AFLP分子標(biāo)記技術(shù)

1、二、AFLP勺基本原理是什么？ ？三、AFLP的實(shí)驗(yàn)過(guò)程怎樣？ ？四、AFLP的應(yīng) 用研究如何？ ？五、對(duì)AFLP的評(píng)價(jià)分子標(biāo)記的歷史：?第一代分子標(biāo)記技術(shù) RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism 限 制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）？第二代分子標(biāo)記技術(shù) RAPED （Random Amplified PolymorphicDNA 隨機(jī)擴(kuò)增 多態(tài)性DNA）AFLP （AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性）？事 實(shí)上，還有很多分子標(biāo)記技術(shù)像 SSR ISSR SRAP （相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）另 外，還有

2、現(xiàn)在號(hào)稱(chēng)為第三代分子標(biāo)記的 SNP （單核甘酸多態(tài)性）等AFLP的基本原理？基因組DNA經(jīng)兩種限制性?xún)?nèi)切酶酶切，形成分子量大小 不等的隨機(jī)限制性酶切片段，將特定的人工合成的短的雙鏈接頭連在這些片段 的兩端，形成一個(gè)帶接頭的特異片段，通過(guò)接頭序列和PCR引物3端選擇性堿基的識(shí)別，對(duì)特異性片段進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。最后只有那些兩端序列能 與選擇性堿基配對(duì)的限制性酶切片段才能被擴(kuò)增；最后將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在高 分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，尋找多態(tài)性擴(kuò)增片段。AFLP的實(shí)驗(yàn)流程？模板制備 DNA的提?。⊿DS和CTABfe）酶切 連接 PCRF增（PCR AMPLIFIED ）預(yù)擴(kuò)增（Pre-a

3、mplified）選擇性擴(kuò)增（Elective amplified）DNA 的提取（SD骷和 CTA時(shí)）?SDSM Sodium dodecyl sulfate 的縮寫(xiě)稱(chēng)為 十二烷基磺酸鈉，？CTAB是Cetyltrimethyl ammoniumbromide的縮寫(xiě)十六烷基三 甲基澳化氨，？?jī)煞N都是去污劑，它們都能破壞細(xì)胞膜使膜蛋白變性沉淀，故而 使核酸釋放出來(lái)，另外，它還能保護(hù) DNA不受內(nèi)源核酸酶的降解。酶切？為了使酶切片段大小分布均勻，一般采用兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶，一個(gè)用 6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶（常用EcoRI, PstI或SacI）另一個(gè)用4個(gè)堿基 識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶（常用M

4、seI、TaqI）。采用雙酶切的主要原因有：(1)多切點(diǎn)酶產(chǎn)生較小的DNA片段，而切數(shù)點(diǎn)較少的酶能夠減少擴(kuò)增片段的 數(shù)目，因?yàn)閿U(kuò)增片段主要是多切點(diǎn)酶和切點(diǎn)數(shù)較少的酶組合產(chǎn)生的酶切片段， 這樣就可以減少選擇擴(kuò)增時(shí)所需要的選擇堿基數(shù)。(2)雙酶切可以進(jìn)行單鏈標(biāo)記，從而防止形成雙鏈造成的干擾。(3)雙酶切可以對(duì)擴(kuò)增片段數(shù)進(jìn)行靈活調(diào)節(jié)。(4)通過(guò)少數(shù)引物可產(chǎn)生許多不同的引物組合，從而產(chǎn)生大量的不同的AFLP指紋。這樣，經(jīng)過(guò)酶切后就形成了三種類(lèi)型的酶切片段，如EcoRI/MseI酶切形成 EcoRI EcoRI片段、EcoRI MseI 片段、Mse 工一 MseI 片段，由于 AFL限 術(shù)革新成功的關(guān)

5、鍵在于DNA的充分酶切，所以對(duì)模板質(zhì)量要求很高，要注意避 免其它DNA污染和抑制物質(zhì)存在。連接？酶切后的DNA片段在T4 DNA連接酶作用下與兩種內(nèi)切酶相應(yīng)的特定 接頭相連接，形成帶接頭的特異性片段。接頭為雙鏈，由兩部分組成，一部分 是核心序列，一部分是酶特定序列(能與酶切片段粘端互補(bǔ))，通常在酶特定序列 中變換了一個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基，保證了連接片段不能再被酶切。只有遵 循引物擴(kuò)增原則”設(shè)計(jì)的接頭才能得到滿意的擴(kuò)增結(jié)果。PCRT增(PCR AMPLIFIED應(yīng)用與接頭相識(shí)別的引物進(jìn)行擴(kuò)增。 AFLP引物由 三部分組成：(1) 5'端的與人工接頭序列互補(bǔ)的核心序列 (coresequ

