胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)07.21精編版

1、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，原代與繼代培養(yǎng)及鑒定劉亭目錄前言21 分離制備 PMSC組織的選取32 臍帶，胎盤 MSC的分離與純化52.1 胎盤組織的獲取，存儲(chǔ)與清洗52-2 臍帶，胎盤 MSC的分離及純化方法63 原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)103-1 培養(yǎng)基103-2 培養(yǎng)密度113-3 培養(yǎng)條件113-4 換液113-5 傳代培養(yǎng)123-6 細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)速度123-7 MSC 的凍存與復(fù)蘇：124 細(xì)胞表面抗原檢測(cè)135 生長(zhǎng)曲線136 細(xì)胞周期137 分化潛能13參考文獻(xiàn)13附件 1 不同實(shí)驗(yàn)室從臍帶血，臍帶和胎盤等各組織中分離MSC的方法15臍帶血15臍帶15羊膜17絨毛膜18蛻膜層18胎盤19

2、整體灌注法20附件 2 背景知識(shí)20附件 3 PMSC實(shí)驗(yàn)所需試劑211前言干細(xì)胞（ Stem cell，SC）是一種能夠自我更新且未分化并可分化成兩個(gè)或兩個(gè)以上其它品系的細(xì)胞。 在一定的條件下， 干細(xì)胞能夠分化成為多種成熟細(xì)胞類型。按照來(lái)源和分化潛能不同， 干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞 （ Embryonic stem cell，ESC）和成體干細(xì)胞（ Adult stem cell，ASC）兩類。胚胎干細(xì)胞 來(lái)源于早期的胚泡和胚胎內(nèi)層的細(xì)胞群， 并且具有向 3 個(gè)胚層細(xì)胞分化的能力。 但是胚胎干細(xì)胞應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生的免疫排斥、 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中引發(fā)腫瘤生成以及所涉及的倫理問(wèn)題等影響并制約了臨床應(yīng)用。 成體干

3、細(xì)胞 形成于原腸胚形成后的胎兒和成體組織，早期研究認(rèn)為，成體干細(xì)胞主要分化為其來(lái)源組織的細(xì)胞類型。然而，近幾年來(lái)的很多研究表明，成體干細(xì)胞具有能夠分化成為除來(lái)源以外的其他胚層組織的能力。間充質(zhì)干細(xì)胞（ Mesenchymal stem cell, MSC）又稱為基質(zhì)干細(xì)胞，是屬于成體干細(xì)胞的一種，最早從骨髓中分離而來(lái)。 MSC 是由早期中胚層發(fā)育而來(lái)的非造血成體干細(xì)胞，該細(xì)胞在體外可以貼壁生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)梭狀。胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈圓形，1-3 個(gè)核仁。在適當(dāng)?shù)臈l件下可以大量擴(kuò)增， 并轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)祖細(xì)胞，進(jìn)而分化成包括三個(gè)胚層的各種組織細(xì)胞，如脂肪、骨、軟骨、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。MSC 具有低的免

4、疫原性、能向腫瘤遷移、具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持等功能，而且易于外源基因?qū)氡磉_(dá)， 是基因治療中重要的載體細(xì)胞。 此外，一些研究學(xué)者還發(fā)現(xiàn)， MSC 具有類似免疫抑制劑作用，可抑制 T 淋巴細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞中的免疫反應(yīng)，并同時(shí)抑制 T 細(xì)胞的異基因增殖反應(yīng)。所以， MSC 在治療組織缺損、器官退行性疾病、 腫瘤及免疫疾病具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。 近年來(lái) MSC 已逐步成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)（張慧娟等， 2014）。目前所報(bào)道的 間充質(zhì)干細(xì)胞主要來(lái)源 于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。 雖然分離方法簡(jiǎn)便， 但供者取骨髓需要經(jīng)歷一個(gè)比較痛苦的手術(shù)， 并在取材過(guò)程中及取材后會(huì)有很高的感染機(jī)會(huì)；由于人體骨髓

5、中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量極其稀少，每 105-106 個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中大約只有 1 個(gè)；而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、 增殖和分化能力均顯著下降， 使其在研究和應(yīng)用尤其是臨床應(yīng)用中受到限制。其他組織中，如動(dòng)員的外周血、乳牙、臍帶、臍血也存在間充質(zhì)干2細(xì)胞，然而，從這些組織中獲得的細(xì)胞數(shù)量較為有限。以上因素，都限制了間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程和臨床中的運(yùn)用。目前胎盤或臍帶屬于臨床廢棄物， 容易獲得， 并且無(wú)污染， 取材研究和應(yīng)用基本無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議，研究表明胎盤或臍帶含有豐富的 MSC。有研究表明 PMSC 比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更容易分離培養(yǎng)， 細(xì)胞活性更好， 還可誘導(dǎo)分化成脂肪， 成骨等多種細(xì)

6、胞。并且這些 胎盤源的間充質(zhì)干細(xì)胞 （placenta-derived mesenchymal stem cells，PMSCs）具有極低的免疫原性，大多數(shù)患者對(duì)于胎盤或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有天然的免疫耐受， 因此，人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在研究相關(guān)疾病的動(dòng)物模型中，即便是人 -動(dòng)物模型間的異種間移植，由于存在天然的免疫耐受，對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果影響甚小，這對(duì)于很多疾病研究的模型建立具有很好的作用。目前 MSC 主要臨床應(yīng)用于抑制移植物抗宿主反應(yīng)。動(dòng)物模型研究結(jié)果表明 PMSC 對(duì)子宮內(nèi)膜損傷（劉芳，2013），大鼠肝組織損傷（宮黎明等， 2011），APP+轉(zhuǎn)基因鼠阿爾茨海默?。ü鶃喣械龋?009）均有

