新編免疫組化ppt課件

1、免疫細(xì)胞組織化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞組織化學(xué)技術(shù)病理教研室病理教研室金曉明金曉明主要講述內(nèi)容：主要講述內(nèi)容：第一部分第一部分 免疫細(xì)胞化學(xué)的理論基免疫細(xì)胞化學(xué)的理論基礎(chǔ)礎(chǔ)第二部分第二部分 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)第三部分第三部分 免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)第四部分第四部分 免疫電子顯微鏡技術(shù)免疫電子顯微鏡技術(shù)第一部分第一部分 免疫細(xì)胞化學(xué)的理論基礎(chǔ)免疫細(xì)胞化學(xué)的理論基礎(chǔ) 免疫細(xì)胞化學(xué)是免疫學(xué)與細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)是免疫學(xué)與細(xì)胞化學(xué)相結(jié)合的一個分支學(xué)科，以免化學(xué)相結(jié)合的一個分支學(xué)科，以免疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)為其理論基礎(chǔ)。疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)為其理論基礎(chǔ)。第一節(jié)第一節(jié) 抗原抗原antig

2、enantigen）一、抗原的概念一、抗原的概念 是一類在合適的條件下，能激是一類在合適的條件下，能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)在體內(nèi)和與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)在體內(nèi)和/ /或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?；蝮w外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。抗原的性能：免疫原性抗原的性能：免疫原性 產(chǎn)生免疫應(yīng)答產(chǎn)生免疫應(yīng)答 反應(yīng)原性反應(yīng)原性 產(chǎn)生特異性反應(yīng)產(chǎn)生特異性反應(yīng)二、抗原決定簇二、抗原決定簇 是與相應(yīng)抗體或淋巴細(xì)胞抗原識別受體相結(jié)是與相應(yīng)抗體或淋巴細(xì)胞抗原識別受體相結(jié)合的部位，是決定和控制抗原特異性的特殊化學(xué)合的部位，是決定和控制抗原特異性的特殊

3、化學(xué)基團(tuán)?；鶊F(tuán)。類型：功能性抗原決定簇類型：功能性抗原決定簇 隱蔽性抗原決定簇隱蔽性抗原決定簇 免疫優(yōu)勢決定簇免疫優(yōu)勢決定簇 線性或連續(xù)性決定簇線性或連續(xù)性決定簇 構(gòu)象決定簇或不連續(xù)性決定簇構(gòu)象決定簇或不連續(xù)性決定簇B 細(xì)胞所識別的是半抗原決定簇；細(xì)胞所識別的是半抗原決定簇；T細(xì)胞所識別的細(xì)胞所識別的是免疫原性決定簇或連續(xù)性決定簇。是免疫原性決定簇或連續(xù)性決定簇。三、抗原的性質(zhì)與種類三、抗原的性質(zhì)與種類（一抗原的性質(zhì)（一抗原的性質(zhì)1、抗原的異物性、抗原的異物性 機(jī)體能對進(jìn)入體內(nèi)的異種、異體的大分子物質(zhì)機(jī)體能對進(jìn)入體內(nèi)的異種、異體的大分子物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。該物質(zhì)與機(jī)體的種系關(guān)系愈遠(yuǎn)，其產(chǎn)生免疫應(yīng)

4、答。該物質(zhì)與機(jī)體的種系關(guān)系愈遠(yuǎn)，其免疫原性愈強(qiáng)，機(jī)體的免疫反應(yīng)也更強(qiáng)。免疫原性愈強(qiáng)，機(jī)體的免疫反應(yīng)也更強(qiáng)。自身抗原；自身抗體自身抗原；自身抗體2、大分子膠體、大分子膠體 作為抗原，分子愈大，其免疫原性愈強(qiáng)作為抗原，分子愈大，其免疫原性愈強(qiáng) 3、抗原的特異性、抗原的特異性 各種抗原物質(zhì)各有其特異的抗原決定簇，即一各種抗原物質(zhì)各有其特異的抗原決定簇，即一種抗體只能與相應(yīng)的抗原起反應(yīng)而不能與其它抗原種抗體只能與相應(yīng)的抗原起反應(yīng)而不能與其它抗原反應(yīng)。反應(yīng)。（二抗原的種類方法（二抗原的種類方法 分類依據(jù)分類依據(jù) 品種品種單獨存在時是否有免疫原性單獨存在時是否有免疫原性 半抗原和完全半抗原和完全抗原抗原抗

5、原來源抗原來源 外源性抗原和外源性抗原和內(nèi)源性抗原內(nèi)源性抗原抗原與宿主關(guān)系抗原與宿主關(guān)系 異種抗原，同異種抗原，同種異體抗原，自身抗原種異體抗原，自身抗原B細(xì)胞產(chǎn)生抗體時是否需要細(xì)胞產(chǎn)生抗體時是否需要T細(xì)胞輔助細(xì)胞輔助 胸腺依賴抗原，胸腺依賴抗原，胸腺非依賴抗原胸腺非依賴抗原化學(xué)物質(zhì)化學(xué)物質(zhì) 蛋白質(zhì)，多糖，蛋白質(zhì)，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白， 核酸等核酸等物理狀態(tài)物理狀態(tài) 顆粒性抗原，顆粒性抗原，可溶性抗原可溶性抗原產(chǎn)生方式產(chǎn)生方式 天然抗原，人天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原工合成抗原，基因工程抗原抗原特異性程度抗原特異性程度 特異性抗原，特異性抗原，共同抗原共

6、同抗原完全抗原：同時具有免疫原性和反應(yīng)原性的物質(zhì)。完全抗原：同時具有免疫原性和反應(yīng)原性的物質(zhì)。不完全抗原或半抗原：無免疫原性。不完全抗原或半抗原：無免疫原性。第二節(jié)第二節(jié) 抗體抗體antibodyantibody）一、抗體的概念一、抗體的概念 機(jī)體受到抗原刺激后，通過體液機(jī)體受到抗原刺激后，通過體液免疫應(yīng)答，免疫應(yīng)答，B B淋巴細(xì)胞活化、增殖、分淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白。僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白。二、抗體的性質(zhì)和種類二、抗體的性質(zhì)和種類（一抗體的一般性質(zhì)（一抗體的一般性質(zhì) 免疫球蛋白約等于抗體

7、，分五類：免疫球蛋白約等于抗體，分五類：IgG,IgM,IgA,IgD,IgEIgG,IgM,IgA,IgD,IgE（二免疫原性和分類特性（二免疫原性和分類特性 免疫球蛋白都是大分子蛋白質(zhì)，具有免疫原性，課作為免疫球蛋白都是大分子蛋白質(zhì)，具有免疫原性，課作為抗原。由于存在著輕鏈和重鏈，可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)，因而，抗原。由于存在著輕鏈和重鏈，可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)，因而，分子結(jié)構(gòu)差異較大，免疫原性比較復(fù)雜。分子結(jié)構(gòu)差異較大，免疫原性比較復(fù)雜。（三抗體的種類（三抗體的種類1、根據(jù)抗體的途徑或來源不同分為、根據(jù)抗體的途徑或來源不同分為免疫抗體；天然抗體；自身抗體免疫抗體；天然抗體；自身抗體2、根據(jù)抗原抗體在試管內(nèi)

