高效液相色譜-檢測器

1、高效液相色譜高效液相色譜檢檢 測測 器器侯建軍侯建軍檢測器檢測器 是高效液相色譜儀是高效液相色譜儀的核心部件，他負責把從色譜的核心部件，他負責把從色譜柱分離出來的各組分快速、準柱分離出來的各組分快速、準確的檢測出來，實現(xiàn)定性、定確的檢測出來，實現(xiàn)定性、定量分析。量分析。 檢測器的分類檢測器的分類v1、 紫外可見吸收檢測器紫外可見吸收檢測器(UV)v2 、光電二極管陣列檢測器、光電二極管陣列檢測器 ( PDA)v3 、熒光檢測器、熒光檢測器( FD)v4 、示差折光檢測器、示差折光檢測器( RID)v5 、電化學檢測器、電化學檢測器( ED) v6 、化學發(fā)光檢測器、化學發(fā)光檢測器( CD)v7

2、 、蒸發(fā)光散射檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)紫外可見吸收檢測器紫外可見吸收檢測器(ultravioletvisible detector，UV) 紫外可見吸收檢測器(UVD)是HPLC中應(yīng)用最廣泛的 檢測器，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測器。 屬于選擇性檢測器。1 、特點特點：靈敏度較高，線性范圍寬，噪聲低，波長可選，對流動相的流速和溫度變化不敏感，適用于梯度洗脫，對強吸收物質(zhì)檢測限可達10-9g/ml以下，檢測后不破壞樣品，可用于制備，并能與多種檢測器串聯(lián)使用。工作原理與結(jié)構(gòu)同一般分光光度計相似，也就是裝有流通池的紫外可見分光光度計。2、結(jié)構(gòu)與原理結(jié)構(gòu)與原理：紫外吸收檢測器常用氘燈

3、作光源，氘燈則發(fā)射出紫外-可見區(qū)范圍的連續(xù)波長，并安裝一個光柵型單色器，其波長選擇范圍寬(190nm800nm)。 它有兩個流通池，一個參比池，一個測量池。光源發(fā)出的紫外光照射到流通池上，若兩流通池都通過純的均勻溶劑，則它們在紫外波長下幾乎無吸收，光電管上接受到的輻射強度相等，即無信號輸出。當組分進入測量池時，吸收一定的紫外光，使兩光電管接受到的輻射強度不等，即有信號輸出，輸出信號大小與組分濃度有關(guān)。 可變波長紫外檢測器固定波長紫外檢測器結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 紫外/可見光檢測器的光路系統(tǒng)，由提供190nm600nm寬帶光譜，光線徑直射到上，衍射的單色光射到，被分成兩束光線，一束經(jīng)流通池后照射到光電池上

4、，另一束經(jīng)參比池照射到光電池上，光電池把光能量轉(zhuǎn)換成微小電流信號，光柵由一臺微機控制的步進電機精確地驅(qū)動以改變波長。如圖所示：D氘燈氘燈光門光門波波長長調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)桿桿凹面光柵凹面光柵半透鏡半透鏡流通池流通池光電池（測量）光電池（測量）光電池（光電池（參比參比）暗盒暗盒 單單色色器器光源光源步進電機步進電機半透反光鏡半透反光鏡檢測池檢測池參比池參比池光光 /電轉(zhuǎn)換電轉(zhuǎn)換前置放大器前置放大器A/DCPU時鐘時鐘并行口并行口訊號輸出訊號輸出(積分積分/記錄記錄)鍵鍵 盤盤顯示屏顯示屏直流直流電源電源變壓器變壓器交流電源交流電源冷卻風機冷卻風機紫外紫外/可見光檢測器系統(tǒng)原理圖可見光檢測器系統(tǒng)原理圖3、局

5、限：對紫外吸收差的化合物如不含不飽和鍵的烴類等靈敏度很低。 流動相的選擇受到一定限制，紫外吸收大的溶劑不能做流動相。每種溶劑都有截止波長，當小于該截止波長的紫外光通過溶劑時，溶劑的透光率降至10%以下，因此，流動相的截止波長不能大于紫外吸收檢測器的工作波長。光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器(photodiode array detector， PDA ) 紫外檢測器的重要進展紫外檢測器的重要進展，也稱快速掃描紫外檢測器，1、特點：、特點： 靈敏度比紫外檢測器高靈敏度比紫外檢測器高 ，噪音，噪音低低 ，線性范圍寬，線性范圍寬 ，對流速和溫度的波動不，對流速和溫度的波動不靈敏，適用于梯度洗