6、ence)(2)限制性?xún)?nèi)切酶特定識(shí)別序列(enzyme-specific sequence)(3) 3'端的帶有選擇性堿基的粘性末端(selective1備用；理論上每增加一個(gè)選擇性堿基，將只擴(kuò)增限制性片段的，而在兩個(gè) 引物上都有三個(gè)選擇性堿基的情況下，則僅獲得的片段；也就是說(shuō)，只有那些 兩端序列能與選擇堿基配對(duì)的限制酶切片段被擴(kuò)增。所以選擇性堿基是選擇用 于擴(kuò)增的特定的限制性片段的一種精確而有效的方法；預(yù)擴(kuò)增(Preamplified) 擴(kuò)增所用引物3端有一個(gè)選擇堿基，通過(guò)預(yù)擴(kuò)增對(duì)擴(kuò)增模板進(jìn)行初 步篩選，一方面可以避免直接擴(kuò)增造成的指紋帶型背景拖尾現(xiàn)象，另一方面可 以避免直接擴(kuò)增由引

7、物3端3個(gè)選擇堿基誤配形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。？選擇性擴(kuò)增（Elective amplified）?內(nèi)切酶的應(yīng)用 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)稀釋后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，使所 需模板量不受限制。所用引物 3'端有3個(gè)選擇堿基的延伸，通過(guò)3個(gè)選擇堿基 的變換獲得豐富的DNA片段。AFLP技術(shù)的改良有多種內(nèi)切酶組合如 EcoRI PstI、SacI HindIII或Apal與MseI、TaqI用 于AFLP技術(shù) 只應(yīng)用一種內(nèi)切酶制備模板（單酶切）也有應(yīng)用三種內(nèi)切酶的報(bào)道（三酶切）TEAFLP劇物的標(biāo)記及結(jié)果顯示引物標(biāo)記已從同位素標(biāo)記發(fā)展到目前的熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記減少了同位 素對(duì)人體的損害，同時(shí)使結(jié)果分析更加便利準(zhǔn)確，但

8、費(fèi)用仍然很高，單酶切 AFL喈的引物不需要標(biāo)記，只需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、紫外透射儀觀察結(jié)果， 省時(shí)、方便，但澳化乙錠對(duì)人體有危害。現(xiàn)有一種銀染法可以降低成本又對(duì)人 體無(wú)害，但操作相對(duì)復(fù)雜繁瑣又費(fèi)時(shí)。？其它類(lèi)型AFL限術(shù)是基于對(duì)基因組 DNA的分析而創(chuàng)建的，目前已有cDNA-AFLP 還有甲基化敏感-AFLPAFLP的應(yīng)用研究？AFL唯術(shù)在植物研究上的應(yīng)用基因定位及構(gòu)建遺傳圖譜遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定輔助育種研究基因表達(dá)與調(diào)控居群的遺傳結(jié)構(gòu)與保護(hù)生物學(xué)研究？其它方面的應(yīng)用？AFP結(jié)合BSA分群分析法， Bulksegregateanalysis）T進(jìn)行基因的快速定位； Ballvora禾U用

9、AFLP技術(shù)2合BSA 法精確定位了馬鈴薯的根包囊線蟲(chóng)抗病基因Grol; AFL限術(shù)能找出因基因槍法或完整細(xì)胞電穿孔而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因大米中發(fā)生的隱藏的基因改變；對(duì)于構(gòu)建遺 傳圖譜，AFLPM認(rèn)為是迄今最有效的分子標(biāo)記技術(shù)；近幾年來(lái)，利用AFL限術(shù)已對(duì)枝樹(shù)、楊樹(shù)、松樹(shù)、桃樹(shù)進(jìn)行了遺傳圖譜的構(gòu)建并取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。AFLP技術(shù)在植物遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定上的應(yīng)用？種質(zhì)資源收集的遺傳多樣性可通過(guò)譜系記錄與 DNA指紋分析兩條途徑相結(jié)合，其目的是對(duì)種質(zhì) 資源進(jìn)行分類(lèi)、描述雜合的類(lèi)群與雜合式樣、追索育種的歷史；AFLP在鑒定與評(píng)估種質(zhì)資源方面有廣泛的應(yīng)用前景；有人進(jìn)行了花生多態(tài)標(biāo)記的AFLP鑒定；有

