分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用課程總結(jié)

1、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用教案（7）課程名稱分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用總學(xué)時(shí)數(shù) 48專業(yè)中醫(yī)基礎(chǔ)和中醫(yī)臨床專業(yè)內(nèi) 容課程總結(jié)，介紹 DDPCR、RACEPCR、測(cè)序、基時(shí) 4因芯片等數(shù)本 次 課 目 的 要 求了解 DDPCR、 RACEPCR '棉口應(yīng)用。了解DNA樣本測(cè)序處理、聚冰烯酰胺凝膠灌膠、上樣、電泳、電泳后凝膠 處理、放射自顯影和讀片技術(shù)。了解基因芯片、cDNA Array原理技術(shù)和應(yīng)用。概要介紹最新分子生物學(xué)技術(shù)及其在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用和課程總結(jié)。把業(yè)已操作的實(shí)驗(yàn)及其意義用起來重復(fù)介紹，明確其目的意義。本 次 課 的 重 點(diǎn) 難 占 八、DDPCR、RAC

2、EPCR等關(guān)鍵技術(shù)與常見問題。DNA樣本測(cè)序處理、聚冰烯酰胺凝膠灌膠、上樣、電泳、電泳后凝膠處理、放射自顯影和讀片關(guān)鍵技術(shù)與常見問題。了解基因芯片、cDNA Array原理、關(guān)鍵技術(shù)與常見問題。本 次 課 的 應(yīng) 用 教 具多媒體教學(xué)課件。課程總結(jié)和部分新技術(shù)介紹（4學(xué)時(shí)）一、中醫(yī)藥對(duì)基因組作用的研究實(shí)驗(yàn)1基因組DNA提取（方法類似于 RNA的提取）實(shí)驗(yàn) 2 Southern blot （方法類似于 Northern blot）實(shí)驗(yàn)3 PCRPCR是Polymerase chain reaction的縮寫，中文譯作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其特點(diǎn)是可以在 幾小時(shí)內(nèi)方便、快捷地將微量DNA （含由微量RN

3、A反轉(zhuǎn)錄成的cDNA）擴(kuò)增達(dá)106倍，得到ug級(jí)的DNA !該技術(shù)發(fā)明于八十年代中期，到了八十年代末，由于引用了耐熱DNA聚合酶，使這一技術(shù)得以蓬勃發(fā)展， 成為分子生物學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，發(fā)揮著日益重要的作用。由于其方便快捷，在中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測(cè)中應(yīng)用十分廣泛。例如觀察慢性炎癥 的活檢組織中一些與腫瘤發(fā)生的基因是否存在突變，中醫(yī)藥治療后防突變的作用如何；一些與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)歸、轉(zhuǎn)移、凋亡等基因的表達(dá)如何，中醫(yī)藥的調(diào)控如何；探針的擴(kuò)增等等。原理采用兩段引物，分別與 DNA兩條鏈上各一段序列互補(bǔ)，位于模板DNA中擬擴(kuò)增片段兩條鏈的3'端。加熱使模板DNA變性解鏈，當(dāng)反應(yīng)的溫度下

4、降時(shí)，兩引物分別與模板DNA 兩條鏈發(fā)生退火，然后兩引物在DNA聚合酶的作用下延伸。在摩爾數(shù)大大過量的兩段引物和4種dNTP的反應(yīng)體中，位于兩段引物間的DNA在反復(fù)的變性、退火、延伸的循環(huán)里，每一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物再一次充當(dāng)下一輪擴(kuò)增的模板，使其產(chǎn)物增加一倍。經(jīng)過 30-40個(gè)循環(huán)， 目的DNA可由原來的1pg擴(kuò)增到1ugo1）引物退火與模版 DNA結(jié)合；2） PCR第一鏈的延伸；3）再次變性解鏈后，上下游 引物分別退火結(jié)合到原先和擴(kuò)增了的模版上；4） PCR第二輪的延伸；5）再次變性解鏈；6）再次引物與擴(kuò)增了的模版退火并延伸。注意事項(xiàng)PCR的常見問題主要有：1 .沒有PCR產(chǎn)物。其主要可能有 PC

5、R反應(yīng)的有關(guān)試劑缺乏，循環(huán)次數(shù)不夠，退火溫 度太高，引物設(shè)計(jì)不好，模版不夠，模版質(zhì)量差，變性溫度過高或過低，變性時(shí)間過長或過 短，鏈延伸時(shí)間過短，Taq酶數(shù)量不夠或質(zhì)量不行，Mg+過低，dNTP過少，模版C/G過于豐富，等等。2 . PCR產(chǎn)物不純，見多條條帶產(chǎn)物。其主要可能有循環(huán)次數(shù)太多，退火溫度過低， 引物設(shè)計(jì)不合理，污染等。其中，引物設(shè)計(jì)不合理的可能性最大。3 . PCR產(chǎn)物前后一片，拖帶。其主要可能有循環(huán)次數(shù)太多，退火溫度太低，鏈延伸 時(shí)間過長，模版質(zhì)量差，模版過多，污染， Taq酶數(shù)量過多，Mg+過多，等等。還有一些值得注意的問題：4 .關(guān)于引物。（1）引物的長度。引物的長度要求不一

6、，如模版是單一的載體和單一的插入片段， 可以選用較短的插入片段兩側(cè)的載體序列作為引物，一些常用載體有現(xiàn)成的引物商品，可以購買。對(duì)于復(fù)雜的基因庫，或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，為提高引物的特異性，建議采用較長的引物。具 體可以參見RACE PCR介紹。（2）引物的CG與AT的比例?？赡艿脑挘ㄗh 1:1左右。（3）引物的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)參見本書RTPCR介紹。5 .關(guān)于酶。一些實(shí)驗(yàn)反復(fù)失敗，竟然會(huì)與酶的質(zhì)量問題有關(guān)。因此，我們建議購買 那些經(jīng)常從事PCR實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室所經(jīng)常使用品牌及其供應(yīng)商的PCR酶。6 .退火溫度。通常按照檢索到的文獻(xiàn)或試劑盒提供的方法，可以確定退火溫度。但是，時(shí)常會(huì)碰到兩條引物的 Tm值不一致，或