6、脫及制備色譜。靈敏，適用于梯度洗脫及制備色譜。2、原理與結(jié)構(gòu)、原理與結(jié)構(gòu)： 二極管陣列檢測器光路示意圖二極管陣列檢測器光路示意圖氘燈氘燈消色差透鏡消色差透鏡斬光器斬光器流通池流通池載液載液全息光柵全息光柵3、局限：局限：對紫外吸收差的化合物靈敏度很對紫外吸收差的化合物靈敏度很低。流動相的選擇受到一定限制，紫外吸收低。流動相的選擇受到一定限制，紫外吸收大的溶劑不能做流動相。二極管陣列少的話大的溶劑不能做流動相。二極管陣列少的話熒光檢測器熒光檢測器(fluorescence detector， FD)一般包括激發(fā)光源、選擇激發(fā)波長的單色器、檢測池、選擇發(fā)射波長的單色器及檢測發(fā)光強度的光電轉(zhuǎn)換系統(tǒng)等

7、基本組件?？煞譃楣潭úㄩL熒光檢測器（用多個率光片作單色器）和熒光分光檢測器（用光柵作單色器）兩大類。 1、特點：、特點： 靈敏度極高 ，能達到 10-12g/ml ，有選擇性，可檢測能產(chǎn)生熒光的化合物。某些不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過化學衍生法生成熒光衍生物，適用于痕量分析。2、原理與結(jié)構(gòu)：、原理與結(jié)構(gòu)：由光源發(fā)出的光，經(jīng)激發(fā)由光源發(fā)出的光，經(jīng)激發(fā)光單色器后，得到所需波長的激發(fā)光。通過檢光單色器后，得到所需波長的激發(fā)光。通過檢測池的激發(fā)光部分被樣品吸收，并使其被激發(fā)測池的激發(fā)光部分被樣品吸收，并使其被激發(fā)后發(fā)射出熒光。在經(jīng)選擇發(fā)射波長的單色器分后發(fā)射出熒光。在經(jīng)選擇發(fā)射波長的單色器分光后，單一波長的發(fā)

8、射光被送至光電檢測器進光后，單一波長的發(fā)射光被送至光電檢測器進行檢測。由于吸光強度與激發(fā)光強度成正比，行檢測。由于吸光強度與激發(fā)光強度成正比，光源應(yīng)具有高強度、連續(xù)、平滑、穩(wěn)定的輻射光源應(yīng)具有高強度、連續(xù)、平滑、穩(wěn)定的輻射輸出功能。輸出功能。熒光檢測器氘燈激發(fā)單色器發(fā)射單色器光電倍增管光二極管（UV）樣品流通池結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖光源檢測器濾光片檢測室濾光片常見熒光檢測器光路圖常見熒光檢測器光路圖3、局限：、局限：只能適合于能產(chǎn)生熒光的物只能適合于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)（或通過衍生化能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)）質(zhì)（或通過衍生化能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)）的檢測。其線性范圍不如紫外檢測器寬。的檢測。其線性范圍不如紫外檢測器寬。示

9、差折光檢測器示差折光檢測器(differential refractive Index detector， RID) 是一種濃度型通用檢測器，對所有溶質(zhì)都有是一種濃度型通用檢測器，對所有溶質(zhì)都有響應(yīng)響應(yīng)，應(yīng)用較廣，應(yīng)用較廣?？煞譃榉瓷湫停ǜ鶕?jù)?？煞譃榉瓷湫停ǜ鶕?jù)Fresnel定律）、折射型（根據(jù)定律）、折射型（根據(jù)Snell定律）定律）和干涉型三種類型。和干涉型三種類型。1、特點：、特點：靈敏度高、噪聲小、運行高度靈敏度高、噪聲小、運行高度穩(wěn)定、折射率范圍寬、穩(wěn)定、折射率范圍寬、 操作簡單、方便。操作簡單、方便。2 、原理與結(jié)構(gòu)：、原理與結(jié)構(gòu)：此檢測器是基于連續(xù)此檢測器是基于連續(xù)測定樣品流路和