8、是否出現(xiàn)肉眼反應(yīng)分為、根據(jù)抗原抗體在試管內(nèi)是否出現(xiàn)肉眼反應(yīng)分為完全抗體；不完全抗體完全抗體；不完全抗體三、抗原與抗體反應(yīng)三、抗原與抗體反應(yīng) 稱為免疫學(xué)反應(yīng)。稱為免疫學(xué)反應(yīng)。在體內(nèi)進(jìn)行稱為免疫反應(yīng)；在體外稱為血清學(xué)反在體內(nèi)進(jìn)行稱為免疫反應(yīng)；在體外稱為血清學(xué)反應(yīng)應(yīng)四、抗體形成的機(jī)制四、抗體形成的機(jī)制（一免疫應(yīng)答的產(chǎn)生（一免疫應(yīng)答的產(chǎn)生1、感應(yīng)階段識別及加工處理抗原階段）、感應(yīng)階段識別及加工處理抗原階段）2、反應(yīng)階段淋巴細(xì)胞增殖分化階段）、反應(yīng)階段淋巴細(xì)胞增殖分化階段）3、效應(yīng)階段發(fā)生免疫反應(yīng)階段）、效應(yīng)階段發(fā)生免疫反應(yīng)階段）（二影響抗體產(chǎn)生的因素（二影響抗體產(chǎn)生的因素1、抗原的質(zhì)和量、抗原的質(zhì)和量

9、2、機(jī)體方面、機(jī)體方面3、佐劑的增強(qiáng)免疫作用、佐劑的增強(qiáng)免疫作用第三節(jié)第三節(jié) 有關(guān)基本技術(shù)方法有關(guān)基本技術(shù)方法一、抗體的制備一、抗體的制備（一抗體的制備方法（一抗體的制備方法 能制備出具有很高特異性和敏感能制備出具有很高特異性和敏感性的高效價多克隆和單克隆抗體。性的高效價多克隆和單克隆抗體。1.1.多克隆抗體血清抗體：指機(jī)體接受抗原主動免疫或被動多克隆抗體血清抗體：指機(jī)體接受抗原主動免疫或被動免疫后從血清中分離提純的抗體。免疫后從血清中分離提純的抗體。2.2.單克隆抗體：是單克隆抗體：是19751975年由年由Kohlenh MilsteinKohlenh Milstein發(fā)明的一種新技發(fā)明的

10、一種新技術(shù)。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞和免疫的脾細(xì)胞相融合，術(shù)。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞和免疫的脾細(xì)胞相融合，產(chǎn)生雜交細(xì)胞。這種融合的雜交細(xì)胞既有骨髓細(xì)胞的無限生長產(chǎn)生雜交細(xì)胞。這種融合的雜交細(xì)胞既有骨髓細(xì)胞的無限生長能力，又有漿細(xì)胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細(xì)胞純化，能力，又有漿細(xì)胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細(xì)胞純化，成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專一的高純度的抗體，即單克隆成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專一的高純度的抗體，即單克隆抗體抗體monoclonal antibody, McAb)monoclonal antibody, McAb)單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較單克隆抗體與多克

11、隆抗體特性的比較 特性特性 多克隆多克隆 單克隆單克隆組成組成 多種類抗體的混合物多種類抗體的混合物 單一種類的抗體單一種類的抗體 特異性特異性 低低 高高 針對多個抗原決定族針對多個抗原決定族 針對單一的抗原決定族針對單一的抗原決定族親和力親和力 平均親和力較高平均親和力較高 不定，較低不定，較低交叉反應(yīng)交叉反應(yīng) 高高 低低（二抗體的配制方法（二抗體的配制方法1、抗體貯存、抗體貯存2、抗體使用液的配制、抗體使用液的配制二、組織材料的處理二、組織材料的處理 盡量保存好抗原性不丟失、不擴(kuò)散、不被破盡量保存好抗原性不丟失、不擴(kuò)散、不被破壞壞三、免疫染色三、免疫染色1、增強(qiáng)特異性染色方法、增強(qiáng)特異性

12、染色方法蛋白酶消化法；合適的抗體稀釋度；溫育時間蛋白酶消化法；合適的抗體稀釋度；溫育時間2、減少或消除非特異性染色方法、減少或消除非特異性染色方法3、顯色反應(yīng)的控制、顯色反應(yīng)的控制4、復(fù)染、復(fù)染四、對照四、對照 陽性對照；陰性對照陽性對照；陰性對照五、結(jié)果的判斷五、結(jié)果的判斷（一陽性細(xì)胞的染色特性（一陽性細(xì)胞的染色特性1、分胞漿、細(xì)胞核、細(xì)胞膜表面陽性、分胞漿、細(xì)胞核、細(xì)胞膜表面陽性2、灶狀和彌漫性、灶狀和彌漫性3、非特異性的認(rèn)知、非特異性的認(rèn)知4、切片質(zhì)量不佳出現(xiàn)的陽性要排除、切片質(zhì)量不佳出現(xiàn)的陽性要排除（二染色失敗的幾種原因（二染色失敗的幾種原因第二部分第二部分免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光

13、細(xì)胞化學(xué)技術(shù) Coons等等1941通過熒光標(biāo)記通過熒光標(biāo)記抗體，并借助于熒光顯微鏡觀察熒光抗體，并借助于熒光顯微鏡觀察熒光的發(fā)光物質(zhì)，而建立的該項技術(shù)。的發(fā)光物質(zhì)，而建立的該項技術(shù)。 近年來，與激光技術(shù)、電子計算近年來，與激光技術(shù)、電子計算機(jī)、掃描電鏡等技術(shù)的結(jié)合發(fā)展為定機(jī)、掃描電鏡等技術(shù)的結(jié)合發(fā)展為定量免疫熒光技術(shù)。加之熒光激活細(xì)胞量免疫熒光技術(shù)。加之熒光激活細(xì)胞分類器的應(yīng)用和激光共聚焦顯微鏡的分類器的應(yīng)用和激光共聚焦顯微鏡的問世，開創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領(lǐng)域。問世，開創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領(lǐng)域。第一節(jié)第一節(jié) 原理原理一、基本原理一、基本原理 免疫熒光技術(shù)也是根據(jù)抗原抗體免疫熒光技術(shù)也是根據(jù)抗

14、原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體或抗原作為探針檢測組織熒光抗體或抗原作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體）?；蚣?xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原或抗體）。二、熒光產(chǎn)生的原理二、熒光產(chǎn)生的原理 分子都含有電子，電子載不斷的分子都含有電子，電子載不斷的運動著。運動著。 一般情況下，電子總是處于能量一般情況下，電子總是處于能量最低的能級即基態(tài)）最低的能級即基態(tài)） 在一定的條例下，電子可吸收能在一定的條例下，電子可吸收能量躍遷到較高的能量級即激發(fā)態(tài)），量躍遷到較高的能量級即激發(fā)態(tài)），這個過程叫激發(fā)。