7、PCR反復(fù)調(diào)整仍不見改善，此時(shí)可以考慮Touch Down PCR的方法，具體參見本書 RACE PCR介紹。7 . CG豐富的 DNA 模版往往不容易擴(kuò)增，又#匕，可以采用 DMSO ( DIMETHYL SULFOXIDE ),用量為 PCR反應(yīng)總?cè)莘e的1/10。比如將 4ul的DMSO加入36ul的PCR反 應(yīng)液，使總?cè)莘e達(dá) 40ul。8 . MgCl 2O通常PCR buffer中含有MgCl 2,但是由于一些不清楚的原因，有時(shí)仍嫌不 足，此時(shí)可以適當(dāng)增加 MgCl 2的濃度。9 . PCR是一種十分靈敏的實(shí)驗(yàn)，對(duì)操作技巧要求高，為防止加樣誤差，建議做復(fù)管。 同時(shí)，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)時(shí)，

8、相同的試劑建議先一道配置，并留有余量，比如Taq酶、10XPCRBuffer、dNTP、消毒過的雙蒸水等，混勻，這樣可以很大程度上避免上樣誤差。10 .關(guān)于電泳參見本書實(shí)驗(yàn) 29。11 .關(guān)于試管。為提高 PCR的質(zhì)量，以及大批量 PCR反應(yīng)的操作，目前業(yè)已開發(fā)出 不同的PCR試管。比如為減少管壁導(dǎo)熱的延滯，發(fā)展出超薄壁的PCR試管；為滿足批量實(shí)驗(yàn)，發(fā)展出排狀 PCR試管，等等。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中先后使用過一些不同的試管，從操作方便 和安全上看仍喜歡采用 0.5ml的試管。這樣的試管比較結(jié)實(shí)，不宜引起試管的破裂和同位素 的泄漏，且手持起來方便。實(shí)驗(yàn)4點(diǎn)突變PCR點(diǎn)突變PCR的使用機(jī)會(huì)越來越多了起來。

9、當(dāng)研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥對(duì)某些特定基因的具有調(diào)整作用以后，自然要求深入了解實(shí)現(xiàn)對(duì)該基因調(diào)整的具體途徑，比如中醫(yī)藥對(duì)某基因的調(diào)整是直接的，并通過這樣的調(diào)整發(fā)揮療效，抑或是間接的；如果這些基因的功能尚不清楚，那么，哪些部位是主要的功能區(qū)，改變了這些功能區(qū)會(huì)如何；在這些基因中中醫(yī)藥可能對(duì)啟動(dòng)子的哪些部位發(fā)生作用，等等，點(diǎn)突變PCR技術(shù)可以為回答這些疑問提供方便。本方法是利用PCR技術(shù)，改變目的基因的個(gè)別或若干堿基，使該堿基所處位置的基因功能發(fā)生變化，以觀察其意義。例如對(duì)于功能基因，可以檢測(cè)點(diǎn)突變后功能是否發(fā)生變化， 以逐步明確功能區(qū)的意義；或直接破壞一些已明確的功能區(qū)，使該基因失去原有功能； 或用于篩選啟動(dòng)

10、子中的重要序列、增強(qiáng)子的位置，了解一些已知轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白及其特定結(jié)合序列的關(guān)系，等等。點(diǎn)突變PCR技術(shù)的實(shí)現(xiàn)主要有兩種方法，一種是比較老的辦法，叫做兩步法點(diǎn)突變 PCR;另一種發(fā)展比較晚，并得益于Taq酶性能的提高，稱之為一步法點(diǎn)突變PCR。如STRATAGENE 公司 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所采用的一步法點(diǎn)突變 PCR。原理采用性能優(yōu)良的 DNA聚合酶PfuTurbo DNA polymerase ,設(shè)計(jì)出含有突變位點(diǎn)的一對(duì) 對(duì)應(yīng)的引物，將含有目的基因的載體加熱解鏈，退火時(shí)，突變引物會(huì)結(jié)合到載體插入片段的相應(yīng)序列上，并以此作為引物，延

11、伸。該方法可以直接完成數(shù)千bp長度的含有插入片段的整個(gè)載體的復(fù)制，使復(fù)制的 DNA含有突變位點(diǎn)。PCR后，PCR產(chǎn)物用Dpn I消化原先的模 版，這是因?yàn)榇蠖鄟碜杂诖竽c桿菌的DNA是甲基化的，對(duì) Dpn I敏感，而新延伸的 DNA鏈則不然。消化后，所消化的質(zhì)粒未突變鏈含有大量的切口，在轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，大腸桿菌會(huì)依據(jù)突變鏈將切口修補(bǔ)完善，并予以復(fù)制。從而完成基因的點(diǎn)突變。由于該技術(shù)僅使用一次PCR循環(huán)，所以被稱為一步法點(diǎn)突變 PCR。實(shí)驗(yàn)5 DNA雙脫氧鏈終止法測(cè)序目的1. 了解目的 DNA的序列，如獲得的 DDPCR片段。發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥改變了某一不明的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，而且反轉(zhuǎn)錄得到了該mRNA