7、療效，也可以用于構(gòu)建組織工程皮膚（徐彪等， 2013）。所以， 綜合充分利用胎盤和臍帶作為間充質(zhì)干細(xì)胞新來(lái)源，優(yōu)化分離純化以及傳代培養(yǎng)條件，加快細(xì)胞繁殖速度，降低培養(yǎng)成本以高效率獲取大量的PMSC 對(duì)于的各種疾病實(shí)驗(yàn)研究及醫(yī)院各個(gè)科室的臨床應(yīng)用，都具有重要意義。1 分離制備 PMSC組織的選取胎盤起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層， 人足月娩出的胎盤由羊膜層、 絨毛膜層和蛻膜層組成。 從臍帶血（于海微等， 2009；管英華等， 2011），臍帶（徐燕等，2009；韓之波等， 2012；管英華等， 2011；李艷琪等， 2014；趙琳等， 2016），整個(gè)胎盤 （陸琰等， 2009；沙文瓊等， 2010

8、；劉洋等， 2015；賴平等， 2016），胎盤的羊膜層（宮黎明等，2011；徐彪等，2013；張慧娟等，2014；叢姍等，2015），絨毛膜層（洪艷等， 2014；韓之波等， 2012）和蛻膜層（韓之波等， 2013）分離培養(yǎng) MSC 均有報(bào)道。目前大多數(shù)研究者取胎盤小葉 （包括絨毛層和絨毛滋養(yǎng)層）進(jìn)行分離（洪艷等， 2014）。胎盤的細(xì)胞成分較復(fù)雜，既有滋養(yǎng)細(xì)胞，也有間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和 Hofbauer 細(xì)胞（沙文瓊等， 2010）。由胎盤組織分離制備3MSC 時(shí)不可避免會(huì)有其它細(xì)胞的干擾（苗宗寧等，2009），其中以數(shù)量最多的血細(xì)胞干擾為主。 分離 MSC 選取組織時(shí)需要考慮哪個(gè)部

9、位的組織可能含有最多的MSC ，并且盡可能降低其它種類細(xì)胞的干擾，以獲得純度高，活力強(qiáng)的MSC 。對(duì)于人臍帶血來(lái)源的 MSC（ human umbilical cord blood MSC, hUCB-MSC）的存在及能否穩(wěn)定傳代擴(kuò)增， 曾有一定爭(zhēng)議， 后來(lái)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)臍帶血中存在MSC，并表明臍帶血來(lái)源 MSC 與骨髓來(lái)源 MSC 具有相同的生物學(xué)特性及功能特征（于海微等， 2009）。但是臍帶血中也存在多能成體干 /祖細(xì)胞，分離間充質(zhì)干細(xì)胞的過(guò)程以丟失造血干細(xì)胞為代價(jià)，而且個(gè)體差異大（徐燕等， 2009）。臍帶包括一條靜脈和兩條動(dòng)脈，周圍是 Whartons Jelly，外層由羊膜來(lái)源的

10、上皮包裹，從發(fā)育角度來(lái)說(shuō)， 臍帶是干細(xì)胞形成及所經(jīng)通路 （管英華等， 2011）。不同研究機(jī)構(gòu)均從人臍帶組織中分離到 MSC（ human umbilical cord MSC, hUC-MSC ）。已有研究表明人臍帶的結(jié)締組織是間充質(zhì)干細(xì)胞豐富的組織來(lái)源（徐燕等， 2009），故制備 hUC-MSC 一般剝離臍帶動(dòng)靜脈和外層上皮。管英華等（2011）比較了臍血和臍帶兩種來(lái)源的 MSC原代培養(yǎng)過(guò)程， 結(jié)果表明臍血中細(xì)胞成分復(fù)雜， 原代培養(yǎng)多見(jiàn)成纖維樣和大圓形破骨樣兩種形態(tài)的貼壁細(xì)胞，隨著換液和傳代破骨樣細(xì)胞逐漸減少和消失， 剩下形態(tài)較為單一的呈漩渦樣的細(xì)胞集落 ; 臍帶來(lái)源培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞不會(huì)隨

11、換液丟失， 且細(xì)胞形態(tài)以成纖維樣細(xì)胞為主，種類單一。 hUC-MSCs比hUCB-MSCs原代培養(yǎng)的時(shí)間短，培養(yǎng)成功率明顯增高。羊膜是胎膜最內(nèi)層，胎盤包裹胎兒面的一層薄而半透明的膜，由胚胎羊膜囊壁發(fā)育而成，在胎盤面與絨毛膜相貼， 由人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和人羊膜上皮細(xì)胞組成，其表面沒(méi)有神經(jīng)、血管、肌肉和淋巴等組織。人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源于原條期的胚胎中胚層，而人羊膜上皮細(xì)胞來(lái)源于胚胎外胚層。越來(lái)越多的研究已證實(shí)，人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和人羊膜上皮細(xì)胞都具有干細(xì)胞的特征。其中人胎盤羊膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（ human amnion-derived mesenchymal cells, hAD-MSCs）不但表

12、達(dá)成體干細(xì)胞特性中的間充質(zhì)干細(xì)胞特性也表達(dá)部分胚胎干細(xì)胞特性，相關(guān)研究表明人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞全能型標(biāo)志轉(zhuǎn)錄因子基因OCT4、SOX2和 NANOG （張惠娟等， 2014）以及 SSEA-3、SSEA-4、Oct-4等胚性標(biāo)志（宮黎明等， 2011），近年來(lái)發(fā)現(xiàn) hAD-MSCs 在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，可分化成來(lái)自 3個(gè)4胚層的所有細(xì)胞（宮黎明等， 2011）。有研究比較人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力， 發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量在各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（徐彪等， 2013）。洪艷等（ 2014）分別從 絨毛膜和絨毛滋養(yǎng)層 分離并培養(yǎng) MSC

13、，發(fā)現(xiàn)在分離過(guò)程中，從絨毛膜和絨毛滋養(yǎng)層得到的細(xì)胞量都很多， 絨毛滋養(yǎng)層的細(xì)胞量甚至?xí)浇q毛膜的細(xì)胞量。 但是在接種后培養(yǎng)時(shí)， 由于絨毛滋養(yǎng)層血細(xì)胞較多， 血細(xì)胞難以處理， 影響間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁， 無(wú)法貼壁就無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)， 由此導(dǎo)致后期細(xì)胞生長(zhǎng)慢，收獲細(xì)胞少。韓之波等（2013）的研究表明來(lái)自母體的底蛻膜組織也可以分離制備MSC。苗宗寧等（ 2009）將胎盤組織分為 3 組，分別是中央帶組即臍帶附著處，邊緣帶組即距臍帶附著點(diǎn)最遠(yuǎn)處和中間帶組即兩者之間中點(diǎn)處。 分別全層連續(xù)切片，以抗 CD166、抗 CD44、抗 CD29 分別做免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)及分布分布

