朊病毒及其檢測

1、朊病毒及其檢測朊病毒及其檢測小組成員：石勇軍 費(fèi) 鵬 閆 凱 王培培 嚴(yán) 姍 辛儒岱關(guān)亞飛 崔金紅 CONTENTS一、前言一、前言二、二、PrPC與與PrPSC三、三、PrPC的功能的功能四、朊病毒的致病機(jī)理四、朊病毒的致病機(jī)理五、朊病毒的檢測五、朊病毒的檢測六、六、問題問題與展望與展望一、前言一、前言1引言 傳染性海綿狀腦病(transmissible spongi-form encephalopathy, TSE)是一類致死性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。在哺乳動物中常見瘋牛病、羊瘙癢癥、貓海綿狀腦病以及傳染性水貂腦軟化病等；在人身上則發(fā)現(xiàn)了庫魯病、致死性家族失眠癥、克-雅氏病以及格斯特曼綜合癥

2、等?；疾〉娜撕蛣游?，大腦皮層的神經(jīng)元細(xì)胞會發(fā)生進(jìn)行性空泡化, 星形膠質(zhì)細(xì)胞不斷增生, 造成灰質(zhì)變薄而白質(zhì)相對明顯,最后變成海綿狀態(tài)。（左）病羊神經(jīng)組織的海綿狀損傷。（右）病人大腦組織切片，海綿狀病變及周圍的沉淀斑2朊病毒的發(fā)現(xiàn)英國的牧人就注意到羊的一種致死性疾病。 M. fadyian 提出該病是由寄生蟲引起的。Cuille 等發(fā)現(xiàn)瘙癢因子有傳染性，用濾膜過濾后仍具有傳染性，而提出該因子是一種病毒。Gajdusek 證實(shí)了CJD 的傳染性，并根Scrapie 、Kuru、CJD3種疾病的共同特征提出了傳染性海綿狀腦病(TSE) 這一概念。美國生物化學(xué)家Prusiner證明并提出羊瘙癢病的病原體

3、是一種不含核酸和脂類的疏水性糖蛋白，稱為蛋白質(zhì)侵染因子(proteinaceous infectious particle，簡稱prion)。3朊病毒引起的人類疾病4朊病毒引起的人類疾病 5疾病來源人類prion病約有15%的患者具有遺傳性，即為家族性疾病，為常染色體顯性遺傳，因編碼PrP的基因突變所致。遺傳性由食用瘋牛病病牛及其他染病動物所致。食源性傳播目前已報道全世界因醫(yī)源性傳染而引起的prion病已達(dá)160多例，而且，輸血及血制品是否也能傳播此病，已引起人們的關(guān)注。醫(yī)源性感染6致病特點(diǎn)2一旦發(fā)病，呈一旦發(fā)病，呈慢性、進(jìn)行性慢性、進(jìn)行性發(fā)展，以死亡發(fā)展，以死亡告終；告終；5患者以癡呆、患者

4、以癡呆、共濟(jì)失調(diào)、震共濟(jì)失調(diào)、震顫等為主要臨顫等為主要臨床表現(xiàn)。床表現(xiàn)。4無抗原性，無抗原性，不能誘導(dǎo)產(chǎn)不能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免生特異性免疫應(yīng)答；疫應(yīng)答；1潛伏期長，潛伏期長，可達(dá)數(shù)月至可達(dá)數(shù)月至數(shù)年甚至數(shù)數(shù)年甚至數(shù)十年；十年；3病理學(xué)特征是大腦皮質(zhì)神經(jīng)元空泡變性、死亡、缺失，而星形膠質(zhì)細(xì)胞高度增生，故大腦皮質(zhì)疏松呈海綿狀：有淀粉樣斑塊形成，HE染色淡紅腦組織中無炎癥反應(yīng)：無淋巴細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤；二、二、PrPC與與PrPSC 朊病毒蛋白(Prion Protein)，簡稱為PrP。PrPC是指一般情況下，正常宿主細(xì)胞基因編碼產(chǎn)生的朊蛋白，無致病性，是一種糖基磷脂酞肌醇(CPI)修飾膜在糖蛋自。