12、的cDNA ,欲觀察該cDNA的序列；通過基因cDNA庫的篩選得到基因的全部序列，要求完成測(cè)序。2. 了解目的基因是否發(fā)生了突變、缺失。例如經(jīng)中醫(yī)藥治療或處理后是否可以阻止 或糾正病變組織基因組的突變。3. 一些實(shí)驗(yàn)如Footprint要求在足跡電泳的一側(cè)有 DNA的序列，以明確核蛋白所結(jié)合 啟動(dòng)子的區(qū)域。鑒定某一基因是否為目的基因。測(cè)序有一些不同的方法及其改良法，比如化學(xué)降解測(cè)序法，九十年代還發(fā)展起來多種 自動(dòng)測(cè)序儀，并不斷升級(jí)換代，給大量的測(cè)序工作提供了快捷、便利的條件。若測(cè)序工作量不大，或沒有自動(dòng)測(cè)序儀，可以采用本實(shí)驗(yàn)介紹的方法。原理1977年，Sanger等報(bào)道了用雙脫氧核甘三磷酸(d

13、dNTP)作為鏈終止劑的測(cè)序方法。 2'、3' ddNT和脫氧核糖的3'位置缺少羥基，當(dāng) DNA聚合酶通過其5'三磷酸基團(tuán)摻入到正 在增長的DNA鏈后，因其缺乏 3'羥基，后繼的dNTP不能與之形成磷酸二酯鍵，從而使 DNA鏈終止延伸。于是，在 DNA合成反應(yīng)混合物的 4種dNTP中加入少量的一種 ddNTP, 當(dāng)DNA合成過程中，隨機(jī)摻入到正在增長的DNA鏈上的ddNTP將終止鏈的進(jìn)一步延伸，這樣，以同一 DNA為模版所合成的的拷貝鏈，將是一系列不同長度的核甘酸鏈，其長度取 決于引物末端到過早出現(xiàn)鏈終止位置之間的距離。在四組獨(dú)立的反應(yīng)體系中，分別加入4

14、種不同的ddNTP和一種經(jīng)標(biāo)記的dNTP,結(jié)果將產(chǎn)生4組長度不均的寡核甘酸， 分別終止于 模板鏈的每一個(gè) A、C、G或T的位置上。然后采用能分辯長度僅差一個(gè)核甘酸的變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳，把四組反應(yīng)液加樣于凝膠中若干相鄰的泳道上，電泳并放射自顯影后， 從凝膠的放射自顯影片上可直接讀出DNA上的核甘酸序列。實(shí)驗(yàn)步驟1.雙鏈1)DNA12ul水6 ul2M NaOH/1 mM EDTA2 ul37 c 10 min水7ul3M NaAC6ul100%乙醇75ulDNA測(cè)序反應(yīng)插入干冰 5 min(3-5ug)3)離心10 min (4C),吸棄乙醇，移入 70%預(yù)冷乙醇110ul,離心10 mi

15、n (4C),吸 棄乙醇，真空離心干燥 5 min。4)H2O6 ul引物2 ulSequence Buffer2 ul65c 2 min ,在室溫下10-30 min內(nèi)逐漸降至室溫。4. 其間，標(biāo)記4管：GATC ,加入：Dideoxy Termination MixddGddAddTddC2.52.52.5 2.5 (ul)放于一側(cè)。于前管加入： 6) 0.1M DTT1ul稀釋的 Labeling Mix (1:4 H2O)2ul“干SdATP1ul稀釋的 Sequenase 2ul混勻(避免氣泡)，室溫下放置5 min。7)分別將此液加入G A T C管中：3.53.53.53.5 (

16、ul) 37 c 水浴 10 min Stop Solution4444(ul)75-80 C 水浴 3 min 放入4c冰箱，待次日電泳。 2.灌膠1)灌膠模具處理用肥皂水洗凈上下玻璃板，清水洗凈。長板灌膠面用海綿沾以100 %乙醇擦凈，吸取5ml Repel-silane移至玻璃板上，均勻涂于全板，再倒上一些乙醇，擦遍全板，反復(fù)拋光至干。短板灌膠面用海綿沾以100%乙醇擦凈，待干。0.4mm厚的梳子、墊片（Spacer）洗凈后一并用乙醇拭凈，待干。灌膠架左側(cè)一頭撐起，右側(cè)移件拉出。長玻璃板輕輕擱上，進(jìn)出水管靠近操作者。板 的兩側(cè)放上夾條，近移件端，將夾條長出一側(cè)朝內(nèi)，缺失一側(cè)向外。夾條用夾

17、子夾住邊緣暫 固定。短板灌膠面向下，凹頭輕輕擱在長板及夾條之上，平頭擱在移件遠(yuǎn)側(cè)。2）配制6%變性測(cè)序膠5HBE12 ml尿素28.8 g水 一 48 ml,加熱磁力攪拌至尿素溶解，然后加入：40% 膠9 ml10%過硫酸鏤0.42 ml水 一 60 ml,混勻，灌膠前再加入四甲基乙二胺（TEMED ）18 ul輕輕混勻后立刻灌膠。3）灌膠輕輕傾倒膠至短板前的凹側(cè)內(nèi)，見凝膠滲抵長板下緣后，左手按短板前側(cè)，右手托移 件之端，向前移動(dòng)，速度以長板下緣凝膠不被帶起，出現(xiàn)氣泡和因移動(dòng)過慢而泄漏；另一人 保持不斷傾倒凝膠， 以不溢出凹側(cè)為度。 待短板兩側(cè)突起抵長板及夾條上緣后，即刻放平灌膠架，兩側(cè)用夾子

