elisa酶聯(lián)免疫吸附實驗報告

1、elisa酶聯(lián)免疫吸附實驗報告 e is 酶聯(lián)免疫吸附實驗報告 得目驗實.一酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelined immunsorbet assay 簡稱 eisa)就是在免疫酶技術(shù)(imunoenzymati echnius)得基礎(chǔ)上發(fā)展起來得一種新型得免疫測定技術(shù)，la過程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原)， 再加相應(yīng)酶標記抗體(抗原）,生成抗原（抗體)-待測抗體(抗原）-酶標記抗體得復(fù)合物,再與該酶得底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計得光吸收計算抗體（抗原）得量。待測抗體(抗原)得定量與有色產(chǎn)生成正比。 理原驗實.二用于免疫酶技術(shù)得酶有很多，如過氧化物酶,

2、堿性磷酸酯酶,d半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶,6磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于ia 法得酶有辣根過氧化物酶,堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化得就是氧化還原反應(yīng),在呈色后須立刻測定,否則空氣中得氧化作用使顏色加深,無法準確地定量. 辣根過氧化物酶（hp）就是一種糖蛋白,每個分子含有一個氯化血紅素（protoei）區(qū)作輔基。酶得濃度與純度常以輔基得含量表示。氯化血紅素輔基得最大吸收峰就是 40m，hrp 酶蛋白得最大吸收峰就是 27nm，所以酶得濃度與純度計算式就是（已知 hp 得 a（cm 43nm 1%)5，式中 1% 指rp 百分濃度為 100m含酶蛋白

3、 1g，即 10mg/,所以,酶濃度以 mg/m 計算就是rp 得 a(cm 403m ml=2、5)rp 純度（)=a403nma275nm 純度 rz（reihet ahl）值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度 hr得 r值在、0 左右,最高可達 3、4.用于lisa 檢測得 hrp 得 rz 值要求在、以上.):條三有理原本基得 asil1（就能可，面表體載相固于附吸地性理物以能體抗或原抗是蛋白與聚苯乙烯表面間得疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學(xué)活性; (2)抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)與酶學(xué)活性;)3(酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)加

4、入底物得顏色反應(yīng)來判定就是否有免疫反應(yīng)得存在,而且顏色反應(yīng)得深淺就是與標本中相應(yīng)抗原或抗體得量成正比例得,因此,可以按底物顯色得程度顯示試驗結(jié)果。 elsa 法就是免疫診斷中得一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起得傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面得免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原與小分子抗原得定量測定,根據(jù)已經(jīng)使用得結(jié)果，認為 elisa 法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點.不僅適用于臨床標本得檢查,而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體,而且也可用于測定體液中得循環(huán)抗原，所以也就是一種早期診斷得良好

5、方法。因此 es法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得應(yīng)用范圍日益擴大,可概括四個方面： 1、免疫酶染色各種細胞內(nèi)成份得定位。 2、研究抗酶抗體得合成。 3、顯現(xiàn)微量得免疫沉淀反應(yīng)。 4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。 基本方法一 用于檢測未知抗原得雙抗體夾心法: 、1 液沖緩被包鹽酸碳牰、9hp 0、0 用：被包將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為10g/l。在每個聚苯乙烯板得反應(yīng)孔中加 0、1l，4過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗次，每次 3 分鐘。（簡稱洗滌,下同)。 2、 加樣:加一定稀釋得待檢樣品、1ml 于上述已包被之反應(yīng)孔中,置孵育小時.然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔） 、 體抗標酶

6、得釋稀鮮新入加,中孔應(yīng)反各于:體抗標酶加（經(jīng)滴定后得稀釋度）0、1ml。37孵育 0、51 小時，洗滌。 、 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制得 tmb 底物溶液 0、1m,3700 分鐘。 、5 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入 2硫酸 0、5ml。 6、 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色得深淺,以"'、"'號表示。也可測 od 值:在 elisa 檢測儀上,于0nm（若以 abts 顯色，則 410n)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔 od 值，若大于規(guī)定得陰性對照 od 值得、