10、人用AFLPW估了太平洋西北小麥品種的遺傳多樣性；還有人用了6個(gè)AFLP引物組合得到359個(gè)AFLPT增帶，對(duì)24個(gè)向日葵優(yōu)良品系的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。另周志勇等人采用雙酶切的方法，將 AFLP技術(shù)應(yīng)用于人參、西洋參基 因組指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)二者在遺傳上有較近的親緣關(guān)系，但引種到我國(guó)吉林的西 洋參與西洋參基因組DNA相比有一定變異，證明了 AFL吩子標(biāo)記技術(shù)有望成 為一種獨(dú)立的、確實(shí)可行的手段，用于人參、西洋參等藥用植物品種的鑒別。AFLP技術(shù)在植物輔助育種研究上的應(yīng)用？在指紋圖譜技術(shù)出現(xiàn)以前，基因圖 譜只能依靠植物的表現(xiàn)型和同工酶分析來(lái)建立DNA指紋圖譜，特別是AFLP技術(shù)的出現(xiàn)，使標(biāo)志的數(shù)量

11、大大增加，進(jìn)而使分辨率大大提高；特定農(nóng)業(yè)性狀與 標(biāo)志連鎖關(guān)系的建立在育種上有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，使得定向育種成為可能，不 僅減少了育種的工作量，而且還使時(shí)間縮短，使人們能在植物生長(zhǎng)早期就預(yù)知 它的某些性狀并加以篩選；Jonathan等人通過(guò)AFLP標(biāo)志研究番茄，發(fā)現(xiàn)許多 DNA標(biāo)志與番茄抗葉霉病菌的基因相聯(lián)系；同樣，ChristianeGebhardts小組發(fā)現(xiàn)29條AFLP標(biāo)志與馬鈴薯抗晚疫病菌的 R1基因有關(guān)，2條與抗抱2AFLP技術(shù)在植物基因表達(dá)與調(diào)控研究上的應(yīng)用 ？Bachem等人采用AFL限術(shù) 檢測(cè)了馬鈴薯塊莖發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)情況，他們利用3個(gè)引物組合，進(jìn)行塊莖發(fā)育不同時(shí)期的AFLP分

12、析，得到了塊莖特異轉(zhuǎn)錄的片段 TDFS 2個(gè)TDF科段 與關(guān)鍵基因LOX高度同源，且二者在塊莖的不同時(shí)期表達(dá)的量不一樣；表明了 AFL吃研究基因表達(dá)非常有效的方法，可同時(shí)比較植物不同時(shí)期以及分離某些 重要基因。AFLP技術(shù)在植物居群的遺傳結(jié)構(gòu)與保護(hù)生物學(xué)研究上的應(yīng)用？Travis等1996年第一次將AFLP產(chǎn)生的220個(gè)多態(tài)標(biāo)記用于評(píng)估一種臨界于瀕危的黃苣屬 (Astragalus加物 (Astragalus cremnophylaxvar. cremnophylaX 的 3 個(gè)已知居群的 居群內(nèi)與居群間的多態(tài)信息含量和遺傳變異的分配，他們還用AMOVA分析了居群間的分化；這些結(jié)果指出在居群內(nèi)

13、存在空間上分離的組，與UPGMA聚類(lèi)和主成分分析的結(jié)果一致；提出了保護(hù)這個(gè)物種的若干建議；Krauss和Peakell用AFLP對(duì)Persooniamollis的天然居群作了分析； Winfield1988年研究了英國(guó) Sevem地區(qū)黑楊亞種 Populasnigrasubsp.Betulifolia的遺傳多樣性；Breyne 等 1997年將Arabidopsisthaliana作為模式物種，用 AFL限術(shù)評(píng)估了基因組的多樣 性；他們認(rèn)為AFLPW十分相近的基因型之間的細(xì)微差異足夠靈敏，非常適合于 評(píng)估居群內(nèi)與居群間的多樣性水平和描述種下水平的遺傳關(guān)系；他們也用AFLP測(cè)定天然居群和熱帶樹(shù)種