15、這個過程叫激發(fā)。二、熒光素二、熒光素1、熒光色素、熒光色素 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為。特性：必須具備吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光；特性：必須具備吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光；具有吸收具有吸收 一定頻率光能的生色團(tuán)和能產(chǎn)生一定光亮一定頻率光能的生色團(tuán)和能產(chǎn)生一定光亮子的熒光子的熒光 團(tuán)。團(tuán)。2、用于標(biāo)記抗體的熒光素必須具備以下條件：、用于標(biāo)記抗體的熒光素必須具備以下條件：1應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基因，結(jié)合后不應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基因，結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物容易排除。易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物容易排除

16、。2熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合熒光效率下降不多。熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合熒光效率下降不多。3結(jié)合抗體蛋白后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響。結(jié)合抗體蛋白后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響。4與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡便而快速。與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法簡便而快速。5熒光素容易溶解，溶解后不會與其它物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。熒光素容易溶解，溶解后不會與其它物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。6熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。判斷結(jié)果。3、熒光素的類型、熒光素的類型1異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素fluorescien isothocyanate, FITC)2四

17、甲基異硫氰酸羅達(dá)明四甲基異硫氰酸羅達(dá)明tetraethyl rhodamine isothocyanate, TRITC)3四乙基羅達(dá)明四乙基羅達(dá)明tetraethyl rhodamine, RB200)4其它其它三、免疫熒光染色方法三、免疫熒光染色方法1、直接法：用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，、直接法：用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異制成特異 性熒光抗體，直接用于細(xì)胞和組織抗原性熒光抗體，直接用于細(xì)胞和組織抗原的檢查。的檢查。優(yōu)點：特異性高優(yōu)點：特異性高缺點：一種熒光缺點：一種熒光 抗體只能抗體只能 檢測一種檢測一種 抗原。抗原。2、間接法：用特異性的抗體、間接法：用特異性的抗體1抗與

18、細(xì)胞或組織標(biāo)本反抗與細(xì)胞或組織標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖液洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒應(yīng)，隨后用緩沖液洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體光抗體2抗與結(jié)合再抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原抗與結(jié)合再抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原 抗體抗體 熒光抗體的復(fù)合物。熒光抗體的復(fù)合物。優(yōu)點：熒光亮度增強(qiáng)，優(yōu)點：熒光亮度增強(qiáng)， 提高了敏感度提高了敏感度四、非特異性染色的消除方法四、非特異性染色的消除方法1、非特異性染色的主要因素、非特異性染色的主要因素1部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成聚合物和衍化部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。物而不能被透析除去。2抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成

19、熒光素脲抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分非特異結(jié)合。蛋白，可與組織成分非特異結(jié)合。3組織內(nèi)類屬抗原的存在。組織內(nèi)類屬抗原的存在。4從組織中難以提純抗原性物質(zhì)。從組織中難以提純抗原性物質(zhì)。5抗體分子上標(biāo)記的熒光素太多?？贵w分子上標(biāo)記的熒光素太多。6熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)。熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)。7細(xì)胞和組織內(nèi)某些物質(zhì)自發(fā)熒光。細(xì)胞和組織內(nèi)某些物質(zhì)自發(fā)熒光。8染色時間過長，溫度過高，沖洗不夠或標(biāo)本干燥。染色時間過長，溫度過高，沖洗不夠或標(biāo)本干燥。2、消除的方法、消除的方法1襯染法可抑制自發(fā)熒光）襯染法可抑制自發(fā)熒光）2胰蛋白酶消化可抑制非特異性熒光）胰蛋白酶消化可抑

20、制非特異性熒光）3吸收用小屬肝粉消除組織非特異性熒光的染色）吸收用小屬肝粉消除組織非特異性熒光的染色）4用正常非免疫血清清除自發(fā)熒光和非特異性用正常非免疫血清清除自發(fā)熒光和非特異性熒光）熒光）5提高抗體和熒光抗體的質(zhì)量提高抗體和熒光抗體的質(zhì)量五、熒光顯微鏡及檢測方法五、熒光顯微鏡及檢測方法略略六、染色標(biāo)本的保存六、染色標(biāo)本的保存 原則上應(yīng)立即再熒光顯微鏡下觀察，拍照，原則上應(yīng)立即再熒光顯微鏡下觀察，拍照，此時熒光最強(qiáng)。此時熒光最強(qiáng)。 用緩沖甘油封片，保存在用緩沖甘油封片，保存在4中，過夜后特中，過夜后特異性熒光強(qiáng)度減弱異性熒光強(qiáng)度減弱25，保存，保存1周后減弱周后減弱60。Nikon熒光顯微鏡

21、熒光顯微鏡腎活檢直接法）腎活檢直接法）腎活檢直接法）腎活檢直接法）腎活檢直接法）腎活檢直接法）低倍視野低倍視野腎活檢直接法），表達(dá)弱腎活檢直接法），表達(dá)弱腎活檢直接法）腎活檢直接法）腎活檢直接法）腎活檢直接法）左圖：表達(dá)在細(xì)胞左圖：表達(dá)在細(xì)胞核核FITC）右圖：表達(dá)在胞膜右圖：表達(dá)在胞膜左圖：左圖：DAPI 染色染色染核）染核）右圖：胃胃粘粘膜膜上上皮皮細(xì)細(xì)胞，胞，胞胞漿漿胞胞膜膜陽陽性性血血管管內(nèi)內(nèi)彈彈力力膜膜陽陽性性胃胃腺腺癌癌第三部分第三部分免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是免疫組免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是免疫組織化學(xué)中最常見的方法之一，它是織化學(xué)中最常見的方法之一，它

22、是在抗原抗體特異性反應(yīng)存在的前提在抗原抗體特異性反應(yīng)存在的前提條件下，借助于酶學(xué)細(xì)胞化學(xué)手段，條件下，借助于酶學(xué)細(xì)胞化學(xué)手段，檢測某種物質(zhì)抗原檢測某種物質(zhì)抗原/抗體組織細(xì)抗體組織細(xì)胞內(nèi)存在部位的一門新技術(shù)。胞內(nèi)存在部位的一門新技術(shù)。第一節(jié)第一節(jié) 免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)一、取材一、取材1.1.實驗動物實驗動物 麻醉麻醉 （處死），鋒利刀片切成大?。ㄌ幩溃?，鋒利刀片切成大小適中，厚度適中，厚度3mm3mm4mm4mm。 小型實驗動物：灌注流固定后小型實驗動物：灌注流固定后取材取材 （生理鹽水和（生理鹽水和4 4多聚多聚甲醛）甲醛） 2.2.人體材料人體材料 活檢組織、手術(shù)標(biāo)本