7、1 倍，即為陽性。 基本方法二 用于檢測未知抗體得間接法:、0 加孔每 ，m1 至釋稀原抗知已將液沖緩被包用m，4過夜。次日洗滌次. 做時同(。滌洗，時小 1 育孵3 置,中孔應(yīng)反之被包已述上于 lm1、0)體抗知未(品樣檢待得釋稀定一加 空白、陰性及陽性孔對照） 于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋得酶標第二抗體（抗抗體)、1m,37孵育 3060 分鐘,洗滌,最后一遍用 ddw洗滌。 其余步驟同"雙抗體夾心法'得 4、。( 物底與酶 ）二酶結(jié)合物就是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)得產(chǎn)物。就是 eli成敗得關(guān)鍵試劑,它不僅具有抗體抗原特異得免疫反應(yīng),還具有酶促反應(yīng),顯示出生

8、物放大作用,但不同得酶選用不同得底物技疫免術(shù)常用得酶及其底物 酶 底物 顯色反應(yīng) 測定波長 *94 色紅橘 胺二苯鄰 酶物化氧過根辣四甲替聯(lián)苯胺 黃色 0* 4 色棕 酸楊水基氨鄰聯(lián)苯甲胺 蘭色 425 2，2連胺基(-乙基-并噻唑啉磺酸6）銨鹽 藍綠色 64（鹽酸磷酚基硝4 酶酯酸磷性堿n) 黃色 400 萘酚amx 磷酸鹽+重氮鹽 紅色 5+糖萄葡024,504 色黃 糖萄葡+rh+stb 酶化氧糖萄葡甲硫酚嗪+噻唑蘭 深藍色 0，06 光熒 )m4（苷糖乳半基酮傘基甲 酶苷糖乳半- 硝基酚半乳糖苷(ong) 黃色 420 終止劑為 2ml/l h2 * 。劑止終得同不有物底得同不 ,酸檬

9、檸 l/lo 2 為劑止終可催化下列反應(yīng)： r+2o2復(fù)合物 復(fù)合物+h過氧化物酶+h2+ ah2 -為無色底物, 供氫體; a 為有色產(chǎn)物。( 法方種四得用常sile )三1直接法測定抗原 ；面表體載在附吸原抗將加酶標抗體,形成抗原抗體復(fù)合物; 。量原抗量解降得物底.物底加 2。間接法測定抗體 ；面表體載相固于附吸原抗將加抗體， 形成抗原-抗體復(fù)合物； 加酶標抗體; 。量體抗=量解降得物底定測 .物底加3。雙抗體夾心法測定抗原合復(fù)體抗-原抗成形,原抗加;面表相固于附吸體抗得得獲物動種一第疫免原抗將物; ;物合復(fù)體抗原抗體抗成形,體抗得得獲物動種二第疫免原抗加加酶標抗抗體(第二種動物抗體得抗體

10、）; 。量原抗=量解降得物底。物底加 、4 ;面表體載相固在附吸體抗將原抗定測法爭競)1(）;原抗標酶入加（,)2(抗測待與原抗標酶入加 原; 。量原抗知未=差得量解降物底孔品樣與孔照對。物底加三。儀器與材料 1、 聚苯乙烯微量細胞培養(yǎng)板（平板， 40, 9孔). 、2 儀測檢疫免聯(lián)酶、3兔抗羊酶物化氧過根辣i， 工作稀釋度 1:00。 4、 包被液:0、05moll ph、6 碳酸緩沖液，4，保存, aco3 0、5 克， ho3 0、93克,蒸餾水稀釋至 100 ml。 5、 稀釋液:、0lph7、4 ps-tween-20， 4，保存、 nac 8g， 2po4 0、2， a2hpo4、

11、1h2o 2、g， twen0,0、m、 蒸餾水加至 1000。 、6同:液滌洗稀釋液 7、 封閉液:、%雞卵清蛋白,ph7、4 pbs。 8、 鄰苯二胺溶液（底物):臨用前配制 、1 檸檬酸（2、1100ml), 、1ml 0、m na2h、h2o (7、163g00ml) 6、4m, 蒸餾水 12、ml, 鄰苯二胺0mg, 溶解后, 臨用前加 30%ho 0 微升。 9、 終止液:2ol/h2so4。 驟步作操 、四1、 包被抗原:用包被液將抗原作適當稀釋， 一般為 11微克/孔，每孔加00 微升，3溫育 1 小時 后，4冰箱放置18 小時。 、2將后最,次三復(fù)反,鐘分三放靜，液滌洗滿加，體液中孔板盡倒:滌洗反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。 、3 .時小一置放73，升微 002 液閉封加、 洗滌同 2. 、573