14、的遺傳變異。其它方面的應(yīng)用？AFL限術(shù)除可以用于植物方面外還可以用于動(dòng)、微生物、 寄生蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、人群等方面。吳豐春等應(yīng)用AFL限術(shù)采用單酶切對(duì)小鼠進(jìn)行了遺傳檢測(cè)的研究，為小鼠從 DNA上的遺傳檢測(cè)提供了一種新的技術(shù)手段；AFLP技術(shù)在微生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也相當(dāng)廣泛，在微生物分類(lèi)、基因標(biāo)定、親緣關(guān)系 及遺傳多樣性研究都有不俗的表現(xiàn)，特別是微生物的鑒定和品系分析方面更是 成績(jī)可佳。在流行病檢測(cè)中 AFLP標(biāo)記已成為微生物病原體診斷的理想技術(shù)。在 腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究中，腫瘤易感基因的檢測(cè)是首要任務(wù)，而AFLPfe記為腫瘤基因組的檢測(cè)帶來(lái)了一種新的方法。是一種較為理想的技術(shù)。Fukuda T等用cDNA

15、-AFLFfe對(duì)大鼠高低轉(zhuǎn)移性骨 肉瘤基因組進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，得到 43條差異片段，通過(guò)篩選，克隆出與大鼠骨肉 瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的4種差異表達(dá)基因；Majima S等應(yīng)用同樣的方法克隆出與腎癌發(fā) 生相關(guān)的一種新基因一Niban; YamotoF應(yīng)用甲基化敏感-AFLPg術(shù)檢測(cè)了乳腺癌 的基因變化。這些都會(huì)對(duì)以后研究腫瘤發(fā)病機(jī)制發(fā)揮重要作用。五、對(duì)AFLP的評(píng)價(jià)？AFLRK術(shù)特點(diǎn)(1)所需DNA量少，擴(kuò)增效率高，多態(tài)性強(qiáng)，易于分辨。(2) AFL刖記結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性強(qiáng)，不受基因組來(lái)源和復(fù)雜度的影 響，使不同時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果可以進(jìn)行比較，有利于進(jìn)行回顧性研究， 并促進(jìn)信息與資料的交流，達(dá)到資源共享

16、。(3) AFL刖記呈典型的孟德?tīng)栠z傳，可作為物理圖譜和遺傳圖譜的聯(lián)系 橋梁，用于構(gòu)建基因組高密度連鎖圖譜。(4)圖譜構(gòu)建聚類(lèi)顯著，定位專(zhuān)(5) AFLP對(duì)模板濃度不敏感，允許一定強(qiáng)度的共擴(kuò)增，樣本 DNA量相 差1000倍仍可獲得相同的結(jié)果。作為DNA指紋技術(shù)的評(píng)價(jià)眾多研究者對(duì)RFLPR SSR, RAPD, AFLP種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了比較分析，綜合考慮遺傳穩(wěn)定性和標(biāo)記系統(tǒng)機(jī)制(速度、費(fèi)用、可靠性)，提出了標(biāo)記指數(shù) MI(Markerindex), MI是變異指數(shù)DI(Diversityindex邢有效復(fù)合比 EMR( Effective multiplex ratio)兩者的綜合反應(yīng)。D

17、I 是指信息含量即期望異質(zhì)性(Expected Heterozygosity) EMR是指單位實(shí)驗(yàn)里能同 時(shí)檢測(cè)到的位點(diǎn)數(shù)，MI實(shí)際上還包含了鑒定親緣關(guān)系的有效性這一層意思。應(yīng) 用這一評(píng)價(jià)體系，得出 AFLP具有最高的EMR, SSRM有最高的DI,這一結(jié)論已 在對(duì)菜豆及西北歐栽培馬鈴薯的研究中得到相互驗(yàn)證。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在種間水 平上，RFLP SSR AFLP具有很高的相關(guān)性，然而 RAPD與三者相關(guān)性低。如果 是在種內(nèi)水平上，則所有標(biāo)記系統(tǒng)相關(guān)性均低，1995年7月30日召開(kāi)的美國(guó)園藝學(xué)會(huì)（ASHS第92屆年會(huì)上，與會(huì)專(zhuān)家一致認(rèn)為四大標(biāo)記系統(tǒng)綜合效用大小應(yīng)該是 AFLP > SSR > RAPD>RFLP存在的問(wèn)題極其對(duì)策？AFL限術(shù)雖然是對(duì)生物基因組進(jìn)行分