23、、細(xì)胞和組織活檢組織、手術(shù)標(biāo)本、細(xì)胞和組織二、固定二、固定 原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測抗原的前提下，原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測抗原的前提下，應(yīng)采用應(yīng)采用濃度最低的固定劑和最短的固定時間，固定時間一般濃度最低的固定劑和最短的固定時間，固定時間一般為為1 112h12h。1.1.常用的固定劑常用的固定劑（1 1甲醛緩沖液甲醛緩沖液 廣泛應(yīng)用于病理標(biāo)本的固定，甲醛在很好地保護(hù)廣泛應(yīng)用于病理標(biāo)本的固定，甲醛在很好地保護(hù)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的同時也有效地保存某些抗原。由組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的同時也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交聯(lián)作用會影響被固定細(xì)胞膜的通透性不利于甲醛的交聯(lián)作用會影響被固定細(xì)胞膜的通透

24、性不利于染色時抗體的滲透，因此染色前常用酶進(jìn)行消化以于染色時抗體的滲透，因此染色前常用酶進(jìn)行消化以使抗原決定簇充分暴露，固定時間不直超過使抗原決定簇充分暴露，固定時間不直超過24h24h。（2 24 4多聚甲醛磷酸緩沖液多聚甲醛磷酸緩沖液 廣泛應(yīng)用于光鏡細(xì)胞化學(xué)研究。廣泛應(yīng)用于光鏡細(xì)胞化學(xué)研究。（3 3戊二醛多聚甲醛緩沖液戊二醛多聚甲醛緩沖液 適用于光鏡、電鏡免疫組織化學(xué)研究。適用于光鏡、電鏡免疫組織化學(xué)研究。（4 4其它其它 如如PLPPLP液過碘酸液過碘酸 賴賴AAAA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇多聚甲醛固定液）、丙酮及醇 類、鋨酸等。類、鋨酸等。2.2.固定注意事項固定注意事項（1 1固定

25、液的選擇標(biāo)準(zhǔn)：固定液的選擇標(biāo)準(zhǔn)：A. A. 組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好。組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好。 B. B. 最大限度保存抗原的抗原性。最大限度保存抗原的抗原性。（2 2組織塊的大?。航M織塊的大?。?.5cm1.5cm1.5cm1.5cm0.5cm0.5cm為宜。為宜。（3 3固定時間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成反比。固定時間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成反比。（4 4溫度：一般在室溫下進(jìn)行，電鏡標(biāo)本和固定時間較長時溫度：一般在室溫下進(jìn)行，電鏡標(biāo)本和固定時間較長時 可放置在可放置在44冰箱。冰箱。（5 5固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑。固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑。三、包埋

26、三、包埋 1. 1.石蠟包埋石蠟包埋 2. 2.冷凍包埋冷凍包埋 3. 3.環(huán)氧樹脂包理環(huán)氧樹脂包理四、切片四、切片 1. 1.載玻片的處理載玻片的處理（1 1清洗清洗 （2 2涂膠防止脫片）。常用粘附劑：涂膠防止脫片）。常用粘附劑：明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠。樹脂膠：也稱白膠。明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠。樹脂膠：也稱白膠。 多聚賴氨酸多聚賴氨酸PLLPLL）。商品化粘附劑。）。商品化粘附劑。2.2.切片類型切片類型（l l石蠟切片石蠟切片 厚約厚約3 3 5m 5m，放置，放置3737溫箱烘烤過夜，以減少脫片。溫箱烘烤過夜，以減少脫片。（2 2冷凍切片：冷凍切片：2m2m。（3 3振動切片：特點

27、是組織經(jīng)固定后不需包埋，只要用振動切片：特點是組織經(jīng)固定后不需包埋，只要用膠水粘在載物臺上即可切片。切片較厚，可將陽性部位作膠水粘在載物臺上即可切片。切片較厚，可將陽性部位作電鏡包埋。神經(jīng)組織應(yīng)用較多。電鏡包埋。神經(jīng)組織應(yīng)用較多。第二節(jié)第二節(jié) 免疫組化染色過程中基本技術(shù)免疫組化染色過程中基本技術(shù)一、蛋白酶消化技術(shù)一、蛋白酶消化技術(shù) 進(jìn)行固定時，抗原決定簇有可能被進(jìn)行固定時，抗原決定簇有可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應(yīng)前，固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應(yīng)前，常用蛋白酶處理組織切片，使抗原決定常用蛋白酶處理組織切片，使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織的通透性增簇充分暴露出來，并使組織的通透性

28、增高，以利抗原抗體最大限度地結(jié)合增強(qiáng)高，以利抗原抗體最大限度地結(jié)合增強(qiáng)特異性染色。特異性染色。1.1.常用的消化酶常用的消化酶 胰蛋白酶、胃蛋白酶胰蛋白酶、胃蛋白酶2.2.消化時間消化時間 因組織而異，一般為因組織而異，一般為5 530min30min，消，消化時間不宜太長，以免損傷組織形態(tài)，化時間不宜太長，以免損傷組織形態(tài)，破壞抗原決定族。消化結(jié)束后要充分洗破壞抗原決定族。消化結(jié)束后要充分洗滌，以除去殘留的蛋白酶。滌，以除去殘留的蛋白酶。3.3.非特異染色的控制非特異染色的控制 非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬于特異性抗原抗

29、體反應(yīng)所出現(xiàn)的染色。于特異性抗原抗體反應(yīng)所出現(xiàn)的染色。（1 1原因分析原因分析組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光、內(nèi)源性過氧化物酶或堿組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光、內(nèi)源性過氧化物酶或堿 性磷酸酶、內(nèi)源性生物素等性磷酸酶、內(nèi)源性生物素等. .試劑方面：因抗體不純、標(biāo)記的酶和熒光不純或標(biāo)記過量等。試劑方面：因抗體不純、標(biāo)記的酶和熒光不純或標(biāo)記過量等。（2 2消除方法消除方法 加加1 1抗前加正常血清抗前加正常血清101030min30min，以封閉組織中帶電荷的基，以封閉組織中帶電荷的基因，避免與因，避免與1 1抗的非特異性結(jié)合。抗的非特異性結(jié)合。 減少非特異性染色：減少非特異性染色：a.a.免疫酶

30、組化染色時，在加免疫酶組化染色時，在加1 1抗前，用抗前，用0.3%0.3%的的H2O2H2O2甲醇溶液將組甲醇溶液將組織切片處理織切片處理30min30min3%3%的的H2O2H2O2甲醇溶液處理甲醇溶液處理5 510min10min）。）。b.b.免疫熒光染色時，可用免疫熒光染色時，可用0.010.010.050.05伊文思藍(lán)稀釋熒光抗體。伊文思藍(lán)稀釋熒光抗體。二、對照二、對照 陽性對照片：用已知抗原為陽性的標(biāo)本作對照陽性對照片：用已知抗原為陽性的標(biāo)本作對照 陰性對照片：確認(rèn)不含己知抗原的標(biāo)本作對照陰性對照片：確認(rèn)不含己知抗原的標(biāo)本作對照三、抗體的分裝、稀釋、滴加及保存三、抗體的分裝、稀