14、區(qū)域， 結(jié)果表明中間層的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與表達(dá)水平強(qiáng)于絨毛板層和底板層； 同為中間層，中央帶較中間帶及邊緣帶表達(dá)更強(qiáng)。由此推測(cè)，在接近血管豐富的臍帶附著部的胎盤中間層取材易于獲得較豐富的PMSCs。2 臍帶，胎盤 MSC的分離與純化2.1 胎盤組織的獲取，存儲(chǔ)與清洗母血檢測(cè) HBV 、HCV 、HIV 、CMV 、EBV 、梅毒均為陰性。產(chǎn)婦無(wú)傳染性疾病，胎兒無(wú)先天性疾病。 臨床足月正常剖宮產(chǎn)后胎盤， 大小及質(zhì)量在正常范圍內(nèi)，胎盤臍帶附著點(diǎn)均在胎盤中央稍偏位。經(jīng)與產(chǎn)婦及其家屬簽署知情同意書(shū)，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在產(chǎn)房無(wú)菌條件下獲取臍帶，胎盤。文獻(xiàn)報(bào)道中取組織后有如下處理方法：立即浸入

15、胎盤儲(chǔ)存袋（加拿大 LABPLAS 公司的無(wú)菌采樣袋，含 99%低糖 DMEM ， 1%雙抗即青鏈霉素的組織保護(hù)液） ，在 48 h 內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。臍帶靜置于冰箱12h，觀察保存臍帶的PBS 液，若無(wú)渾濁說(shuō)明無(wú)感染。臍帶采集后在 6 h 內(nèi)進(jìn)行處理，切除雙側(cè)帶夾痕及淤血的部分。5無(wú)菌采集健康足月剖宮產(chǎn)羊膜，冰盒中2 h 內(nèi)運(yùn)達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入試驗(yàn)流程。無(wú)菌采集健康足月剖宮產(chǎn)胎盤，并立即進(jìn)入分離提取程序。文獻(xiàn)報(bào)道中組織塊的用量及獲得：胎盤組織約50 g35 個(gè)胎盤小葉剪取胎兒側(cè)的絨毛膜層組織10 mL眼科手術(shù)剪將組織剪碎（細(xì)碎小塊；1mm3 大??；呈肉糜狀，以能用吸管吸取為標(biāo)準(zhǔn)；約 3mm；5 mm

16、3 大小的碎塊）組織絞碎分離機(jī)（近似肉糜）文獻(xiàn)中的組織浸泡液 /清洗液：# 生理鹽水# D-Hanks平衡液# 磷酸緩沖液（ PBS）# 杜氏磷酸緩沖液（ D-PBS）# 含肝素的 PBS# 含有雙抗生素的 PBS (0.1%的青鏈霉素，1%的青鏈霉素 , 100 U/mL 青霉素 , 100 g/mL 鏈霉素 )# 含有青霉素和鏈霉素的無(wú)血清DMEM /F12 培養(yǎng)基2-2 臍帶，胎盤 MSC的分離及純化方法已報(bào)道臍帶，胎盤MSC 的分離方法有組織塊貼壁法，酶消化法以及整體灌注法。組織貼壁培養(yǎng)法得到的細(xì)胞純度較高，對(duì)細(xì)胞傷害小，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，將組織塊剪碎、 貼壁后加培養(yǎng)基培養(yǎng)即可，但原代培養(yǎng)

17、所需周期較長(zhǎng)、 獲得細(xì)胞數(shù)量相對(duì)有限。李艷琪等（2014）在首次組織塊貼壁培養(yǎng)獲得MSC 后，將組織塊轉(zhuǎn)移到新的培瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，兩三天后仍可見(jiàn)到貼壁細(xì)胞，第 5 天可形成明顯的細(xì)胞克隆。這種改進(jìn)的 組織塊二次貼壁方法 可在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量原代細(xì)胞。酶消化法可直接將消化得到原代細(xì)胞， 但是獲得的細(xì)胞純度略低、 狀態(tài)不均一，由于消化時(shí)間不易掌握， 消化時(shí)間過(guò)短不能得到足量細(xì)胞， 消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害， 損傷細(xì)胞膜成分， 導(dǎo)致無(wú)法貼壁生長(zhǎng)， 影響細(xì)胞的成活率和增6殖能力，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，給后續(xù)培養(yǎng)帶來(lái)困難（李艷琪等，2014）；對(duì)于某些組織如臍帶 Whartons膠經(jīng)酶消化后的膠體黏稠，

18、不易離心。徐燕等2009 比較，植塊法培養(yǎng)610 d 可見(jiàn)成纖維樣細(xì)胞從植塊邊緣爬出，在原代細(xì)胞克隆數(shù)、細(xì)胞產(chǎn)率、傳代時(shí)間及擴(kuò)增倍數(shù)上明顯好于膠原酶消化法（1 g/L 膠原酶 3.05.0mL， 置于含雙抗的 PBS 中，37 孵育 0.5 h）比較存在差異；而膠原酶與胰酶聯(lián)合消化法（ 1 g/L 膠原酶于 37 孵育 16 h，以 PBS 洗滌后加入 25 g/L 胰酶于 37 孵育 0.5 h）接種后未見(jiàn)明顯貼壁細(xì)胞。 常用的酶包括胰蛋白酶， 膠原蛋白酶，和。胰蛋白酶消化能力強(qiáng)，型膠原酶消化能力相對(duì)較弱，但對(duì)細(xì)胞膜損害較小。很多研究者對(duì)酶的濃度，消化時(shí)間，消化方式，多種消化酶聯(lián)合消化做了大