5、廣泛表達(dá)于脊椎動物，它與神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持、淋巴細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核酸代謝等有關(guān)。PrPC當(dāng)其發(fā)生構(gòu)象改變后可變成致病性朊病毒(PrPsc)，PrPsc可引起包括瘋牛病在內(nèi)的一系列致死性神經(jīng)性疾病。相對分子質(zhì)量為2730KD，故又稱作PrP2730。PrPSC1PrPC與PrPSCPrPc PrPSc螺旋折疊 二者是異構(gòu)體,由同一染色體基因PRNP編碼，其氨基酸序列完全一致,根本差別在于它們構(gòu)象上的差異，PrPC分子中含42%的螺旋，折疊僅為3 %，而PrPSC的折疊高達(dá)43 %，螺旋為30 %。故一般認(rèn)為，PrPSC是由于PrPC發(fā)生蛋白質(zhì)錯誤折疊，一些螺旋變構(gòu)為折疊，三維構(gòu)象發(fā)生變化而產(chǎn)生的，

6、同時帶來一系列理化性質(zhì)的變化。2PrPC與PrPSC的結(jié)構(gòu)3PrPC與PrPSC的理化性質(zhì)4PrPC向PrPSC的轉(zhuǎn)化（PrPSc的累積）的累積）（PrP轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化為PrPSc)(PrP與與PrPSc之間之間反應(yīng)反應(yīng))（PrPc內(nèi)生內(nèi)生）模型一 ：該模型是假定一個單一的PrPSC分子與一個單一的PrPC分子結(jié)合并催化其轉(zhuǎn)化成PrPSC。這兩個PrPSC分子,可以繼續(xù)轉(zhuǎn)換成PrPC。(伸長伸長)（構(gòu)象變（構(gòu)象變化化)(破碎成多個部分破碎成多個部分)（感染）（感染）模型二：假設(shè)PrPSC只是纖維，捆綁PrPC fibril，然后將其轉(zhuǎn)化成PrPSC，形成更長的纖維，這一現(xiàn)象可在染病毒致病中觀察到。

7、三、三、PrPC的功能的功能核酸代謝抗氧化參與神經(jīng)系統(tǒng)Cu2+代謝維持神經(jīng)系統(tǒng)功能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡PrPC的功能1維持神經(jīng)系統(tǒng)功能 在所有細(xì)胞類型中,以神經(jīng)元表達(dá)PrPC水平最高，且PrPC高度富集于突觸處(終板處也有富集)，這提示PrPC對神經(jīng)系統(tǒng)有特殊的重要性。PrPC除實(shí)驗(yàn)表明，PrPC缺失雖不引起肉眼可見的行為和發(fā)育障礙，但在整體動物水平來看可導(dǎo)致與晝夜節(jié)律有關(guān)的行為異常。在神經(jīng)系統(tǒng)水平，PrPC缺失可導(dǎo)致電生理參數(shù)方面的改變。 有證據(jù)表明，在出現(xiàn)進(jìn)行性運(yùn)動失調(diào)癥狀PrPC缺失小鼠中，發(fā)現(xiàn)腦部嚴(yán)重萎縮，蒲肯野細(xì)胞異常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野細(xì)胞過度興奮而導(dǎo)致小鼠死亡。 PrPC缺

8、陷鼠還表現(xiàn)出對外源性銅和過氧化氫等應(yīng)激誘導(dǎo)劑應(yīng)答方面的改變。 在細(xì)胞水平，PrPC缺陷鼠的神經(jīng)元在培養(yǎng)時存活能力下降，且對銅和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所導(dǎo)致的氧化損傷和毒性的敏感性增加； 星形膠質(zhì)細(xì)胞在攝取谷氨酸方面有異常； 小膠質(zhì)細(xì)胞對興奮物質(zhì)的反應(yīng)性下降；在突觸形成中有結(jié)構(gòu)改變。由此可見，PrPC可能在一定程度上參與神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持。2參與神經(jīng)組織的Cu2+代謝 PrPC作為腦組織中膜在銅結(jié)合蛋自參與神經(jīng)組織中Cu2+的穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)節(jié)，當(dāng)轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSC就失去結(jié)合Cu2+的能力，造成神經(jīng)組織中Cu2+含量異常，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。 Cu2+對不同神經(jīng)細(xì)胞PrPC的影響也不相同。3抗氧化 P

9、rPC通過與銅原子形成復(fù)合物而發(fā)揮抗氧化活性。PrPC借其八肽重復(fù)區(qū)最多可結(jié)合4個銅原子。結(jié)合后形成的復(fù)合物具有抗氧化活性，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。4參與淋巴細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo) PrPC可高水平地在人T、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中表達(dá)，不同細(xì)胞中表達(dá)PrPC的糖基組成、糖鏈形狀及蛋自酶解的敏感性都有差異。 T細(xì)胞的活化伴隨著其表而PrPC的表達(dá)上調(diào)，且PrPC在記憶T細(xì)胞比初始T細(xì)胞的表達(dá)水平高。5細(xì)胞凋亡 在PrP敲除小鼠神經(jīng)元中，多種凋亡相關(guān)蛋自顯著增加，線粒體Ca2+含量改變、細(xì)胞色素c釋放，都表明PrP參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過程。 體外試驗(yàn)也顯示PrPC能夠保護(hù)人的神經(jīng)元免受Bax誘導(dǎo)的

