥芽糖麥芽糖遇碘顯藍(lán)色遇碘顯藍(lán)色遇碘顯紅色遇

7、碘顯紅色遇碘不顯藍(lán)色遇碘不顯藍(lán)色遇碘不顯藍(lán)色遇碘不顯藍(lán)色淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶糖化淀粉酶糖化淀粉酶實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)是用本實(shí)驗(yàn)是用吸附法將吸附法將a-淀粉酶固定在石英砂淀粉酶固定在石英砂上，一定濃度上，一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過(guò)固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀的淀粉溶液經(jīng)過(guò)固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示劑溶液測(cè)試，粉指示劑溶液測(cè)試，流出物呈紅色流出物呈紅色表明水解產(chǎn)物糊精生成表明水解產(chǎn)物糊精生成這里使用的是這里使用的是枯草桿菌的枯草桿菌的a-淀粉酶淀粉酶，其作用的最適溫度為，其作用的最適溫度為5075；最適；最適PH為為5.57.5遇碘顯藍(lán)色遇碘顯藍(lán)色遇碘顯紅色遇碘顯紅

8、色遇碘不顯色遇碘不顯色設(shè)備及用品：設(shè)備及用品：5ml塑料注射器塑料注射器 50ml燒杯燒杯 滴管滴管 自行車自行車用氣門心及夾子用氣門心及夾子 注射器架注射器架 試管及微量離心管試管及微量離心管3支支實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料: :1、a-淀粉酶的固定化：淀粉酶的固定化：在燒杯中將在燒杯中將5mg a-淀粉酶溶于淀粉酶溶于4ml蒸餾水中。由于酶不純，可能有些不溶物。再加入蒸餾水中。由于酶不純，可能有些不溶物。再加入5g石英砂石英砂，不時(shí)攪拌，不時(shí)攪拌，30min后裝入后裝入1支下端接有氣門支下端接有氣門心并用夾子封住的注射器中心并用夾子封住的注射器中(石英砂體積約石英砂體積約4ml)。用。用10倍倍體積

9、的蒸餾水體積的蒸餾水洗滌洗滌此注射器，流速為此注射器，流速為1ml/min。2、可溶性淀粉溶液：、可溶性淀粉溶液：取取50ml可溶性淀粉溶于可溶性淀粉溶于100ml熱水熱水中，攪拌均勻。中，攪拌均勻。3、5mmol/L KI-I2溶液：溶液：稱取稱取0.127g碘和碘和0.83g碘化鉀。加碘化鉀。加蒸餾水蒸餾水100ml完全溶解后裝入滴瓶中。完全溶解后裝入滴瓶中。除去未吸附的除去未吸附的游離淀粉酶游離淀粉酶反應(yīng)柱反應(yīng)柱固定化酶固定化酶氣門心氣門心夾子夾子5ml注射器注射器吸附吸附5mg-5mg-淀粉酶淀粉酶+4ml+4ml蒸餾水蒸餾水+5g+5g石英砂，石英砂，攪拌攪拌30min30min裝入

10、下端接有氣門心并用裝入下端接有氣門心并用夾子封住的注射器中夾子封住的注射器中 用用1010倍柱倍柱體積的體積的蒸餾水蒸餾水洗滌洗滌除去未吸附的游離除去未吸附的游離淀粉酶淀粉酶裝柱裝柱洗柱洗柱實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)6 6- -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測(cè)淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測(cè) 淀粉淀粉 糊精糊精 石英砂石英砂 淀粉酶淀粉酶反應(yīng)柱反應(yīng)柱 分布著小分布著小孔的篩板孔的篩板固定化裝置固定化裝置反應(yīng)柱反應(yīng)柱2 2、淀粉水解作用的檢測(cè)、淀粉水解作用的檢測(cè)溶解淀粉溶解淀粉50mg50mg淀粉溶于淀粉溶于100ml100ml熱水中，攪拌均勻熱水中，攪拌均勻過(guò)柱過(guò)柱使淀粉溶液以使淀粉溶液以0.3ml/min