19、量探索。 尋求既能充分的分離細(xì)胞， 又能避免細(xì)胞的損傷的方法 （賴平等， 2016）組織經(jīng)酶消化后需要用篩網(wǎng) /多層紗布過(guò)濾（100 目，200 目，300 目，100 m 的濾器），除去未被消化的大組織塊。濾出的細(xì)胞成分復(fù)雜，常含有大量的血細(xì)胞?，F(xiàn)階段用于分離 純化方法 間充質(zhì)干細(xì)胞的方法主要有以下幾種：一般離心、密度梯度離心法、貼壁篩選法、紅細(xì)胞裂解液法、淋巴細(xì)胞分離液 ( Ficoll ) 、羥乙基淀粉沉淀、 流式細(xì)胞儀分選法或磁珠分選法。 因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有特異的表面標(biāo)志，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選法或磁珠分選法會(huì)損失大量細(xì)胞， 且成本高。每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)， 使用紅細(xì)胞裂解液對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)

20、胞的損傷大， 使用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分離的可重復(fù)性較差，技術(shù)不穩(wěn)定（洪艷等， 2014）。文獻(xiàn)中報(bào)道的消化酶的濃度，消化時(shí)間，次數(shù)及組合消化：機(jī)械剝離胎盤羊膜組織， PBS 反復(fù)沖洗，將羊膜組織剪成細(xì)碎小塊， 0.25% 胰酶 37 消化 10 min，過(guò) 100 目篩網(wǎng)過(guò)濾獲得細(xì)胞液。經(jīng)胰酶消化后的組織塊，繼續(xù)經(jīng) 0.1%型膠原酶 37消化 15 min。含體積分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清的L-DMEM 終止反應(yīng)后，過(guò) 100 目篩網(wǎng)獲得細(xì)胞液。 兩次收集的細(xì)胞液 1 000 r/min 離心 10 min，棄上清液（徐彪等， 2013）。將胎盤組織碎片置于200 mL 無(wú)菌離心管中，聯(lián)合應(yīng)用 0

21、.25%胰蛋白酶和 0.1%型膠原酶 消化胎盤組織碎片。 37 搖床消化 30 min，去除組織留取消化液，經(jīng) 1 500 r/min 離心 5 min，收集離心獲得的細(xì)胞沉淀。將離心后收集到的細(xì)胞重懸于含體積分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清的 -MEM 培養(yǎng)基（劉洋等， 2015）。7剪碎羊膜，加入 0.5 g/L 胰蛋白酶 -0.02% EDTA-2Na 消化液，37，200 r/min 旋轉(zhuǎn)消化 10 min，棄上清，再加入消化液， 37 旋轉(zhuǎn)消化 30 min，棄上清，按同樣的程序再 重復(fù)消化 2 次。經(jīng)胰酶消化后剩余的組織用 D-PBS 液沖洗，加入 0.75 g/L 型膠原酶 -0.075

22、g/L DNase I 消化液， 37 、200 r/min 旋轉(zhuǎn)消化 2.03.0 h，直至組織完全消化， 經(jīng) 300 目 不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾， 收集細(xì)胞濾液， 1 500 r/min，離心 10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀懸浮于 LG-DMEM 培養(yǎng)基（宮黎明等， 2011）。張慧娟等（2014）無(wú)菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜剪成碎片，分別通過(guò) 7 種消化方法，發(fā)現(xiàn)用 0.05 g/L 的胰蛋白酶連續(xù)消化 2 次每次消化 30 min，然后用 1 g/L 的膠原酶消化 60 min 是最合適的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)條件。0.05 g/L 胰蛋白酶消化 10 min 后，再加 0.75

23、 g/L 膠原酶消化 60 min0.75 g/L 膠原酶直接消化120 min0.05 g/L 胰蛋白酶與 0.75 g/L 膠原酶同時(shí)消化60 min0.05 g/L 的胰酶消化 30 min 后，再加 0.75 g/L 膠原酶消化 30 min0.05 g/L 的胰蛋白酶連續(xù)兩次消化30 min 后，再加入 0.75 g/L 的型膠原酶消化 60 min0.05 g/L 的胰酶連續(xù) 2 次消化 40 min 后，再加 0.75 g/L 膠原酶消化 60 min0.05 g/L 的胰酶連續(xù) 2 次消化 30 min 后，再加 1 g/L 的型膠原酶消化 60 min 取前處理的樣品在 37

24、 下，用 0.05 g/L 的胰蛋白酶連續(xù) 2 次消化 30 min，用含體積分?jǐn)?shù) 5%的胎牛血清 DMEM 終止消化，輕柔吹打混勻后 200 目細(xì)胞篩過(guò)濾，篩中組織經(jīng) PBS 沖洗后裝入培養(yǎng)皿中，然后加入 1 g/L 的型膠原酶，在 37 下消化 60 min，之后用含體積分?jǐn)?shù) 5%的胎牛血清 DMEM 終止消化，輕柔吹打混勻后 200 目細(xì)胞篩過(guò)濾，濾液在1 500 r/min 的離心機(jī)中離心5 min，去上清液，換 DMEM/F12 培養(yǎng)基混懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)皿中（張慧娟等，2014）。用眼科手術(shù)剪將羊膜剪碎約1 mm×1 mm 組織塊，加入 等體積的 0.05%trypsin

25、-EDTA ， 37 水浴震蕩消化 30 min 后加入含血清的培養(yǎng)液，離心去上清， 如此反復(fù)消化兩次 ， 再用 PBS 洗 23 次， 盡可能去除上皮細(xì)胞。用細(xì)胞篩過(guò)濾后剩余的羊膜組織加入不同濃度型膠原酶 (0.75、 1.00 和 2.00 mg/mL) ，837 水浴震蕩消化 60 min， 加入含血清的培養(yǎng)液終止消化， 混勻后用 200 目細(xì)胞篩過(guò)濾， 再將濾液 1 500 r/min 離心 5 min 收集細(xì)胞（叢珊等， 2015）。按體積比約16 加入型膠原酶 ( 0.1% ) ， 置于 37 恒溫水浴箱中消化 30 min， 間隔 5 min 適當(dāng)混勻組織與消化液。之后紗布過(guò)濾，

