基因工程基本操作定稿

1、 受體菌包含了某種生物所有的基因，該受體菌群體稱為這種生物的基因組文庫。 受體菌包含了一種生物部分基因，該受體菌群體稱為這種生物的部分基因文庫，如cDNA文庫。指滿足人們需要，能編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許 多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫PCR技術(shù)聚合酶鏈式反應(yīng)PCR擴增儀擴增儀DNA雙鏈復(fù)制的基本原理雙鏈復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸

2、一對引物一對引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）DNADNA的兩條鏈為模板的兩條鏈為模板溫度控制溫度控制PCRPCR技術(shù)擴增過程技術(shù)擴增過程a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下， 斷裂，形成斷裂，形成_ _ b b、復(fù)性（復(fù)性（55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端延伸，合成與模板互補端

3、延伸，合成與模板互補 的的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈p 雙鏈雙鏈DNADNA是在高溫條件下解鏈為單鏈是在高溫條件下解鏈為單鏈DNADNA的，的，因此整個過程不需要解旋酶。因此整個過程不需要解旋酶。推測推測合成目的：使目的基因在受體細胞中目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存穩(wěn)定存在在，并且可以遺傳給下一代，同時使目，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠的基因能夠表達和發(fā)揮作用表達和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是3. PCR3. PCR技術(shù)擴增DNA,DNA,需要的條件是(

4、)( )目的基因引物四種脫氧核苷酸DNADNA聚合酶等mRNAmRNA核糖體 A A、B B、 C C、 D D、 2 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )( )利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取從受體細胞中提取 利用PCRPCR技術(shù) 利用DNADNA轉(zhuǎn)錄 人工合成A.A. B. B. C. C. D. D.4.細菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B有利于對目的基因是否導(dǎo)入進行檢測C增加質(zhì)粒分子的分子量D便于與外源基因連接 目的基因插入目的基因插入TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA上上 農(nóng)桿菌農(nóng)

5、桿菌 導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入植物細胞 整合到受體細胞的染色體上整合到受體細胞的染色體上 目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達 1. 1.農(nóng)桿菌特點：農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。易感染雙子葉植物和裸子植物。TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞的染色體上可轉(zhuǎn)移至受體細胞的染色體上2.轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化（2）基因槍法 （3）花粉管通道法導(dǎo)入受體細胞的方法導(dǎo)入受體細胞的方法 主要主要 是是借鑒細菌或病毒侵染細借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑胞的途徑，且因受體細胞的不同而不同。，且因受體細胞的不同而不同。顯微注射技術(shù)含目的基因的表達載體動 物 的受 精 卵

6、含目的基因的受精卵早 期胚 胎雌性動物輸卵管或子宮轉(zhuǎn)基因動 物顯微注射分裂分化移 植發(fā)育為什么將目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ玫氖荏w細胞是受精卵？2. 2. 優(yōu)點 繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少、操作簡單、價格低廉。3. 3. 常用受體細胞 大腸桿菌（E.coliE.coli）1. 1. 過程（1 1）制備感受態(tài)細胞：用CaCa2+2+（CaClCaCl2 2）處理細菌，使細菌細胞壁通透性增加，易于接受外源DNADNA分子。（2 2）重組DNADNA分子與感受態(tài)細胞混合孵育，完成轉(zhuǎn)化。CaCa2+ 2+ 處理法 目的基因是否真正插入受體細胞的目的基因是否真正插入受體細胞的DNADNA中，中，是

7、否能夠在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達，是否能夠在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達，只有通過檢測、鑒定才能得知。只有通過檢測、鑒定才能得知。 常用的檢測手段主要從常用的檢測手段主要從分子水平分子水平和和個體水平個體水平進行。進行。1. 1. 檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNADNA上是否插入了目的基因 提取受體生物全部DNA適當(dāng)限制酶切割DNA片段用同位素標記的目的基因片段雜交顯 出雜交帶（表明目的基因已插入）分子雜交技術(shù)2. 2. 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA 提取受體生物的mRNA用同位素標記的目的基因片段雜交顯 出雜交帶（表明目的基因已轉(zhuǎn)錄出了mRNA） 檢測DNA利用的是DNA與DNA

8、雜交，檢測mRNA利用的是DNA與mRNA雜交。3. 3. 檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì) 抗原抗體雜交技術(shù)提取受體生物的蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗體雜交顯 出雜交帶（表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品）例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。歸納歸納: 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.獲取目的基因u從基因文庫u利用PCRPCR擴增u化學(xué)方法人工合成2.2.構(gòu)建基因表達載體u目的基因、啟動子、終止子、標記基因3.3.將目的基因?qū)胧荏w細胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、Ca Ca 2+2+處理4.4.目

9、的基因的檢測與鑒定u檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯2.早期的基因工程的受體細胞主要是（ ）3.要檢測目的基因是否成功的插入了受體DNA中，需要用基因探針，基因探針是指A用于檢測疾病的醫(yī)療器械 B用放射性同位素或熒光分子等標記的DNA分子C合成一球蛋白的DNA D合成苯丙羥化酶的DNA片段質(zhì)粒 重組質(zhì)粒 同一種限制性內(nèi)切酶 人工合成 目的基因（或胰島素基因） 受體細胞（或大腸桿菌） 黏性末端 DNA連接提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許 多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫3.要檢測目的基因是否成功的插入了受體DNA中，需要用基因探針，基因探針是指A用于檢測疾病的醫(yī)療器械 B用