18、夾緊，左側(cè)前緣插入梳子。前后兩側(cè)包以保鮮膜，以防凝膠干燥。通常放 過夜。以上介紹的是 DNA測(cè)序工作站的灌膠方式，不同測(cè)序模具有不同的方法，比如由注 射器底部灌膠法、加樣瓶上部灌膠法等。具體可以參考有關(guān)實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)儀器的說明書。 3.電泳1）預(yù)電泳揭去模具兩端的保鮮膜，將模具固定至電泳架上。接通模具上端與電泳架上端的恒溫 水浴接頭。上下緩沖液槽內(nèi)注入14BE電泳緩沖液，各約1000ml o輕輕拔去疏子，立即沖洗上樣孔。開啟恒溫水浴，溫度設(shè)置在55Co接通并開啟電源，1500V預(yù)電泳半小時(shí)。2）上樣電泳再次沖洗上樣孔。自冰箱內(nèi)取出樣品，按 G、A、T、C、G、A、T、C次序上樣，每 孔上樣2.5u

19、l,每一樣品分上樣兩孔。上樣時(shí)，吸頭插入上樣孔內(nèi)的上部，輕輕推入樣品， 樣品因比重較大，會(huì)自動(dòng)沉入孔底。上樣要輕而快，上樣畢迅速開啟電源電泳。電壓調(diào)至 2000V o電泳時(shí)間長短通常視擬測(cè)序列位置而定，如從起始部測(cè)起，當(dāng)澳酚藍(lán)抵達(dá)凝膠的下 三分之一時(shí)，即可停止電泳。4 .干膠、曝光1）干膠放掉電泳緩沖液，卸下凝膠模具，輕輕撬起短玻璃板，撬時(shí)，左手抵住玻璃板對(duì)側(cè)， 以防玻璃板滑動(dòng)，破壞凝膠。翻轉(zhuǎn)玻璃，平置桌上。用略大于膠面的濾紙覆于膠上，輕輕按 平，使膠粘于濾紙之上。捏住膠上濾紙一角，輕輕揭起凝膠，膠面向上，放于干燥器濾紙之 上。開啟凝膠干燥器，調(diào)至 80 C,揭開蓋膜，鋪一張相同大小的濾紙于干

20、燥面上（以防真 空干燥時(shí)，同位素透過粘于膠上的濾紙，污染干燥器；亦可防止干燥器上已污染的同位素反過來再污染待干燥的凝膠，影響結(jié)果分析）。膠面蓋以保鮮膜，開啟真空泵，鋪平保鮮膜，以免漏氣。蓋上蓋膜。真空干燥80-100分鐘。2）曝光于暗房內(nèi)，打開暗盒， 置X光膠片于增感屏上，將烘干的凝膠膠面朝X光片，蓋上暗盒。置暗盒于避光干燥處。曝光 3天。常規(guī)沖片，視顯影深淺延長或縮短曝光時(shí)間。5 .讀片讀片方法同前圖示。參照引物之后部分已知序列，讀出所測(cè)序列，并確認(rèn)上樣次序是 否有誤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果注意事項(xiàng)1 .通常由于電泳時(shí)間較長，以及還有后續(xù)的干膠等工作，通常測(cè)序反應(yīng)和灌膠于同 一天完成，次日一早上樣電泳、干

21、膠和放射自顯影。2 .如欲當(dāng)天完成測(cè)序和電泳，則應(yīng)先予灌膠，再進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，以便凝膠有充分的 時(shí)間聚合。一般實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣將剩余的凝膠液保留，以觀察聚合與否，若剩余凝膠液在容器中聚合，則可以推測(cè)注入于模具間的凝膠也已經(jīng)聚合。3 .灌膠架務(wù)必調(diào)至水平，以免凝膠側(cè)漏。通常凝膠泄漏的原因源自塑料隔片上前一 次實(shí)驗(yàn)殘存的凝膠沒有清洗干凈，使隔片與玻璃之間形成空隙。因此實(shí)驗(yàn)之后徹底的清洗十分必要。4 .配制測(cè)序膠時(shí)，溫度掌握很重要：溫度低，尿素不會(huì)溶解，既溶解的還會(huì)析出結(jié) 晶；加入40%膠后，溫度偏高則易引起凝膠過早聚合，影響灌膠。因此灌膠的室溫和凝膠 液的溫度很重要，建議嚴(yán)格按方法要求操作。一些沒有恒溫條

22、件的實(shí)驗(yàn)室，建議在氣溫較低的季節(jié)，采用空調(diào)或取暖裝置，使室溫控制在22c左右。不然，所有器皿溫度過低，會(huì)引起尿素析出結(jié)晶，導(dǎo)致灌膠失敗。5 .按G、A、T、C、G、A、T、C次序上樣的目的既使之位于 4個(gè)泳道兩側(cè) G、C條 帶緊鄰，便于讀片判斷 G、C的先后；又可以萬一在某一個(gè)泳道出現(xiàn)異常時(shí)，比如有小的氣 泡、凝膠破裂等，有另一泳道結(jié)果備用。、中醫(yī)藥對(duì)單基因轉(zhuǎn)錄（ mRNA）作用的研究實(shí)驗(yàn)6 組織總RNA提取（已經(jīng)實(shí)驗(yàn)操作）實(shí)驗(yàn)7 mRNA的分離實(shí)驗(yàn)8 Northern blot （已經(jīng)部分實(shí)驗(yàn)操作）實(shí)驗(yàn)9 RTPCR （已經(jīng)實(shí)驗(yàn)操作）實(shí)驗(yàn)10原位雜交 三、中醫(yī)藥對(duì)多基因轉(zhuǎn)錄（ mRNA）作用