26、上淋巴細(xì)胞分離液（賴平等， 2016）。使用 pH 7.4、含 25 mmol/LHEPES 的 D-Hanks作為消化緩沖液，加入終濃度為 2.5 g/L 胰酶和 300 U/mL DNase組成消化液，沖洗后的胎盤組織分階段消化，每個(gè)階段在恒溫氣浴搖床中37 、180 r/min 消化 20 min（沙文瓊等，2010）。用手術(shù)剪分別將絨毛膜層組織塊剪成約5 mm 3 大小的碎塊 型膠原酶 10mL （酶消化終濃度0.1% ），置于搖床內(nèi) 37 、 250 r/min 振蕩，約 90 min 后終止消化（洪艷等， 2014）。文獻(xiàn)中報(bào)道的純化方法：將細(xì)胞懸液緩慢加至已配好的淋巴細(xì)胞分離液

27、中。 1 500 r ·min-1 ， 4離心20 min，離心后可見(jiàn) “白膜層 ”，小心吸取該區(qū)域細(xì)胞，并加入 4 倍于該體積的 PBS 稀釋，1000 r·min-1，常溫下離心 5 min。重復(fù)一次， 棄上清（賴平等， 2016）Percoll 梯度密度分離 ：在 50 mL 離心管中逐層鋪入 7 個(gè)密度的 Percoll 分離液，每個(gè)密度 5 mL。再緩緩加入 5 mL 細(xì)胞懸液，使用水平離心機(jī)室溫下 1 200 g 離心 20 min。 小心棄除離心管 20 mL 刻度以上的液體， 收集 12.520.0 mL 刻度的細(xì)胞層 (滋養(yǎng)細(xì)胞 )和 12.57.5 mL

28、 刻度 (胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞 )的液體，分別放入不同離心管里，用 D-Hanks液稀釋 5 倍后，室溫下 1 000 g 離心 15 min（沙文瓊等，2010）。陸琰等（ 2009）比較了四種胎盤組織分離純化從 MSC 的方法：膠原酶 + 羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶 + 羥乙基淀粉沉淀組、膠原酶 + 淋巴細(xì)胞分層液分離組、膠原酶 + 氯化銨裂解紅細(xì)胞組。與膠原酶 + 羥乙基淀粉沉淀組比較，其余 3 組獲取的細(xì)胞數(shù)均明顯減少（ t =2.928.16，P < 0.05）。在其他條件相同的情況下， 膠原酶 + 羥乙基淀粉沉淀組培養(yǎng)成功率為 100%，其余 3 組分別為 80%，80%， 20%

29、。剪碎的胎盤組織與1 g/L 膠原酶中， 37 消化 45 min。然后過(guò)細(xì)胞篩網(wǎng)，收集各組細(xì)胞懸液， 分別于室溫以 1 000 r/min 離心 5 min，棄上清。用 PBS 重懸9細(xì)胞，加入 60 g/L 羥乙基淀粉（體積比為 4:1）充分混勻，室溫靜置 45 min，小心吸取上清， 1 000 r/min 離心 5 min，棄上清， PBS 洗滌 2 次。以完全培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液， 錐蟲(chóng)藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。 按 1.5× 109 L-1 密度接種于 T-25 塑料培養(yǎng)瓶中（陸琰等， 2009）。3 原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)3-1 培養(yǎng)基從文獻(xiàn)報(bào)道可以看出， 需要 10%胎牛

30、血清，低糖的 DMEM/F12 完全培養(yǎng)基， 100 U/mL 青霉素 +100 g/mL 鏈霉素，此外可選的有 5 g/L 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，10 g/L 表皮生長(zhǎng)因子， 10 g/L 血小板衍生生長(zhǎng)因子。文獻(xiàn)中報(bào)道的培養(yǎng)基：# 10%胎牛血清的 L-DMEM 完全培養(yǎng)基# 5 g/L 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和10 g/L 表皮生長(zhǎng)因子的 L-DMEM 完全培養(yǎng)基#10%胎牛血清的 -MEM 培養(yǎng)基# LG-DMEM 培養(yǎng)基 (含體積分?jǐn)?shù)為 10%的胎牛血清、 2 mmol/L L- 谷氨酰胺、 10 g/L 非必需氨基酸、 55 mol/L 2- 巰基乙醇、 1 mmol/L 丙酮酸

31、鈉、 100 U/mL 青霉素和 100 g/L 鏈霉素 )# DMEM/ F12+10% FBS+10 ng/mL bFGF+100 U/mL 青霉素 +100 g/mL 鏈霉素# 10%的胎牛血清的低糖 DMEM# 含體積分?jǐn)?shù)為 0.1 胎牛血清的 DMEM/F12# 含體積分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的 DMEM/F12培養(yǎng)基# 完全培養(yǎng)基 (含體積分?jǐn)?shù)為 2%胎牛血清、 40% MCDB201 、10 g/L 血小板衍生生長(zhǎng)因子、 10 g/L 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 10 g/L 表皮生長(zhǎng)因子的 DF12 培養(yǎng)基 )# DMEM+ 體積

32、分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清 +1% enicillin-Streptomycin+5 g/L 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子103-2 培養(yǎng)密度原代培養(yǎng)的細(xì)胞接種密度可能對(duì)成功培養(yǎng)有影響，于海微等（2009）試驗(yàn)了 5×108L-1、 1× 109 L-1、 5×109 L -1、 1× 1010 L -1 的接種密度，發(fā)現(xiàn)以5×108 L -1 密度接種時(shí)細(xì)胞一直無(wú)法傳代，以5× 109 L-1 的密度接種時(shí)細(xì)胞貼壁時(shí)間、出現(xiàn)伸展時(shí)間及原代培養(yǎng)時(shí)間均顯著短于其他接種密度。文獻(xiàn)中報(bào)道的接種密度：2.2×108 L-11.5×1