10、參比流路之間折射率的變測定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來測定樣品的含量。光從一種介質(zhì)進入化來測定樣品的含量。光從一種介質(zhì)進入另一種介質(zhì)時，由于兩種物質(zhì)的折射率不另一種介質(zhì)時，由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動相同就會產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動相的折光指數(shù)不同，就可被檢測，二者相差的折光指數(shù)不同，就可被檢測，二者相差愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。示差折光檢測器原理圖結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 3、局限：、局限：不如紫外檢測器敏度、對溫不如紫外檢測器敏度、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫測

11、器寬。度敏感、不能用于梯度洗脫測器寬。電化學檢測器電化學檢測器(electrochemical detector， ED) 包括電導、安培、庫侖、極譜和介電常數(shù)包括電導、安培、庫侖、極譜和介電常數(shù)檢測器檢測器等。檢測器檢測器等。1 、電導檢測器：、電導檢測器：特點：特點：高靈敏度高靈敏度、高選擇性高選擇性、結(jié)構(gòu)簡單結(jié)構(gòu)簡單、操作成本低操作成本低、線性范圍寬（可達線性范圍寬（可達10106 6） 、死死體積小體積小、選擇性、選擇性檢測器。檢測器。 是離子色譜中必是離子色譜中必備的檢測器備的檢測器。 原理及結(jié)構(gòu)：原理及結(jié)構(gòu)：基于離子性物質(zhì)的溶液具有導電性，利用離子在電場中遷移導電進行檢測，其電導率

12、與離子的性質(zhì)和濃度相關(guān)。 當向電導池的兩個電極施加電壓時，溶液中的陰離子向陽極移動，陽離子向陰極移動。在電解質(zhì)溶液中的離子數(shù)目和離子的移動速率決定溶液的電阻大小，離子的遷移率或單位電場中離子的速率取決于離子的電荷及其大小、介質(zhì)類型、溶液溫度和離子濃度。離子的遷移速率取決于施加電壓的大小。所施加的電壓既可以是直流電壓，也可以是正弦波或方波電壓。當施加的有效電位確定后，即可測量出電路中的電流值，即能測出電導值。結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖電導儀電極電極液液路路電極電源局限：局限：對流速、溫度敏感、干擾比較多。對流速、溫度敏感、干擾比較多。特點：特點：高靈敏度、高選擇性、應(yīng)用很廣高靈敏度、高選擇性、應(yīng)用很廣，檢測具

13、有氧化還原活性（能發(fā)生電極，檢測具有氧化還原活性（能發(fā)生電極反應(yīng)）的物質(zhì)。反應(yīng)）的物質(zhì)。適于與反相色譜匹配。2、安培檢測器：、安培檢測器：原理：原理：當被分離的電活性物質(zhì)流經(jīng)電極表面當被分離的電活性物質(zhì)流經(jīng)電極表面時，由于溶液與電極間有電勢差，電活性物時，由于溶液與電極間有電勢差，電活性物質(zhì)就要得到或失去電子，被還原或氧化，因質(zhì)就要得到或失去電子，被還原或氧化，因此，溶液和電極間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，形成電流，此，溶液和電極間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，形成電流，該電流符合法拉第定律，即該電流符合法拉第定律，即電流大小與待測電流大小與待測物濃度成正比。物濃度成正比。記錄電流隨時間的變化，得記錄電流隨時間的變化，得到

14、電泳譜圖。到電泳譜圖。結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖接參比電極接參比電極和對電極和對電極接色譜柱接色譜柱塑塑料料塊塊工作電極工作電極(Pt, Au, 碳糊碳糊)Teflon1 cm安培檢測器安培檢測器局限：局限：流動相必須含有電解質(zhì)，且呈化流動相必須含有電解質(zhì)，且呈化學隋性。只能檢測具有電活性的物質(zhì)。學隋性。只能檢測具有電活性的物質(zhì)。極譜檢測器極譜檢測器庫庫侖侖檢檢測測器器極譜庫、侖檢測器結(jié)構(gòu)圖極譜庫、侖檢測器結(jié)構(gòu)圖化學發(fā)光檢測器化學發(fā)光檢測器(Chemiluminescence detector， CD) 該檢測器是一種新型檢測器。該檢測器是一種新型檢測器。1、特點：、特點：快速、靈敏的新型檢測，最快速、靈敏