23、的研究實(shí)驗(yàn) 11 cDNA Array 和 Micro ArraycDNA Array即cDNA列陣，或譯作矩陣，由排列在96孔板大小的少到幾十個(gè)，多至上萬個(gè)不同基因的 cDNA點(diǎn)組成。MicroArray被譯作 基因芯片”，或譯作 微矩陣”，這個(gè)矩陣由點(diǎn)在大如載玻片，小如 指甲大小面積的固定介質(zhì)表面的上百至數(shù)千個(gè)特定的基因組成。是cDNA Array的微型化。MicroArray的工作原理是將欲研究細(xì)胞組織的RNA通過不同的方式轉(zhuǎn)錄成cDNA ,轉(zhuǎn)錄過程中或之后給予熒光等標(biāo)記，制成探針，然后在嚴(yán)格的條件下使該探針與微矩陣上的基因雜交，雜交后，把未雜交的基因洗脫，在一定的條件下，觀察雜交結(jié)果，

24、以了解某特定 組織中基因轉(zhuǎn)錄的多寡和特征。如果兩個(gè)組織的RNA用不同發(fā)光色彩的熒光標(biāo)記，同時(shí)進(jìn)行雜交，由于兩個(gè)組織雜交后所激發(fā)的熒光色彩不同，微矩陣上與甲組織特有探針結(jié)合則產(chǎn)生甲探針的光色，與乙組織特有探針結(jié)合則產(chǎn)生乙探針的光色，兩種探針同時(shí)結(jié)合則產(chǎn)生相兼色。這樣在一塊基因芯片上就可以方便、迅速、大規(guī)模地觀察兩個(gè)不同組織基因轉(zhuǎn)錄的異同。在基因芯片問世的短短幾年來，一些改進(jìn)型的基因芯片技術(shù)陸續(xù)問世，并迅速形成產(chǎn) 品。比如GeneChip。其特點(diǎn)為，1）容量大，每個(gè)芯片上可以達(dá)39000個(gè)基因，因此，單位時(shí)間內(nèi)識(shí)別的基因多且快；2）在基因矩陣上每個(gè)點(diǎn)由上下兩排更小的矩陣組成，每排由16-20個(gè)與某

25、一 mRNA不同區(qū)域?qū)?yīng)的25個(gè)寡核甘酸組成。上下兩行中，上行為正?；蛐蛄?， 下行為中間有點(diǎn)突變的序列。這樣在相同嚴(yán)格的雜交和洗脫條件下，上行基因16-20個(gè)點(diǎn)應(yīng)該全部陽性反應(yīng)，而下行基因因含有點(diǎn)突變，退火結(jié)合后不夠穩(wěn)定，會(huì)被洗脫。因而這樣僅上行呈陽性的雜交才算有效。所以在避免假陽性方面具有別的芯片所無法比擬的優(yōu)勢(shì)。還如discoveryARRAY 。該芯片把 RFDD-PCR （限制性片段差異展示 PCR）技術(shù)與MicroArray技 術(shù)結(jié)合在一道。由于mRNA拷貝為PCR所放大，極大豐富地?cái)U(kuò)增了一些微量轉(zhuǎn)錄的mRNA,使之得以清晰地反映在 Array上。我國也開始了基因芯片的研制和開發(fā)。

26、上海的聯(lián)合基因公 司目前推出了不同的基因芯片， 并提供技術(shù)服務(wù)。這給國內(nèi)的研究提供了方便， 同時(shí)產(chǎn)品以 其價(jià)格便宜，具有很大的競爭優(yōu)勢(shì)。 一些中醫(yī)藥院校和醫(yī)院已開始運(yùn)用這些技術(shù)， 并得到初 步的研究結(jié)果。通過對(duì)現(xiàn)狀的回顧，可以看出，當(dāng)前的基因芯片技術(shù)還有著以下不足：1 .由于人類基因組測(cè)序尚未完成，許多基因還不明朗，因此，基因芯片由于所含基因數(shù)不全，以致大量的可能有變化的基因漏網(wǎng)，而明顯影響到研究結(jié)果。正由于如此， 在目 的類似的DDPCR實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)許多新的基因片段。2 .小鼠、大鼠的基因測(cè)序工作還沒有大面積鋪開，需要更晚些時(shí)候才能完成。3 .由于由于哺乳類動(dòng)物基因組數(shù)量大，測(cè)同一細(xì)胞組織

27、，就目前的基因芯片規(guī)模， 整個(gè)基因組需要許多塊芯片，研究工作量、研究成本會(huì)很高。4 .研究費(fèi)用高昂。5 .實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)龐大，且大量的基因功能還不明朗，因此給進(jìn)一步研究帶來困難。雖然如此，基因芯片技術(shù)已展現(xiàn)出絢麗的前景：1 .隨著人類、大鼠、小鼠，甚至兔、狗、猴等基因組測(cè)序完成，將有可能生產(chǎn)出全 套基因組芯片，使基因芯片完全實(shí)用。不似眼前，花錢不少，遺漏基因許多。2 .當(dāng)基因芯片生產(chǎn)技術(shù)趨于成熟，得以象目前轎車、家用電器生產(chǎn)的批量化、規(guī)模 化，將有可能降低生產(chǎn)成本，降低售價(jià)，便于普及。3 . 一旦類似高效的蛋白芯片技術(shù)的解決，與基因芯片的配套使用，將會(huì)對(duì)生命科學(xué) 研究取得質(zhì)的突破。4 .計(jì)算機(jī)技術(shù)的

28、發(fā)展，讀片分析自動(dòng)化程度增加，將使基因芯片技術(shù)更加實(shí)用。5 .不同基因功能研究的積累，以及基因功能研究技術(shù)的發(fā)展與普及，使基因芯片研 究的后續(xù)工作得以有效的開展，基因芯片的學(xué)術(shù)價(jià)值將得到革命性的發(fā)展。與基因芯片原理類似的有cDNA Array。CLONTECH Laboratories公司的 Atlas cDNAExpression Arrays是其代表。其 cDNA Array 的矩陣點(diǎn)由肉眼可見大小的cDNA點(diǎn)組成，點(diǎn)于96孔板大小的硝酸纖維素膜上。工作原理是，抽提組織的總RNA或進(jìn)一步分離 mRNA ,用反轉(zhuǎn)錄酶和同位素反轉(zhuǎn)錄mRNA成cDNA探針，與膜上的cDNA雜交，放射自顯影。不同