33、09 L-11×106/cm28-11×10 L3×106/皿， 接種若干 ?100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿3-3 培養(yǎng)條件37 、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2 孵育箱內(nèi)培養(yǎng)3-4 換液細(xì)胞生長(zhǎng)消耗培養(yǎng)基的養(yǎng)分， 同時(shí)產(chǎn)生代謝廢物， 限制細(xì)胞生長(zhǎng)， 所以需要及時(shí)換液，但是換液太頻繁會(huì)造成浪費(fèi)， 此外可以胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，可以利用此特性在換液時(shí)與其他雜細(xì)胞進(jìn)一步分離， 但在培養(yǎng)早期， 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁不牢固， 第一次換液時(shí)間過(guò)早將損失獲取的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。 故需要通過(guò)實(shí)時(shí)觀察并根據(jù)實(shí)際情況探究合適的原代培養(yǎng)的第一次換液時(shí)間和后續(xù)培養(yǎng)的換液頻率。文獻(xiàn)中報(bào)

34、道的首次換液時(shí)間有 2d， 3d，7d 全量或半量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每三四天換液 1 次。文獻(xiàn)中報(bào)道的換液時(shí)間和方式：每 3 d 全量換液 1 次培養(yǎng) 48 h 后半量換液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每三四天換液1 次7 d 后首次全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，每三四天換液1 次3 d 后半量換液， 1 周后再次換液，此后每隔3 d 換液 1 次1157 d 后全量換液，以后每3 d 換液3d 全量換液，以后每周換液2 次3d 后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)2d 后全量換液2d 換液，以后每 3 d 換液 1 次3-5 傳代培養(yǎng)待原代培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁連生面積達(dá) 70%90%后（貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至 70% -90

35、% 融合時(shí)），用胰酶消化（2.5 g/L 胰酶或 0.25%胰酶或 1.25 g/L 胰蛋白酶 -1 g/L 乙二胺四乙酸 ），按 1：2 或 1： 3 或 14 的比例傳代，或以（ 2.55.0）× 103/cm2 密度接種傳代培養(yǎng)。（消化時(shí)間？去除培養(yǎng)基后加酶消化？胰蛋白酶用 PBS 還是培養(yǎng)基溶解？每個(gè)培養(yǎng)瓶用多少量的酶消化？）3-6 細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)速度3-7 MSC的凍存與復(fù)蘇：凍存液中 DMSO 的濃度可能對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，叢珊等（ 2015）對(duì)此進(jìn)行過(guò)實(shí)驗(yàn)，將 3 組不同凍存液凍存的 hAMSCs 凍存 48 h 后進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。冷凍保護(hù)液一： 5% 二甲基亞砜 (di

36、methylsulfoxide, DMSO) 50% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清+45% DMEM/F12 。冷凍保護(hù)液二： 10% DMSO 50% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清 +40% DMEM/F12 。冷凍保護(hù)液三：20% DMSO 50% 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清 +30% DMEM/F12 。結(jié)果顯示， DMSO 濃度為 5%時(shí)，細(xì)胞在 2 h 后開(kāi)始貼壁， 4 h 時(shí)幾乎全部細(xì)胞貼壁； DMSO 濃度為 10%和 20%的兩組活力較差，細(xì)胞仍是圓形，且無(wú)貼壁現(xiàn)象。復(fù)蘇培養(yǎng) ：解凍時(shí)從液氮罐中取出冷凍管，將其放入37 水浴鍋迅速融化約 12 min（或放入 37、 5% CO2、 飽和濕度的培養(yǎng)箱中使其融化 ）。將凍存管

37、中液體加入有培養(yǎng)基的離心管中， 1500 r/min 離心 5 min，去掉上清，接種到新的培養(yǎng)基皿中，于 37、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，第 2 天更換培養(yǎng)液（叢珊等， 2015）。124 細(xì)胞表面抗原檢測(cè)由于培養(yǎng)細(xì)胞的形狀不能作為鑒別細(xì)胞類型的主要特征標(biāo)志，因此，通常都采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面抗原分子進(jìn)行鑒定。不同的研究人員觀察到MSC表達(dá)不同的表面標(biāo)記，造成這種情況的原因有很多，包括 MSC 的來(lái)源、供者的年齡、提取的方法和擴(kuò)增的條件等都會(huì)影響MSC 的表面標(biāo)記（韓之波等，2012）。國(guó)際上對(duì)于MSC 的鑒定仍具爭(zhēng)議，目前認(rèn)可度較高的ISCT（國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)）間充質(zhì)干細(xì)胞委員會(huì)

38、制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)。流式細(xì)胞儀分析鑒定MSC應(yīng)細(xì)胞表達(dá)黏附分子和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記 CD73、 CD90、 CD105， 整合蛋白家族CD29，以及透明質(zhì)酸鹽受體 CD44，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記 CD11b、 CD34、 CD45和 HLA-DR 。5 生長(zhǎng)曲線6 細(xì)胞周期7 分化潛能參考文獻(xiàn)郭亞男, 關(guān)方霞, 李國(guó)棟, 李祥生, 楊波, 杜英, 胡祥, 胡煒, 焦紅亮, 李遠(yuǎn). 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植治療阿爾茨海默病APP+轉(zhuǎn)基因鼠的有效性及安全性評(píng)估 J.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(10):1811-1818.韓之波 , 王有為 , 王濤 , 池穎, 楊舟鑫 , 及月茹 ,

39、孟磊 , 楊萍, 韓忠朝 . 人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及其生物學(xué)特性研究J. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 ,2013, 21（3）：754-759.韓之波 , 楊舟鑫 , 池穎 , 王有為 , 王濤, 及月茹 , 楊萍 , 孟磊, 韓忠朝 . 人臍帶胎盤絨毛膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較研究J. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜13志, 2012, 20（3）：692-696.洪艷 , 霍思維 , 陸瑤 , 章毅 . 人胎盤不同組織分離間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性J.中國(guó)組織工程研究 , 2014, 18(19):3082-3087.李艷琪 , 王洪一 , 姚堯 , 劉晶晶 , 徐瀟, 張宇 , 劉洋 , 吳祖