11、0.3ml/min的流速過(guò)柱，在的流速過(guò)柱，在流出流出5ml5ml淀粉后接收淀粉后接收0.5ml0.5ml流出液。流出液。檢測(cè)檢測(cè)加入加入1-21-2滴滴KI-IKI-I2 2溶液，觀察顏色變化。溶液，觀察顏色變化。用水稀釋用水稀釋1 1倍倍后再觀察顏色。后再觀察顏色。保存及再次使用保存及再次使用1010倍柱體積蒸餾水倍柱體積蒸餾水洗滌洗滌此柱，放置此柱，放置44冰箱保存，幾天后取出重復(fù)實(shí)驗(yàn)。冰箱保存，幾天后取出重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 HST層析住層析住2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)思考實(shí)驗(yàn)思考 1.如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒(méi)有淀如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒(méi)有淀粉酶粉酶?2.耐高溫的淀粉酶有哪些

12、可能的用途耐高溫的淀粉酶有哪些可能的用途?可在試管中加入可在試管中加入1ml可溶性淀粉，再加幾滴淀粉可溶性淀粉，再加幾滴淀粉酶柱流出液，保溫幾分鐘后用碘液檢驗(yàn)。如仍顯酶柱流出液，保溫幾分鐘后用碘液檢驗(yàn)。如仍顯藍(lán)色，則流出液中沒(méi)有淀粉酶了。藍(lán)色，則流出液中沒(méi)有淀粉酶了?？梢栽诟邷叵率沟矸鬯饪?，而且酶不會(huì)因高可以在高溫下使淀粉水解快，而且酶不會(huì)因高溫上而失活，所以可在一些需要高溫加熱同時(shí)溫上而失活，所以可在一些需要高溫加熱同時(shí)又要水解淀粉的反應(yīng)中使用。又要水解淀粉的反應(yīng)中使用。課后練習(xí)課后練習(xí) 1.如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒(méi)有淀粉酶如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒(méi)有淀粉酶?2.耐高溫的

13、淀粉酶有哪些可能的用途耐高溫的淀粉酶有哪些可能的用途?可在試管中加入可在試管中加入1ml可溶性淀粉，再加幾滴淀粉酶柱可溶性淀粉，再加幾滴淀粉酶柱流出液，保溫幾分鐘后用碘液檢驗(yàn)。如仍顯藍(lán)色，則流出液，保溫幾分鐘后用碘液檢驗(yàn)。如仍顯藍(lán)色，則流出液中沒(méi)有淀粉酶了。流出液中沒(méi)有淀粉酶了?？梢栽诟邷叵率沟矸鬯饪?，而且酶不會(huì)因高溫上可以在高溫下使淀粉水解快，而且酶不會(huì)因高溫上而失活，所以可在一些需要高溫加熱同時(shí)又要水解而失活，所以可在一些需要高溫加熱同時(shí)又要水解淀粉的反應(yīng)中使用。淀粉的反應(yīng)中使用。1 1、研究認(rèn)為，用固定化酶技術(shù)處理污、研究認(rèn)為，用固定化酶技術(shù)處理污染物是很有前途的。如將從大腸桿菌得染物

14、是很有前途的。如將從大腸桿菌得到的磷酸三酯酶固定到尼龍膜上制成制到的磷酸三酯酶固定到尼龍膜上制成制劑，可以用來(lái)降解殘留在土壤中的有機(jī)劑，可以用來(lái)降解殘留在土壤中的有機(jī)磷農(nóng)藥，與用微生物降解相比，其作用磷農(nóng)藥，與用微生物降解相比，其作用不需要適宜的（不需要適宜的（ ）A A、溫度、溫度 B B、PHPHC C、水分、水分 D D、營(yíng)養(yǎng)、營(yíng)養(yǎng)D2 2、目前，日用化工廠大量生產(chǎn)的酶、目前，日用化工廠大量生產(chǎn)的酶制劑，其中的酶大都來(lái)自制劑，其中的酶大都來(lái)自A A、化學(xué)合成、化學(xué)合成 B B、動(dòng)物體內(nèi)、動(dòng)物體內(nèi) C C、植物體內(nèi)、植物體內(nèi) D D、微生物體內(nèi)、微生物體內(nèi) D3.3.酶的固定方法不包括酶的固定方法不包括( )( )。A. A. 將酶吸附在固體表面上將酶吸附在固體表面上 B B將酶相互連接起來(lái)將酶相互連接起來(lái)C