31、釋、滴加及保存1.1.抗體的分裝抗體的分裝 不能用完的抗體分裝在小的不能用完的抗體分裝在小的EPEP管內(nèi)，保存在管內(nèi)，保存在-20-20-40-40的低溫冰箱中持用可保持?jǐn)?shù)年有效。的低溫冰箱中持用可保持?jǐn)?shù)年有效。2.2.抗體稀釋抗體稀釋 常用常用0.01MPBS0.01MPBS磷酸緩沖溶液或磷酸緩沖溶液或BSABSA牛血清白牛血清白蛋白）蛋白）3.3.滴加滴加 滴加抗體要充分覆蓋組織切片，一般加滴加抗體要充分覆蓋組織切片，一般加 30 3050L,50L,最好在滴加前，用蠟筆或特制的組化筆在組織最好在滴加前，用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫一圈周圍畫一圈, ,以防溶液的擴(kuò)散。以防溶液的擴(kuò)散。4

32、.4.保管保管 未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存，已稀釋未未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存，已稀釋未用完的抗體最好在一周內(nèi)用完，不宜長期保存。用完的抗體最好在一周內(nèi)用完，不宜長期保存。 四、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)和酶標(biāo)抗體技術(shù)四、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)和酶標(biāo)抗體技術(shù)1.1.免疫酶染色原理免疫酶染色原理 用酶作為標(biāo)記物，可分為直接法、間接法、補(bǔ)體用酶作為標(biāo)記物，可分為直接法、間接法、補(bǔ)體法、免法、免疫酶橋法、免疫酶雙橋法、過氧化物酶抗過氧化物酶疫酶橋法、免疫酶雙橋法、過氧化物酶抗過氧化物酶法法（PAPPAP法和雙法和雙PAPPAP法等。法等。（1 1直接法原理：用酶直接標(biāo)記在特異性直接法原理：用酶直

33、接標(biāo)記在特異性1 1抗上，與抗上，與標(biāo)本中的標(biāo)本中的 抗原結(jié)合，讓酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物，抗原結(jié)合，讓酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉淀在抗沉淀在抗 原抗體反應(yīng)部位，即可在鏡下對標(biāo)本的抗原進(jìn)原抗體反應(yīng)部位，即可在鏡下對標(biāo)本的抗原進(jìn)行檢測。行檢測。優(yōu)點：簡便、快速、特異性強(qiáng)；缺點：敏感性差。優(yōu)點：簡便、快速、特異性強(qiáng)；缺點：敏感性差。 （2 2間接法原理：先用標(biāo)記的特異性間接法原理：先用標(biāo)記的特異性1 1抗與標(biāo)本中相應(yīng)抗原抗與標(biāo)本中相應(yīng)抗原結(jié)合，再用酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體結(jié)合，再用酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體2 2抗孵育，然后再加抗孵育，然后再加 酶的底物，顯示抗原抗體抗原抗體復(fù)合物存在的部酶的底物，顯

34、示抗原抗體抗原抗體復(fù)合物存在的部 位，以對抗原進(jìn)行檢測。位，以對抗原進(jìn)行檢測。如：如：1 1抗是由兔產(chǎn)生的多克隆抗體抗是由兔產(chǎn)生的多克隆抗體, ,則則2 2抗常用羊抗兔抗常用羊抗兔IgGIgG； 1 1抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體, ,則則2 2抗常用羊或馬抗鼠抗常用羊或馬抗鼠IgGIgG。以上兩種方法稱為酶標(biāo)抗體法以上兩種方法稱為酶標(biāo)抗體法（3 3非酶標(biāo)記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物，產(chǎn)生非酶標(biāo)記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物，產(chǎn)生抗酶的抗體。通過酶與抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記。該方法抗酶的抗體。通過酶與抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記。該方法適用于石蠟包埋的組織切片。適用于

35、石蠟包埋的組織切片。常用的有常用的有PAPPAP、sABCsABC、LsABLsAB法附圖表說明）法附圖表說明）（酶標(biāo)識特異抗體（酶標(biāo)識特異抗體（酶標(biāo)識二次抗體（酶標(biāo)識二次抗體生物素生物素 HRPALPALP2.2.常用的酶種類常用的酶種類 底物底物 沉淀顏色沉淀顏色HRP A.3,3HRP A.3,3氨基聯(lián)苯胺氨基聯(lián)苯胺DABDABH2O2 H2O2 深褐色深褐色 B.5 B.5氨基水楊酸氨基水楊酸 H2O2 H2O2 棕色棕色ALP A.ALP A.苯酚磷酸鹽重氮鹽紅色苯酚磷酸鹽重氮鹽紅色 B.P B.P校際酚磷酸鹽黃色校際酚磷酸鹽黃色酸性磷酸酶酸性磷酸酶 Gomoui Gomoui液液葡

36、萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 D D葡萄糖葡萄糖MTTMTT酚嗪磷酸酚嗪磷酸 甲酯化合物甲酯化合物 藍(lán)色藍(lán)色第三節(jié)第三節(jié) 免疫組化的實際操作免疫組化的實際操作1.1.實驗準(zhǔn)備必須器材）實驗準(zhǔn)備必須器材） （1 1實驗臺：光線充足，方便操作。實驗臺：光線充足，方便操作。 （2 2濕潤盒：放置抗原抗體反應(yīng)過程中濕潤盒：放置抗原抗體反應(yīng)過程中反應(yīng)，避免干燥。反應(yīng)，避免干燥。 （3 3微量移液器：微量移液器：1 120l,2020l,20200l,100200l,1001000l1000l。 （4 4其它：濾紙、紗布、吸頭、其它：濾紙、紗布、吸頭、EPEP管、管、染缸、提籃等。染缸、提籃等。2.2.試劑藥品

37、試劑藥品 （1 1緩沖液：緩沖液：PBS,0.01 MPBS,0.01 M磷酸緩沖液磷酸緩沖液pH7.2pH7.2） TBS,0.05 M Tris TBS,0.05 M Tris鹽酸緩鹽酸緩沖液沖液pH7.6pH7.6） （2 2抗體稀釋液抗體稀釋液: 1: 1BSABSA或或0.01 MPBS0.01 MPBS （3 310102 2抗免疫動物的正常血清抗免疫動物的正常血清 （4 4DBADBAH2O2H2O2顯色液顯色液 （5 5核復(fù)染液：蘇木素或甲基綠核復(fù)染液：蘇木素或甲基綠 3.sABC法的操作過程基本原理：sABCstrepto-avidin-biotin peroxidase c

38、omplex鏈球菌抗生物素卵白蛋）生物素過氧化物酶復(fù)合物生物素(biotin):是一種分子量為244da的小分子的維生素。 抗生物素(avidin):是一種糖蛋白，分子量為68KDa。 生物素與抗生物素有很強(qiáng)的親和力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時生物素與抗生物素都有與其它示蹤劑如熒光素，膠體金和過氧化物酶等相結(jié)合的能力。所以生物素-抗生物素系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)及方便快速等顯著優(yōu)點。附基本操作步驟第四節(jié)第四節(jié) 注意事項及結(jié)果判定注意事項及結(jié)果判定 要想得到理想的結(jié)果，組織細(xì)胞形要想得到理想的結(jié)果，組織細(xì)胞形態(tài)的保存、抗原性的保存、充分的顯示態(tài)的保存、抗原性的保存、充分的顯示是非常必要的。要