40、澤 , 靳繼德 . 人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的改進(jìn)J. 中國(guó)組織工程研究 , 2014,18(10):1609-1614.劉芳，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合雌激素治療宮腔粘連的實(shí)驗(yàn)研究D. 南方醫(yī)科大學(xué) , 2013.劉洋, 李艷琪, 王洪一, 吳曉冰, 荊永光, 徐瀟, 姚堯, 張宇, 吳祖澤, 靳繼德. 胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取的新方法J. 中國(guó)組織工程研究 , 2015,19(10):1608-1612.陸琰 , 陳麗 , 張洹 . 人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞4 種消化分離方法的效果比較J. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(6):10147-1020.苗宗寧 , 徐秋嵐 ,

41、 呂國(guó)忠 , 王玲 , 張學(xué)光 . 間充質(zhì)干細(xì)胞在人胎盤組織中的染色定位及整體灌注分離培養(yǎng)J. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2009,13(36):7133-7137.賴平 , 陳懿建 , 羅耀玲 , 張敏鴻 , 楊建瓊 , 邱悅?cè)?. 人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定 J. 贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2016，36(2)：183-186.沙文瓊 , 王自能 , 王冬菊 . 人胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與純化J.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(10):1833-1837.徐彪 , 李芳 , 孫青 , 許云云 , 趙娟 , 梁含思 , 馬樹(shù)立 , 陳永珍 . 羊膜

42、上皮細(xì)胞和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚J. 中國(guó)組織工程研究 , 2013,17(41):7213-7220.徐燕 , 李長(zhǎng)虹 , 孟恒星 , 郝牧 , 邱錄貴 . 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其生物學(xué)特性 J. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù) , 2009,13(32):6289-6294.于海微 , 李佩玲 , 莊如錦 , 李會(huì)明 . 人臍帶血和骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、分化及生物學(xué)特性比較J. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2009,13(6):1021-1024.14附件 1 不同實(shí)驗(yàn)室從臍帶血，臍帶和胎盤等各組織中分離MSC 的方法臍帶血分娩后穿刺臍靜脈抽取50

43、 mL 臍帶血液， 4冰箱保存， 12 h 內(nèi)分離，用Hank s平衡液稀釋臍帶血，稀釋血液緩慢疊加于 Ficoll 上，離心，吸出乳白色云霧狀單個(gè)核細(xì)胞， 洗滌離心 2 次，將獲得的單個(gè)核細(xì)胞分別以 5×108/L 密度種植入 25 cm2 的塑料培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基吹打，混勻。置于 37、含體積分?jǐn)?shù)為 0.05 的 CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱中， 57 d 后全量換液，以后每 3 d 換液，并逐日觀察細(xì)胞貼壁延伸時(shí)間、 原代培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞生長(zhǎng)情況 （于海微等，2009）。距胎兒 5-7cm 的臍帶處進(jìn)行雙結(jié)扎， 剪斷臍帶，消毒母?jìng)?cè)臍帶斷端， 穿刺臍靜脈抽取臍血 40-120mL，

44、加肝素抗凝， 4h 內(nèi)分離（管英華等， 2011）。淋巴細(xì)胞分離液法 : 將臍帶血與無(wú)血清 DMEM/F12 培養(yǎng)基 1:1 體積比混合，緩慢加至含有等體積的 Ficoll ( 密度為 1.077g/L ) 分離液上， 1800r/min 離心 20min，取中間白膜層，經(jīng)培養(yǎng)基以 1000r/min 離心 10min 洗滌 2 次，細(xì)胞接種密度為 5*107 接種至 25cm2 培養(yǎng)瓶中，置于 37，5%的 CO2 飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合達(dá)到 80%時(shí)， 0.25%胰蛋白酶消化傳代（管英華等， 2011）。羥乙基淀粉沉降與淋巴細(xì)胞分離液兩步分離法 : 將臍帶血與 6%羥乙基淀粉按 4:

45、1 的體積比混合，常溫下靜置 30-45min，取上清液， 1000r/min 離心 10min，棄去上清，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞將其緩慢加至含有等體積的 Ficoll ( 密度 1.077g/L )分離液上（管英華等，2011）。臍帶將無(wú)菌條件下取得的足月妊娠分娩胎兒臍帶，用PBS 洗 3 次，去掉殘留的血細(xì)胞。把臍帶剪切成 2.0 cm左右的片段并剔除血管（1 條臍靜脈，2 條臍動(dòng)脈），取出其中的凝膠狀組織，將其剪成大小約 1 mm3 的組織塊，然后置于培養(yǎng)瓶中。 6 h 后，加入含體積分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清、 100 U/mL 青霉素、 100 mg/L 鏈霉素的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，放置

46、在 37、體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 3 d 后15半量換液， 1 周后再次換液，此后每隔 3 d 換液 1 次。觀察貼壁組織周圍的細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 80%-90%融合度時(shí)，用胰酶消化傳代，并將組織轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的培養(yǎng)瓶中， 按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)， 獲得第二次組織塊貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞（李艷琪等， 2014）。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法 : 在無(wú)菌條件下取出的臍帶組織， 用含有青霉素和鏈霉素的無(wú)血清 DMEM/F12 培養(yǎng)基洗滌去除殘存血，去除外包膜與臍動(dòng)靜脈血管，將剩余組織剪碎至 1mm3 大小，轉(zhuǎn)入 T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 37、 5%CO2 飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中直接貼壁培養(yǎng)。 5-7d

47、 首次換液，貼壁細(xì)胞融合接近 80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代（管英華等， 2011）。酶消化培養(yǎng)法 : 將以上方法處理的去除外包膜與動(dòng)靜脈后的臍帶組織，經(jīng) 0.1%膠原酶和 0.25%胰酶消化，無(wú)血清DMEM/F12 培養(yǎng)基洗滌，以1.0*106/cm2 接種到 T2 瓶（管英華等， 2011）。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：臍帶采集后在6 h 內(nèi)進(jìn)行處理，切除雙側(cè)帶夾痕及淤血的部分，用含雙抗的PBS 緩沖液充分沖洗臍帶外周以及臍靜脈內(nèi)腔，用以下 3 種方法進(jìn)行分離培養(yǎng)， 3 種方法均于培養(yǎng)的第 14 天計(jì)數(shù)集落數(shù)，超過(guò) 50 個(gè)細(xì)胞計(jì)為集落。當(dāng)細(xì)胞達(dá) 70%80% 融合時(shí)，以含 1.25