10、細(xì)胞凋亡，而缺失八肽序列或C端帶有突變的PrP均不具有該活性。6核酸代謝 Gabus等根據(jù)小鼠中瘟癢病的感染過程會因鼠自血病病毒（MuLV）的復(fù)制而加速，以及人類PrP功能上類似于NCp7，可輔助反轉(zhuǎn)錄酶合成前病毒DNA等現(xiàn)象，提出PrP可能參與了體內(nèi)核酸代謝過程。四、朊病毒的致四、朊病毒的致病機(jī)理病機(jī)理致病機(jī)理致病機(jī)理電泳活性染色法阮病毒學(xué)說 “yeast prions”學(xué)說 1阮病毒學(xué)說 PrPC是一種膜蛋白，其C端含有23個氨基酸組糖基磷酸肌醇(GPI)錨受體結(jié)合位點(diǎn)，因此可通過糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitol phosphohptds)聯(lián)在膜上，定位于細(xì)胞膜的穴樣內(nèi)陷類結(jié)構(gòu)域（

11、CLDs），在神經(jīng)元，當(dāng)膜漿膜上的PrPC變成為PrPSC后，PrPSC脫落并聚集在神經(jīng)元的溶酶體。當(dāng)達(dá)到數(shù)量，就可使神經(jīng)元細(xì)胞破裂，形成神經(jīng)組織的空泡化，并使星型膠質(zhì)細(xì)胞增生，2“yeast prions”學(xué)說 3蛋白的氧化反應(yīng)學(xué)說 楊池明提出了瘋牛病蛋白長壽命自由基即為瘋牛病中的亞病毒的理論設(shè)想，他認(rèn)為真正的瘋牛病蛋白亞病毒可能是由蛋白的氧化反應(yīng)所形成的瘋牛病蛋白自由基。 應(yīng)用此理論能夠解釋瘋牛病的一些病理現(xiàn)象。五、朊病毒的檢五、朊病毒的檢測測接種傳遞組織印記法酶聯(lián)免疫吸附法毛細(xì)管凝膠電泳朊病毒的檢測朊病毒的檢測取組織標(biāo)本取組織標(biāo)本 10倍連續(xù)稀釋倍連續(xù)稀釋研研 磨磨10個稀釋濃度個稀釋濃

12、度分別接種小鼠分別接種小鼠直到死亡直到死亡或盲傳幾代或盲傳幾代 出現(xiàn)癥狀出現(xiàn)癥狀殺死，殺死，取腦組織檢查取腦組織檢查 死亡死亡不出現(xiàn)癥狀不出現(xiàn)癥狀 觀察觀察飼養(yǎng)飼養(yǎng)24h未死亡未死亡正常飼養(yǎng)正常飼養(yǎng) 補(bǔ)接補(bǔ)接1動物的接種傳遞實(shí)驗(yàn)取標(biāo)本取標(biāo)本甲酚脫毒甲酚脫毒甲醛固定甲醛固定石蠟包埋石蠟包埋 55干燥干燥二甲苯脫蠟二甲苯脫蠟 異丙醇水化異丙醇水化 空氣干燥空氣干燥蛋白酶蛋白酶K消化消化 鹽酸胍處理鹽酸胍處理 1. 前處理前處理2. 檢測檢測NC：硝酸纖硝酸纖維素膜維素膜 前處理品前處理品免疫學(xué)檢測免疫學(xué)檢測取出取出NC膜膜5-7m薄片薄片收集在收集在NC上上2mm厚切片厚切片切片切片55水浴水浴2組織印記法勻漿勻漿離心離心處理處理顯色顯色 3酶聯(lián)免疫吸附法 電泳電泳 4毛細(xì)管凝膠電泳免疫測定法六、展望六、展望高級結(jié)構(gòu)致病原因感染性 如何對非結(jié)晶型的朊病如何對非結(jié)晶型的朊病毒蛋白進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)的毒蛋白進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確分析，能否尋找一準(zhǔn)確分析，能否尋找一種方法，可以獲得朊病種方法，可以獲得朊病毒蛋白的準(zhǔn)確的高級結(jié)毒蛋白的準(zhǔn)確的高級結(jié)構(gòu)。構(gòu)。 朊病毒的致病原因是朊病毒的致病原因是PrPsc的過度增殖還的過度增殖還