39、滿足這些條件，取材、是非常必要的。要滿足這些條件，取材、固定、切片厚度、操作過程、抗體濃度固定、切片厚度、操作過程、抗體濃度及特異性的選擇、操作前蛋白酶的消化、及特異性的選擇、操作前蛋白酶的消化、抗原修復(fù)及顯色等各程序的操作不當(dāng)均抗原修復(fù)及顯色等各程序的操作不當(dāng)均可導(dǎo)致不滿意結(jié)果的產(chǎn)生?？蓪?dǎo)致不滿意結(jié)果的產(chǎn)生。1. 取材固定取材固定 標(biāo)本要盡可能新鮮，取材固定要及時，固定液要新標(biāo)本要盡可能新鮮，取材固定要及時，固定液要新 鮮鮮充足，防止組織破壞和抗原性的失活。充足，防止組織破壞和抗原性的失活。2. 切片切片 切片不宜過厚，一般切片不宜過厚，一般4m左右。切片不宜過大，載玻左右。切片不宜過大，載

40、玻片要涂粘附劑，以防脫片。切好的切片暫放片要涂粘附劑，以防脫片。切好的切片暫放37溫箱保溫箱保存。存。3.3.脫蠟脫蠟 脫蠟一定要徹底，新鮮二甲苯脫蠟一定要徹底，新鮮二甲苯 5min 5min3 3。4.4.蛋白酶消化蛋白酶消化 由于組織在固定時抗原決定簇可能被固定劑所封閉，因此由于組織在固定時抗原決定簇可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應(yīng)前常用蛋白酶處理組織切片根據(jù)在抗原抗體反應(yīng)前常用蛋白酶處理組織切片根據(jù)1 1抗要求），抗要求），使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織通透性增高，使抗體充使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織通透性增高，使抗體充分結(jié)合抗原，增強(qiáng)特異性染色。一般用分結(jié)合抗原，增強(qiáng)特

41、異性染色。一般用0.1%0.1%胰蛋白酶或胃蛋白胰蛋白酶或胃蛋白酶消化酶消化5 530min30min。5.5.抗原修復(fù)抗原修復(fù) 一般在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液內(nèi)，微波爐，一般在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液內(nèi)，微波爐，85859595，10min10min左右。左右。6.6.抗體的選擇抗體的選擇 選擇抗體時要注意是用于冰凍切片還是用于石蠟切片的抗選擇抗體時要注意是用于冰凍切片還是用于石蠟切片的抗體，或是二者均可；其次要看抗體說明，是單抗還是多抗；適體，或是二者均可；其次要看抗體說明，是單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來源于哪種動物，由此來選擇用于哪些組織；抗體來源于哪種動物，由此來選擇2 2抗；還有抗；還有

42、抗體的稀度在實驗前根據(jù)預(yù)實驗選擇最佳濃度?？贵w的稀度在實驗前根據(jù)預(yù)實驗選擇最佳濃度。7.7.特異性的確定特異性的確定 陰性對照不加陰性對照不加1 1抗，用抗，用PBSPBS或或TBSTBS代替）代替） 陽性對照已知確定陽性的組織或買陽性對照片陽性對照已知確定陽性的組織或買陽性對照片顯色：注意顯色：注意H2O2H2O2的濃度，必須在顯示前加入的濃度，必須在顯示前加入H2O2H2O2均勻攪拌，最均勻攪拌，最佳顯色時間在佳顯色時間在3 35min5min，過短或過長都不會出現(xiàn)滿意的效果。，過短或過長都不會出現(xiàn)滿意的效果。 9. 9.復(fù)染復(fù)染 一般用蘇木素一般用蘇木素30s30s1min1min，過長

43、復(fù)染將掩蓋免疫組化的染色，過長復(fù)染將掩蓋免疫組化的染色效果。效果。10.10.結(jié)果判定結(jié)果判定 判斷是否陽性或陰性，要排除假陽性或假陰性結(jié)果。也要學(xué)判斷是否陽性或陰性，要排除假陽性或假陰性結(jié)果。也要學(xué)會判斷特異性染色和非特異性染色。呈色深淺可反映抗原存在的會判斷特異性染色和非特異性染色。呈色深淺可反映抗原存在的數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。數(shù)量，可作為定性、定位和定量的依據(jù)。 有關(guān)陽性結(jié)果的定量判斷，常規(guī)的方法是根據(jù)呈色深淺和陽有關(guān)陽性結(jié)果的定量判斷，常規(guī)的方法是根據(jù)呈色深淺和陽性細(xì)胞數(shù)量分類計算，以（性細(xì)胞數(shù)量分類計算，以（- -）,+,+,+,+,+,+等分級和計數(shù)統(tǒng)計。等分級和計數(shù)

44、統(tǒng)計。以下用圖片說明以下用圖片說明胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移cerbB-2cerbB-2癌基因表達(dá)癌基因表達(dá)sABCsABC法法胃癌，胃癌，P53P53抑癌基因表達(dá)，抑癌基因表達(dá)， sABC sABC法法胃癌胃癌CerbB-2CerbB-2的表達(dá)，的表達(dá)， sABC sABC法法胃癌胃癌cerbB-2cerbB-2的淋巴管侵襲，的淋巴管侵襲， sABC sABC法法胃淋巴組織反應(yīng)胃淋巴組織反應(yīng)性增生，性增生，CD20/CD43CD20/CD43檢測檢測sABCsABC法法胃組織中的反應(yīng)性增生的淋巴組織，胃組織中的反應(yīng)性增生的淋巴組織，CD43CD43表達(dá)，表達(dá)， sABC sABC法法IgA

45、NIgAN，TGFs2TGFs2表達(dá)，主要在近曲腎小管內(nèi)，表達(dá)，主要在近曲腎小管內(nèi)， sABC sABC法法IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表達(dá)，的表達(dá)，sABCsABC法法IgANIgAN，bFGFbFGF的表達(dá)，的表達(dá)， sABC sABC法法IgAN, PDGFIgAN, PDGF的表達(dá)，的表達(dá)， sABC sABC法法骨骼肌營養(yǎng)不良，骨骼肌營養(yǎng)不良，myosinmyosin蛋白表達(dá)，蛋白表達(dá)， sABC sABC法法第五節(jié)第五節(jié) 免疫組織化學(xué)在病理診斷中的免疫組織化學(xué)在病理診斷中的應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍1.1.腫瘤診斷腫瘤診斷 未分化惡性腫瘤性質(zhì)判定；圓形、未分化惡性腫瘤性質(zhì)判