48、g/L 胰蛋白酶 -1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以 (2.55.0) 103/cm2× 密度接種傳代培養(yǎng)， 計(jì)為第1 代(P1) 細(xì)胞。植塊法： 沿臍靜脈內(nèi)腔縱向剪開(kāi)血管，剝離臍靜脈內(nèi)膜，將剩余組織切成 3.05.0 mm3 小塊，貼于預(yù)先用 1 mL 完全培養(yǎng)基 ( 含體積分?jǐn)?shù)為 2%胎牛血清、 40% MCDB201 、10 g/L 血小板衍生生長(zhǎng)因子、 10 g/L 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 10 g/L 表皮生長(zhǎng)因子的 DF12 培養(yǎng)基 ) 潤(rùn)濕的 T25 培養(yǎng)瓶底壁，底壁朝上，置于 37、體積分?jǐn)?shù)為 5%的 CO2 飽和濕度孵箱中，過(guò)夜后翻轉(zhuǎn)。每 24 h 加入

49、1 mL 上述培養(yǎng)基， 72 h 全量換液，以后每周換液 2 次。觀察貼塊周圍貼壁細(xì)胞爬出情況。 2 周后去貼塊。 膠原酶消化法： 夾閉臍靜脈一端，灌入1 g/L 膠原酶 3.05.0 mL ，置于含雙抗的 PBS 中，37 孵育 0.5 h，收集酶液，并用 PBS 反復(fù)灌洗，收集灌洗液，與酶液同時(shí)離心洗滌棄上清后，以完全培養(yǎng)基重懸，1×106/cm2 接種于 T25 培養(yǎng)瓶中，3 d 后全量換液，以后每周換液 2 次。觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)。 膠原酶與胰酶聯(lián)合消化法： 將臍帶組織切成 1.02.0 mm3 小塊，直接加入 1 g/L 膠原酶于 37孵育 16 h ，以 PBS 洗滌后加入

50、 25 g/L 胰酶于 37孵育 0.5 h；加入含體積分?jǐn)?shù)為 20%胎牛血清的培養(yǎng)基中和胰酶， 以 10016m 的濾器過(guò)濾細(xì)胞，收集濾液；PBS 洗滌棄上清后，以完全培養(yǎng)基重懸，按1×106/cm2 接種于 T25 培養(yǎng)瓶中， 3 d 后全量換液，以后每周換液2 次。觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)（徐燕等， 2009）。羊膜羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：選取剖宮產(chǎn)足月胎兒的胎盤， 機(jī)械剝離胎盤羊膜組織， PBS 反復(fù)沖洗，將羊膜組織剪成細(xì)碎小塊，0.25%胰酶 37 消化 10min，100 目篩網(wǎng)過(guò)濾。 PBS 充分清洗后收集經(jīng)胰酶消化后的組織塊，繼續(xù)經(jīng) 0.1%型膠原酶 37消化 15 mi

51、n。含體積分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清的 L-DMEM 終止反應(yīng)后反復(fù)吹打，過(guò) 100 目篩網(wǎng)獲得細(xì)胞液， 1 000 r/min 離心 10 min，棄上清液。收集羊膜來(lái)源的細(xì)胞按以下培養(yǎng)條件進(jìn)行體外培養(yǎng)：添加有5 g/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和 10 g/L表皮生長(zhǎng)因子的 L-DMEM 完全培養(yǎng)基， 置于 37 、體積分?jǐn)?shù)為 5% CO2 孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。 每 3 d 全量換液 1 次，12-14 d 后細(xì)胞按常規(guī)方法傳代（徐彪等， 2013）。hAD-MSCs 的分離和培養(yǎng)：無(wú)菌條件下，采用機(jī)械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用 D-PBS 液反復(fù)沖洗以清除殘留血跡。剪碎羊膜，加入0.5 g/L 胰蛋

52、白酶-0.02% EDTA-2Na 消化液， 37 旋轉(zhuǎn) (200 r/min) 消化 10 min，棄上清，再加入消化液， 37 旋轉(zhuǎn)消化 30 min，棄上清，按同樣的程序再重復(fù)消化 2 次。經(jīng)胰酶消化后剩余的組織用 D-PBS 液沖洗，加入 0.75 g/L 型膠原酶 -0.075 g/L DNase I 消化液， 37 、200 r/min 消化 2.03.0 h，直至組織完全消化，經(jīng) 300目 不 銹 鋼 網(wǎng) 過(guò) 濾 ， 收 集 細(xì) 胞 濾 液 ，1 500 r/min，離心 10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀懸浮于 LG-DMEM 培養(yǎng)基 (含體積分?jǐn)?shù)為 10%的胎牛血清、 2 mmo

53、l/L L- 谷氨酰胺、 10 g/L 非必需氨基酸、 55 mol/L -2巰基乙醇、 1 mmol/L 丙酮酸鈉、 100 U/mL 青霉素和 100 g/L 鏈霉素 ) 2%錐蟲(chóng)藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力， 以 2.2 ×108 L-1 濃度接種于培養(yǎng)瓶，于 37 、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為 5%的 CO2 環(huán)境下培養(yǎng)， 3 d 更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞連生面積達(dá) 80%90%后行傳代培養(yǎng)（宮黎明等， 2011）。17絨毛膜在產(chǎn)房無(wú)菌條件下獲取胎盤， 立即浸入胎盤儲(chǔ)存袋 含 99%低糖 DMEM ，1%抗生素 ( 雙抗即青鏈霉素 ) 的組織保護(hù)液 ，在 48 h 內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室（洪艷等，2014）。剪取胎兒側(cè)的絨毛膜層組織