29、的組織分別用一張膜。其放射自顯影結(jié)果可以用肉眼識(shí)別。該公司還配套有分析軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果掃描后可以通過軟件比較不同組織基因轉(zhuǎn)錄的差異。因此該 Array的優(yōu)點(diǎn)為1）不要 求專用儀器設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室均可以操作。2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果肉眼可以識(shí)別，以便調(diào)整曝光時(shí)間，以獲取最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3）配套有分析軟件，可以借助普通掃描儀和計(jì)算機(jī)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但是我們使用下來有以下一些缺點(diǎn)：1） 一般組織絕大部分的 RNA豐度不夠，導(dǎo)致大多數(shù)雜交的重復(fù)性差。由此造成定量的困難和錯(cuò)誤，給后續(xù)研究帶來困難。2）制膜的技術(shù)性問題。比如小鼠 Array的雜交背景高，影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。3）軟件在消除背景方面的智能化技術(shù)尚不成熟，影響

30、到結(jié)果的分析。4） Array的基因數(shù)量少，約1200個(gè)。遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能與一般組織大量轉(zhuǎn)錄的mRNA匹配。與此技術(shù)類似的 Array ,有單病種 Array （如前面所介紹，也可以是MicroArray ），但是制作在硝酸纖維膜上的Array以其價(jià)廉方便似乎更有優(yōu)勢(shì)。其原理是，通過對(duì)某一疾病基因譜改變的了解，依據(jù)若干不同基因譜變化的特征，設(shè)計(jì)出針對(duì)單病種的 Array。這些Array上所含的基因有限，包含了某一病種不同基因譜的關(guān)鍵基因，因而成本低，適用于臨床的輔 助診斷。中科院上海細(xì)胞研究所德國馬普學(xué)會(huì)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室所開發(fā)的cDNA Array ,在96孔板大小的纖維素膜上點(diǎn)制成含16000個(gè)左右基因的

31、 Array。信息量大。由于基因點(diǎn)小而密，肉眼無法識(shí)別，要求專門設(shè)備閱讀和分析?？紤]到基因芯片要求有特殊的設(shè)備和專門的技術(shù)培訓(xùn)，在一些條件比較差的地區(qū)開展不易；而cDNA Array實(shí)驗(yàn)技術(shù)與 Souhtern blot、Northern blot類似，不需要專門添置設(shè)備， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的放射自顯影可以直接用肉眼判斷，適用于一般普通的實(shí)驗(yàn)室，為此我們介紹cDNA Array。本實(shí)驗(yàn)以美國 CLONTECH 的 Atlas cDNA Expression Arrays 為例。 原理CLONTECH 將目前許多研究領(lǐng)域熱門的上千個(gè)基因分類點(diǎn)于帶正電荷的尼龍膜上。這些基因大多已證明在不同的生物學(xué)進(jìn)程中起

32、到關(guān)鍵作用，比如癌基因、抑癌基因、細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)因子、離子通道、DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞表面抗體、細(xì)胞粘附受體、細(xì)胞信號(hào)和細(xì)胞外聯(lián)系等，從而實(shí)驗(yàn)將提供較大信息量的結(jié)果。同時(shí)，將質(zhì)粒和噬菌體DNA作為陰性對(duì)照點(diǎn)于矩陣之側(cè)，以驗(yàn)證雜交的特異性。伴隨有一些看家基因的cDNA作為陽性對(duì)照以觀察正常mRNA的豐度。以上各基因名稱及在 GenBank中的編號(hào)該公司有專門材料提供。實(shí)驗(yàn)首先將1ug的mRNA在含相應(yīng)同位素和試劑盒提供優(yōu)化了的引物的反應(yīng)液中反轉(zhuǎn)錄成cDNA探針。然后用此探針與 cDNA Array尼龍膜上的cDNA雜交，在嚴(yán)格的洗膜后放 射自顯影，然后進(jìn)行分析，比較不同基因或不同膜上同一基因表達(dá)的多

33、寡。該公司還有配套的計(jì)算機(jī)圖象分析軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在放射自顯影的X光片上見有不同深淺的雜交斑點(diǎn)，在斑點(diǎn)矩陣的周圍有一些看家基因的定位雜交點(diǎn)?？梢酝ㄟ^試劑盒提供的印有網(wǎng)格的塑料膜確定不同基因表達(dá)的變化，或借助于該公司設(shè)計(jì)的分析軟件對(duì)掃描入計(jì)算機(jī)的圖象進(jìn)行處理。 注意事項(xiàng)1 .通常cDNA Arrays是用來比較兩個(gè)標(biāo)本以上的mRNA表達(dá)的變化，因此具體操作時(shí)可以同時(shí)標(biāo)記兩個(gè)或兩個(gè)以上的探針，每一個(gè)探針的標(biāo)記方法同上。為了減少上樣誤差， 除mRNA外，其余試劑可以先統(tǒng)一配置，混勻，然后分別加入不同來源的mRNA中進(jìn)行探針的標(biāo)記。2 .我們?cè)鬟^比較，采用總 RNA不理想，mRNA濃度不夠，背景高。采