46、定；圓形、梭形、多形性腫瘤細(xì)梭形、多形性腫瘤細(xì)胞鑒別；轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位的確定。胞鑒別；轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位的確定。2.2.淋巴瘤的診斷淋巴瘤的診斷 鑒定反應(yīng)性增生疾病與淋巴瘤；各鑒定反應(yīng)性增生疾病與淋巴瘤；各種淋巴瘤的分型。種淋巴瘤的分型。3.3.內(nèi)分泌腫瘤的診斷檢測腫瘤分泌的內(nèi)分泌腫瘤的診斷檢測腫瘤分泌的激素激素) )4.4.軟組織腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤軟組織腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤5.小活檢組織病理檢查能明確顯示瘤細(xì)胞存在與否小活檢組織病理檢查能明確顯示瘤細(xì)胞存在與否)6.微小癌、微小轉(zhuǎn)移灶淋巴結(jié)和骨髓微小癌、微小轉(zhuǎn)移灶淋巴結(jié)和骨髓)7.細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)診斷細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)診斷)8.部分腫瘤來源分類部分

47、腫瘤來源分類9.乳腺癌激素受體檢測乳腺癌激素受體檢測ER，PR)10.腫瘤基因產(chǎn)物腫瘤基因產(chǎn)物p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖細(xì)胞核抗原增殖細(xì)胞核抗原Ki-67，PCNA)判定腫瘤的預(yù)后判定腫瘤的預(yù)后12.病因診斷病因診斷HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等等)第六節(jié)第六節(jié) 免疫組織化學(xué)在病理診斷中存免疫組織化學(xué)在病理診斷中存在的不足在的不足1.1.與分子生物學(xué)等技術(shù)相比，范圍有限與分子生物學(xué)等技術(shù)相比，范圍有限2.2.并非所有腫瘤均可以做免疫組化，因并非所有腫瘤均可以做免疫組化，因常無相應(yīng)的抗體常無相應(yīng)的抗體3.3.相當(dāng)多的腫瘤缺乏特異性抗原的表達(dá)，相當(dāng)多的腫瘤缺乏特異

48、性抗原的表達(dá)，同一種抗體，常同一種抗體，常 ?？杀磉_(dá)多種腫瘤?？杀磉_(dá)多種腫瘤4.4.免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化問題免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化問題第四部分第四部分 免疫電子顯微鏡技術(shù)免疫電子顯微鏡技術(shù)一、免疫電鏡技術(shù)一、免疫電鏡技術(shù)(immunoelection microscopy) 是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平定位、定性原理，在超微結(jié)構(gòu)水平定位、定性及半定量顯示抗原的技術(shù)方法。從及半定量顯示抗原的技術(shù)方法。從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原抗體的免疫反應(yīng)，必須使抗體帶上抗體的免疫反應(yīng)，必須使抗體帶上具有高電子密度的標(biāo)記物，這樣才具有

49、高電子密度的標(biāo)記物，這樣才能在電鏡下觀察反應(yīng)分結(jié)果。能在電鏡下觀察反應(yīng)分結(jié)果。 到目前為止，已有三種標(biāo)記技術(shù)：到目前為止，已有三種標(biāo)記技術(shù)： (1)鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)鐵蛋白標(biāo)記技術(shù) (2)酶標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)記技術(shù) (3)膠體金標(biāo)記技術(shù)膠體金標(biāo)記技術(shù)二、免疫金標(biāo)記技術(shù)二、免疫金標(biāo)記技術(shù)immunogold staining immunogold staining technique)technique) 用膠體狀態(tài)的金顆粒，作為抗體的標(biāo)記物，制用膠體狀態(tài)的金顆粒，作為抗體的標(biāo)記物，制成免疫膠體金來研究抗原抗體的反應(yīng)。在光鏡下，成免疫膠體金來研究抗原抗體的反應(yīng)。在光鏡下，膠體金呈鮮紅色。電鏡下，金顆粒電子

50、密度大，有膠體金呈鮮紅色。電鏡下，金顆粒電子密度大，有利于超微結(jié)構(gòu)的觀察。利于超微結(jié)構(gòu)的觀察。 根據(jù)抗體特異性結(jié)合的原理，在亞細(xì)胞水平定根據(jù)抗體特異性結(jié)合的原理，在亞細(xì)胞水平定性定位。對抗體加以標(biāo)記，形成高電子密度區(qū)，在性定位。對抗體加以標(biāo)記，形成高電子密度區(qū)，在電鏡下觀察反應(yīng)過程。在對細(xì)胞內(nèi)抗原定性研究中，電鏡下觀察反應(yīng)過程。在對細(xì)胞內(nèi)抗原定性研究中，還可用不同的金顆粒標(biāo)記同一細(xì)胞內(nèi)不同的抗原。還可用不同的金顆粒標(biāo)記同一細(xì)胞內(nèi)不同的抗原。進(jìn)行多重標(biāo)記。進(jìn)行多重標(biāo)記。 三、免疫電鏡的基本技術(shù)方法三、免疫電鏡的基本技術(shù)方法1.1.標(biāo)本的處理標(biāo)本的處理(1)(1)取材取材: :各種培養(yǎng)細(xì)胞和分離的

51、血細(xì)胞應(yīng)隨用隨?。桓鞣N培養(yǎng)細(xì)胞和分離的血細(xì)胞應(yīng)隨用隨??；游離的培游離的培 養(yǎng)細(xì)胞可先進(jìn)行離心；貼壁細(xì)胞可在載玻片養(yǎng)細(xì)胞可先進(jìn)行離心；貼壁細(xì)胞可在載玻片上固定，上固定， 也可用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來；取組織塊也可用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來；取組織塊時應(yīng)做到時應(yīng)做到 越快越好，最好在沒有停止血流前取材。越快越好，最好在沒有停止血流前取材。 （2 2固定固定 固定液的選擇：固定液的選擇： 既要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，又要盡可能的保存抗原的活性。既要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，又要盡可能的保存抗原的活性。A.A.多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液PGPG固定液）固定液）B.B.過碘酸鹽賴氨

52、酸多聚甲醛混合固定液（過碘酸鹽賴氨酸多聚甲醛混合固定液（ PLP PLP固定液）固定液）C.C.苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液PAPGPAPG固定液固定液) ) 固定方法與時間：固定方法與時間：A.A.血管灌注固定最好方法）血管灌注固定最好方法）B.B.浸泡固定浸泡固定C.C.微波固定微波固定2.2.基本技術(shù)方法基本技術(shù)方法（1 1包埋前免疫電鏡技術(shù)包埋前免疫電鏡技術(shù) 是指先對標(biāo)本進(jìn)行免疫標(biāo)記，然后進(jìn)行包埋、切片、是指先對標(biāo)本進(jìn)行免疫標(biāo)記，然后進(jìn)行包埋、切片、觀察。觀察。（2 2包埋后免疫電鏡技術(shù)包埋后免疫電鏡技術(shù) 是指組織標(biāo)本經(jīng)固定及樹脂包埋，制作成超薄切片后再是指組織