15、的新型檢測，最小檢出量可達小檢出量可達10-12g/ml, 設(shè)備簡單、價廉、設(shè)備簡單、價廉、線性范圍寬等。線性范圍寬等。2、原理與結(jié)構(gòu)：、原理與結(jié)構(gòu)：某些物質(zhì)在常溫下進行某些物質(zhì)在常溫下進行化學反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)勢反應(yīng)中間體化學反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)勢反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物，當它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，或反應(yīng)產(chǎn)物，當它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，就發(fā)射出光子。物質(zhì)激發(fā)態(tài)的能量是來自就發(fā)射出光子。物質(zhì)激發(fā)態(tài)的能量是來自化學反應(yīng)。當分離組分從色譜柱中洗脫出化學反應(yīng)。當分離組分從色譜柱中洗脫出來后，立即與適當?shù)幕瘜W發(fā)光試劑混合，來后，立即與適當?shù)幕瘜W發(fā)光試劑混合，引起化學反應(yīng)發(fā)光，通過光電倍增管將光引起化學反

16、應(yīng)發(fā)光，通過光電倍增管將光信號變成電信號，進行檢測。其光強度與信號變成電信號，進行檢測。其光強度與該物質(zhì)的濃度成正比。該物質(zhì)的濃度成正比。蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器(EvaporativeLight-scatteringDetector , ELSD)通用型檢測器。通用型檢測器。1、特點：、特點：任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測。敏度高，對溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。能檢測不含發(fā)色團的化合物，如：碳水化合物、脂類、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑、藥物(人參皂苷、黃芪甲苷)，并在沒有標準品和化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)未知的情況下檢測未知化合物 。2、原理及結(jié)構(gòu)：

17、、原理及結(jié)構(gòu)：HPLC柱噴霧氣體蒸發(fā)漂移管激光光源樣品液滴光二極管檢測器散射室結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 示差折光示差折光紫外紫外熒光熒光電導電導應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍通用通用選擇性選擇性高選擇高選擇性性選擇性選擇性可否梯度淋洗可否梯度淋洗不可不可可可可可不可不可線性范圍線性范圍104103104最小檢測量最小檢測量10-6g10-9g10-12g10-9g對溫度敏感度對溫度敏感度敏感敏感低低敏感敏感溶劑使用情況溶劑使用情況無限制無限制受限制受限制受限制受限制受限制受限制幾種檢測器特性比較 105低低檢測器檢測器應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 主要特點主要特點 紫外紫外-可見光可見光 有紫外吸收的物質(zhì)；有紫外吸收的物質(zhì)；80%

18、的的 有機物有機物都可以檢測都可以檢測 池體積可制作得很??；池體積可制作得很??；檢測后不破檢測后不破壞樣品，可用于制備壞樣品，可用于制備 熒光熒光 自身發(fā)熒光的物質(zhì)或熒光衍自身發(fā)熒光的物質(zhì)或熒光衍 生物生物 易受背景熒光、易受背景熒光、pH和溶劑的影響；和溶劑的影響；適用于痕量分析。適用于痕量分析。 化學發(fā)光化學發(fā)光 發(fā)光試劑受限制；易受流動相組成發(fā)光試劑受限制；易受流動相組成和脈動的影響。和脈動的影響。 電導電導 含鹵、硫、氮化合物具有高含鹵、硫、氮化合物具有高 選擇和選擇和高靈敏度高靈敏度 是離子性物質(zhì)的通用檢測器；不能是離子性物質(zhì)的通用檢測器；不能用于有機溶劑體系。用于有機溶劑體系。 電化學電化學 具有氧化還原活性的或某些具有氧化還原活性的或某些 沒有氧沒有氧化還原活性的物質(zhì)經(jīng)化還原活性的物質(zhì)經(jīng) 過衍生化后也過衍生化后也能進行檢測能進行檢測 易受流動相易受流動相pH值和雜質(zhì)的影響