34、用 mRNA 的效果比較理想，因此我們推薦采用mRNA標(biāo)記探針。mRNA的分離方法請(qǐng)參見本書有關(guān)章節(jié)的論述。3 .常用的同位素有-32PdATP和優(yōu)33PdATP,我們使用下來，-32PdATP效果比較 好，曝光時(shí)間短，變化明顯，靈敏度高。對(duì)于那些強(qiáng)反應(yīng)的部位，可以方便地調(diào)整曝光時(shí)間，取得最佳效果。爐3PdATP則要求較長的曝光時(shí)間，對(duì)比反而不夠靈敏。4 .當(dāng)鞋精DNA濃度很高時(shí)，一旦冷卻，不易溶解，因此可以變性后，趁熱直接加入已加熱的ExpressHyb ,并混勻。5.探針的變性是必須的。常見的問題是標(biāo)記完探針，分離去未標(biāo)記的同位素后，忘記將探 針變性，引起實(shí)驗(yàn)失敗。四、中醫(yī)藥對(duì)廣泛基因差異

35、轉(zhuǎn)錄（ mRNA）作用的研究實(shí)驗(yàn) 12 DDPCR實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和瑫r(shí)觀察大量未知基因轉(zhuǎn)錄變化。中醫(yī)藥治療疾病通過改變和調(diào)整哪些基因的轉(zhuǎn)錄，不同產(chǎn)地的天然中藥其有效成分表 達(dá)的不同是由于那些基因表達(dá)差異所造成的，中醫(yī)證的變化主要有那些基因變化的基礎(chǔ)，等等。這類問題擺在中醫(yī)科學(xué)工作者面前，要求解決。但是，茫?；颍瑥亩?？以往的研 究主要觀察一至若干個(gè)已知與某病相關(guān)的基因與疾病或證的關(guān)系，但由于基因不是單獨(dú)存在的，其表達(dá)調(diào)控有賴于其他許多基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，反過來，其產(chǎn)物也會(huì)對(duì)其他基因產(chǎn)生調(diào)節(jié)和影響。那么復(fù)雜的生命現(xiàn)象通過觀察若干個(gè)基因往往是難以滿足研究的要求的。而DDPCR技術(shù)的產(chǎn)生，提供了便捷的工具

36、。 原理DDPCR技術(shù)利用了 PCR技術(shù)，實(shí)驗(yàn)首先提取欲觀察不同細(xì)胞或組織的總RNA,然后分別加入三個(gè)錨引物，H-T11-C、H-Tii-G和H-Tii-A ,使三個(gè)引物的11個(gè)T （胸背）選擇性地結(jié)合到mRNA的A （腺昔）尾上，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將所有的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 再以這一含 cDNA的反應(yīng)液為模板，分別加入以上三個(gè)錨引物，和若干隨機(jī)引物，如 aagcttgattgcc , aagcttcgactgt 等，PCR放大位于某一特定錨引物與隨機(jī)引物相 應(yīng)序列的所有cDNA ,反應(yīng)體中加入 at3PdATP或a 35SdATP。將兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞系或 組織的錨引物與隨機(jī)引物相

37、一致的PCR產(chǎn)物相鄰上樣于變性測(cè)序凝膠上，電泳，使不同大小的PCR片段得到分離，然后放射自顯影，曝光。如果兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞系或組織mRNA相同，在相鄰泳道對(duì)應(yīng)的膠片上可以見到并列的顯影條帶，如果轉(zhuǎn)錄的量不同，則兩條片段的深淺闊窄會(huì)有不同；如果某一基因僅僅在某一組織獨(dú)特的表達(dá)，則會(huì)在對(duì)應(yīng)于該組織的泳道上出現(xiàn)顯影條帶，而相鄰的組織泳道上則空白。以后，可以分離這些獨(dú)特表達(dá)的基因，做進(jìn)一步的Northern blot鑒定，基因克隆重組，鑒定，測(cè)序，并與 GenBank比較，以明確差異表達(dá)的基因?yàn)楹位?，或新的基因?實(shí)驗(yàn)步驟1.分子量標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)記分子量標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng) Hpa II切割的pBR 322暴露出

38、5'端伸出的GC序歹U:pBR3221ul5 XRT Buffer4ul0.1 M DTT0.5ula 32PdCTP5ul2mM dA/T/GTP0.5ulAMV RT1ul42 c X30min.2mM dNTP1ul42 c M0min.0.5M EDTA1ulTE108ul65 c M0min.4 C X5min.將上清加入 Sephedex G50柱，2000rpm離心3分鐘。收集離心產(chǎn)物約100ul （標(biāo)記過的不同分子量大小的pBR 322片段）。測(cè) cpm, 1ul 約在 3-4 M05。2. DDPCR（1）將RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA取0.5ml試管，標(biāo)記編號(hào)如下，然后

39、依次加入（單位 ul）:組織1 (Z1)組織2 (Z2)試管號(hào)123456水9.49.49.49.49.49.45XRT Buffer444444dNTP (250uM)1.61.61.61.61.61.6RNA (0.1ug/ul)222222H-T11-M (每管 2ul)(A)(C)(G)(A)(C) G)65 cx5min, 37 cx10min,加入：MMLV反轉(zhuǎn)錄酶11111137 c X50min, 75 c X5min。以上試管可存入 4 c冰箱，或插入冰中，口十DDPCR實(shí)驗(yàn)。（2） DDPCR 的 PCR部分1）準(zhǔn)備PCR混合物水6010 汨CR Buffer12dNTP

40、（25uM）9.6M33PdATP 1.5Taq 酶 12混勻。2）取0.5ml試管，標(biāo)記編號(hào)如下，然后依次加入隨機(jī)引物1 （H-AP-1 ）試管號(hào)1-11-21-31-41-51-6H-AP-1222222H-Tii-M (每管 2ul)(A)(A)(C)(C)(G)(G )以上反轉(zhuǎn)錄混合物（2ul) (Z1)(Z2)(Z1)(Z2)(Z1)(Z2 )以下PCR混合物141414141414混勻。（這里僅以1個(gè)隨機(jī)引物為例，通常實(shí)驗(yàn)要求8-32個(gè)隨機(jī)引物。）202020202020蓋上蓋，放入PCR儀，按以下程序運(yùn)行:94 c30 s.40 c2 min.72 c30 s.40個(gè)循環(huán)，再：