53、標(biāo)本經(jīng)固定及樹脂包埋，制作成超薄切片后再進(jìn)行免疫化學(xué)染色方法。進(jìn)行免疫化學(xué)染色方法。詳見包埋前和包埋后電鏡技術(shù)的比較詳見包埋前和包埋后電鏡技術(shù)的比較包埋前與包埋后的比較包埋前與包埋后的比較包埋前包埋前包埋后包埋后優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點修正修正未經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包埋未經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包埋及高溫聚合的過程，標(biāo)記的陽性及高溫聚合的過程，標(biāo)記的陽性率高，提高電鏡的檢出率。率高，提高電鏡的檢出率。免疫染色完畢后用戊二醛與鋨酸免疫染色完畢后用戊二醛與鋨酸作后固定，可使抗原抗體結(jié)合的作后固定，可使抗原抗體結(jié)合的更加牢固，并有利于膜結(jié)構(gòu)的保更加牢固，并有利于膜結(jié)構(gòu)的保存。存。標(biāo)記前細(xì)胞內(nèi)抗原受到標(biāo)記抗體

54、標(biāo)記前細(xì)胞內(nèi)抗原受到標(biāo)記抗體的穿透性限制（因是組織塊）的穿透性限制（因是組織塊）制作厚切片；增加細(xì)胞膜的通透制作厚切片；增加細(xì)胞膜的通透性性具有陽性結(jié)果重復(fù)性高、方法簡具有陽性結(jié)果重復(fù)性高、方法簡便可靠的優(yōu)點，可對同一組織塊便可靠的優(yōu)點，可對同一組織塊的連續(xù)切片作各種對照染色，能的連續(xù)切片作各種對照染色，能十分準(zhǔn)確的解釋染色結(jié)果，而且十分準(zhǔn)確的解釋染色結(jié)果，而且還能在同一張切片上進(jìn)行多重免還能在同一張切片上進(jìn)行多重免疫染色。疫染色?？乖诿撍?、浸透及樹脂包埋過抗原在脫水、浸透及樹脂包埋過程中可能被破壞，使免疫染色的程中可能被破壞，使免疫染色的陽性率下降。陽性率下降。細(xì)胞膜保存差（鋨酸作用）細(xì)胞

55、膜保存差（鋨酸作用）固定液選擇苦味酸固定液選擇苦味酸(保護(hù)細(xì)胞膜保護(hù)細(xì)胞膜)包埋劑協(xié)作低溫樹脂包埋劑協(xié)作低溫樹脂肝細(xì)胞內(nèi)肝細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，和核膜，可見可見G-6-PG-6-P酶陽性反酶陽性反應(yīng)產(chǎn)物。應(yīng)產(chǎn)物。( (32000)32000)肝細(xì)胞。箭頭指線粒體，線粒體嵴、內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)呈現(xiàn)琥珀酸肝細(xì)胞。箭頭指線粒體，線粒體嵴、內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)呈現(xiàn)琥珀酸脫氫酶陽性反應(yīng)顆粒（脫氫酶陽性反應(yīng)顆粒（3600036000） 。IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法的表達(dá)，免疫金銀法IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法的表達(dá)，免疫金銀法K4MK4M低溫包埋

56、劑和紫外線低溫包埋機(jī)聯(lián)合的低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機(jī)聯(lián)合的免疫電鏡法免疫電鏡法 （實驗結(jié)果介紹）（實驗結(jié)果介紹） 免疫電鏡技術(shù)是從超微結(jié)構(gòu)水平能顯示抗原和抗體結(jié)合免疫電鏡技術(shù)是從超微結(jié)構(gòu)水平能顯示抗原和抗體結(jié)合后在細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)水平的定位，這一技術(shù)已成為目前生物醫(yī)后在細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)水平的定位，這一技術(shù)已成為目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項重要研究手段。但是，由于免疫電鏡技術(shù)因多學(xué)領(lǐng)域的一項重要研究手段。但是，由于免疫電鏡技術(shù)因多種原因造成的重復(fù)性差或技術(shù)的不穩(wěn)定性，加之目前電鏡包種原因造成的重復(fù)性差或技術(shù)的不穩(wěn)定性，加之目前電鏡包埋所采用的是環(huán)氧樹脂埋所采用的是環(huán)氧樹脂618618或或812812，都需高

57、溫聚合，這樣可使，都需高溫聚合，這樣可使多種抗原活性減低或喪失。本研究組選用了多種抗原活性減低或喪失。本研究組選用了Lowicryls K4MLowicryls K4M低低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機(jī)溫包埋劑和紫外線低溫包埋機(jī)SPI#17020SPI#17020），對免疫電鏡觀），對免疫電鏡觀察的標(biāo)本進(jìn)行了處理，目的是更好的保存被檢測組織中抗原察的標(biāo)本進(jìn)行了處理，目的是更好的保存被檢測組織中抗原的活性，提高檢出率?，F(xiàn)將一些不成熟的經(jīng)驗和存在的問題的活性，提高檢出率?，F(xiàn)將一些不成熟的經(jīng)驗和存在的問題進(jìn)行一下總結(jié)。進(jìn)行一下總結(jié)。 一、紫外線低溫包埋機(jī)一、紫外線低溫包埋機(jī)SPI#17020） SPI#

58、17020 SPI#17020是美國特殊研制的低溫包埋機(jī)，它最主要的特是美國特殊研制的低溫包埋機(jī)，它最主要的特點是采用數(shù)字化溫度控制，點是采用數(shù)字化溫度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，溫度可以控制在液氮制冷，溫度可以控制在-10-10-37-37之間。通過溫度控之間。通過溫度控制風(fēng)扇可以使機(jī)內(nèi)的溫度控制在某一恒定溫度，持續(xù)長達(dá)制風(fēng)扇可以使機(jī)內(nèi)的溫度控制在某一恒定溫度，持續(xù)長達(dá)3636小時，完全可以滿足低溫脫水、浸透和包埋所需的時間。它小時，完全可以滿足低溫脫水、浸透和包埋所需的時間。它占地面范圍小，但機(jī)內(nèi)空間較大，可以同時放入占地面范圍小，但機(jī)內(nèi)空間較

59、大，可以同時放入7272個包埋膠個包埋膠囊。而且機(jī)箱上方有兩個封閉起來的波長為囊。而且機(jī)箱上方有兩個封閉起來的波長為360nm360nm的紫外燈，的紫外燈，低溫和室溫下的紫外線聚合都可以在包埋機(jī)中進(jìn)行。低溫和室溫下的紫外線聚合都可以在包埋機(jī)中進(jìn)行。 總之，紫外線低溫包埋機(jī)是很理想的低溫脫水、浸透、總之，紫外線低溫包埋機(jī)是很理想的低溫脫水、浸透、聚合的機(jī)器。聚合的機(jī)器。 二、Lowicryls K4M 低溫包埋劑 Lowicryls K4M是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學(xué)物質(zhì)，其特點是能在低溫下保持低粘度，能很快滲入組織以及具有在波長360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無關(guān)，而且

60、Lowicryls K4M具有親水性，因此它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色。三、方法三、方法1.1.包埋劑的配制包埋劑的配制 商品提供的商品提供的Lowicrys K4MLowicrys K4M包埋劑由三個部分包埋劑由三個部分組成：單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。調(diào)整單體和交聯(lián)組成：單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。調(diào)整單體和交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。劑的比例，增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下：中等硬度的組織塊，其配制比例如下： （1 1Lowicryls K4MLowicryls K4M：單體：單體 17.30g 17.30g；交聯(lián)劑；交聯(lián)劑2.