41、72 c5 min.(3)電泳、分析電泳的方法、過程同測(cè)序電泳。按試管編號(hào)次序上樣。每管樣品取3.5ul,加上樣染液2ul,蓋上蓋，80c水浴2min.,插入冰中，上樣。電泳、干膠、曝光等方法同測(cè)序。所不同 的是在揭膠后，要求利用上樣時(shí)所剩余的含有上樣緩沖液的樣品作為標(biāo)記墨水，分別點(diǎn)于凝膠的上下角上。由于該上樣物含有染料和同位素，放射自顯影后在X光片上會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)黑點(diǎn)，與凝膠上的藍(lán)色點(diǎn)對(duì)應(yīng)，以便以后估計(jì)不同差異片段方位之用。電泳的反射自顯影結(jié)果如以下圖示。(4)差異DNA片段的篩選與擴(kuò)增將干燥的凝膠上覆蓋 X光自顯影膠片，置于X光讀片箱上，依據(jù)實(shí)驗(yàn)揭膠時(shí)在凝膠角 上所點(diǎn)的放射自顯影墨水標(biāo)記，對(duì)準(zhǔn)

42、膠片與凝膠的位置， 使膠片上的條帶對(duì)應(yīng)凝膠上相應(yīng)的位置。然后用鉛筆或針依據(jù)膠片的位置標(biāo)記到凝膠上有興趣的片段位置。一般取DNA片段在300-500bp間的作進(jìn)一步分析。用刀片將響應(yīng)大小的凝膠連同所粘附的3MM濾紙一道切割下來。將被切割后的凝膠再重新用X光膠片曝光，檢測(cè)所切割的凝膠是否為有興趣的片段所在。如果切割正確，則第二次曝光后，該條帶會(huì)消失，或部分消失。同時(shí)可以依據(jù)第二 次曝光的結(jié)果，調(diào)整凝膠的切割，以確保所切割的凝膠系有興趣基因的所在。將此凝膠小片段，浸沒于盛于1.5ml微離心管的100ul水中，室溫下30分鐘，然后置于沸水中煮20分鐘，插入冰中。離心 2分鐘，吸取上清。以后取該上清2-

43、5ul作為模版，PCR放大，PCR反應(yīng)容積達(dá)40ul,電泳鑒定放大產(chǎn)物的分子量是否與DDPCR電泳反射自顯影的分子量一致，當(dāng)有足夠的 PCR產(chǎn)物(200ng-1000ng),且分子量一致，則從凝膠中回 收PCR產(chǎn)物。該產(chǎn)物有兩個(gè)用途，1)作為探針，做 Northern blot ,以鑒定是否確實(shí)在兩個(gè)樣品中基因轉(zhuǎn)錄存在差異；2) 一旦存在差異，將此剩余的PCR產(chǎn)物作為插入片段，克隆重組入適當(dāng)載體，篩選、鑒定，培養(yǎng)放大，質(zhì)粒小量制備，用于測(cè)序和其他用途。測(cè)序結(jié)果要求與 GenBank比較，以明確基因是否為已知基因。如果是已知基因，可以 進(jìn)一步檢索其已有報(bào)道，了解基因的功能，考慮進(jìn)一步的研究；如果

44、為新的基因， 則建議建立cDNA庫，并篩選獲得該基因的全長cDNA ,以便日后的基因功能研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果注意事項(xiàng)1 .實(shí)驗(yàn)之初，要求嚴(yán)格無菌操作，以防 RNA酶污染。2 .要求無DNA污染的純凈總 RNA ,因此，必要時(shí)可選用 GH公司Message-Clean kit 及按其說明處理 RNA樣品，以消除可能存在的痕量 DNA。也可以采用一些 mRNA分離試 劑盒或自備分離柱，分離 mRNA。3 .為防止加樣誤差，建議做復(fù)管。我們?cè)M(jìn)行過比較，DDPCR有著非常好的重復(fù)性， 表現(xiàn)在絕大部分基因擴(kuò)增的一致性和這些基因產(chǎn)物數(shù)量的一致性。僅在100bp分子量大小的區(qū)域可能會(huì)出現(xiàn)1-2個(gè)不一致的條帶。因

45、此當(dāng)條件限制時(shí)，可以考慮僅做單管。4 . DDPCR實(shí)驗(yàn)之時(shí)，所加試劑變化多，試管多，所以要求操作規(guī)范嚴(yán)格，以避免出 錯(cuò)。5 . DDPCR的工作量集中在以后的大量的Northern blot及后續(xù)工作，工作量巨大，研究者要有充分的準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)13 cDNA庫建立實(shí)驗(yàn)14 基因全序列cDNA庫篩選實(shí)驗(yàn) 15 RACE PCRRACE PCR 是當(dāng)前比較熱門的技術(shù)。 RACE 是 Rapid Amplification of cDNA Ends 的縮 寫，是迅速擴(kuò)增 cDNA末端的意思。其擴(kuò)增的方法是采用 PCR。因而縮寫作 RACE PCR。 本方法的特點(diǎn)是可以在實(shí)驗(yàn)條件和經(jīng)驗(yàn)相對(duì)比較差，而且在較短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)一些基因片段的全部表達(dá)序列完成測(cè)定。由于方法簡單，復(fù)加 PCR的特點(diǎn)，可以同時(shí)對(duì)若干基因進(jìn)