第八章非線性色譜原理及其在蛋白質(zhì)分離與純化中的應用

1、第八章非線性色譜原理及其在妥。分,與純化中的應用第一節(jié)概述色譜法起源于20世紀初，1906年俄國植物學 彖米哈伊東茨維特用碳酸鈣填充豎立的玻璃管， 以石油隧洗脫植物色素的提取液，經(jīng)過一段時間洗 脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中實現(xiàn)分離，由一條 色帶分散為教條平行的色帶。由于這一實驗將混合 的植物色素分離為不同的色帶，因此茨維特將這種 方法命名為XpoMaTO r p a（|）m利，這個單 詞錄終被英語等拼音語言接受，成為色譜法的名稱。 漢語中的色譜也是對這個單詞的意譯。1952年馬丁和詹林斯提出用氣體作為流動相進行色譜分離的想 法，他們用硅藻土吸附的硅酮油作為固定相， 用氮作為流動相分離了若干種小

2、分子量揮發(fā) 性有機酸。卷和色譜出現(xiàn)使色譜技術(shù)從錄初的定性分離手段進一步演化 為具有分離功能的定量測定手段，并且極大的剌激了 色譜技術(shù)和理論的發(fā)徵。相比于早期的液相色譜，以專體為 流動相的色譜對 設備的要求更高，這促進了色譜技術(shù)的機械化、標準 化和自動化；氣相色譜需要特殊和更靈敏的檢測裝置，這促迷了 檜測器的開發(fā)；而氣相色譜的標準化又使得色譜學理 論得以形成色譜學理論中有著重要地位的塔板理論和 Van Deemter方程,以及保留時間、侏紹指數(shù)、峰寬 等概念都是在研究氣相色譜行為的過程中形成的。60年代，為了分,要。質(zhì)、核酸等不易沌化的大分子物質(zhì)，趨和色譜的理合和方 法板重新引入經(jīng)典液相色譜。6

3、0年代末科克蘭、哈佝、苻瓦斯、菌 黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺嵩 效法相色譜儀，開啟了需效法相色譜的時代。 高效法相色譜使用拉控更細的固定和填充色 譜樁，提高色譜樁的緣板數(shù)，以需壓驅(qū)動流 動相，使得經(jīng)典法相色譜需要數(shù)目乃至教月 完成的分書工作得以在幾個小時/至幾十分 鐘內(nèi)完成。1971年科克絲等人出版了法相色譜的 現(xiàn)代實戲一書，標志著高效法和色譜法 CHPLCJ正式也立。在此后的時間里，需 效液相色譜成為景為帝用的分甫和檢測手段, 在有機化學、生物化學、醫(yī)學.藥物開發(fā)與 檢測、化工、食品科學、環(huán)境監(jiān)測.商檢和 法檢等方面都有廣泛的應用。高效法相色譜同時還極大的剌激了固定相材料、檢測技術(shù)

4、、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理企的發(fā)展。色譜法的基本特點1、分,效率需2、應用范圍廣3.操作參數(shù)多4、高靈敏度在線檢測5、快速分禽6、連續(xù)自動化操作保留日寸間/min圖8-1 TSK-十八烷基無孔聚合物反相柱分離蛋白質(zhì)色譜柱：-NPR (內(nèi)徑 4.6mmX 35mm);沂tiM 1 -5 ml/rrrin; 溫l度 25 P ; 樣品：1核糖核酸酶；2一胰島素；檢測器一UV：nm3一細胞色素C; 4一溶菌醒；5 a-乳清蛋白；6一肌紅蛋白；7一卵清蛋白淋洗條件：線性梯度為乙廉在0 05%三氯乙酸中8 min 內(nèi)從，20 %80 %1、分宙效率需每米可達十幾萬個理合塔板，幾個度來的色譜 樁就可以分喜多

5、如分的蛋。質(zhì)混合物。2、應用范陽廣從極性到非極性，禽子型到非肉子型，小分子 列大分子，無機到有機及生活物去，以及其它熟 穩(wěn)定或熱不穩(wěn)定的化合物，可以說無所不包。尤 其是對生物樣品的分言分析，是其他方法無法代 琴的。3、操作參數(shù)多流動相可以是工體、液體或婕臨界流體。各種 流體中又有不同的物質(zhì)可選用。固定和可用液、四兩大類，令類中又有許多種 可供選擇。4、離靈敏度在線檢測與其他分喜手度相比，色譜具有高靈敏度左線檢測 的特性。有各種不同的檢測黑，適合于多種千差萬別 的樣品需要。5、快速分禽HPLC由于采用了高壓漆劑傳輸條統(tǒng)，即使采用高效 細顆拉埴料，也能保證分害過程在一定的線速下進行, 而且由于精效

6、提高，更加快了分毒速度。6、連姨色動化掾作電腦用于色譜分害過程以后，從錄切的簡單數(shù)據(jù)處理 發(fā)裝到圖葡作為控制恭作的中心，夜大量的樣品可以 按事先設置的程序進行完全自動連鎮(zhèn)的標作。二、線性色譜與非線性色譜線性和非愛性是就學帝敦的概念，表示自支 量與度變量之間的關系。在色譜學中，如果流動 相中樣品濃及Cm與固定粕中樣品的濃度Cs之間 呈愛性關東，那么在這種情況下的色譜分酩過程 就是線性色譜，即：Cs=KCmK為分配余數(shù)。Cm流動相中樣品的濃度。CS 固定相中樣品的濃度規(guī)律如果Cs和Cm之間不存在線性關余，而是出 現(xiàn)其他的翦教關東，那么對應的色譜分宙過程 就稱為非線性色譜。在實踐過程中得知，當樣品忒

7、度很低時， Cs和Cm之間往往保持愛性關系。在高濃度對 Cs和Cm之間往往不出現(xiàn)戰(zhàn)性關東。非線性和線性色譜行為的根本不同表現(xiàn)在以下幾個方面1、樣品的保留值可變。2、崢形不對稱。3、色譜蜂的蜂嵩與濃度不是線性關東第二節(jié)非線性色譜理論基礎非線性色譜理論是研究樣品在固定相 與流動相中的濃度處于非線性關東的狀忠 下，各種實除參數(shù)對色譜分宙過程的影響, 戲立起板參致、溶質(zhì)性質(zhì)及操作條件之間 的定量關東式。由于此時Cs與Cm不呈端性 關東，所以必須首先了解他們之間的翦數(shù) 關東，也既要研究吸附等溫線及相應的吸 附模型。一、吸附過程及吸附等溫線，雙附指一種通常發(fā)生左兩粕界面上的現(xiàn)象：處于 界面上的分子 或原子

8、與其內(nèi)部的分子或原子具痞不 同的能量與性質(zhì)，產(chǎn)生了一種不平街的傾向，造成 界面的分子或原子數(shù)與內(nèi)部不同，這種差異就形成 了吸附現(xiàn)象。/雙附過程主要分為兩大類：化學吸附和物理吸附/化學嫉附熱大，吸附過程往往是不可逆的，而物 理吸附熱小，吸附往往是可逆的。物理吸附與化學吸附產(chǎn)生物理雙附的作用力是分子同力，即范德華力.產(chǎn)生化學吸附的作用力是化學如力.化學吸附時 可發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移，原子的重排，化學校的斷裂與形 成等微見過程.物理吸附和化學吸附往往可以同時發(fā)生，如02 在W上的雙附.在不同的溫度下，起主導作用的雙附 可以發(fā)生變化.物理吸附與化學吸附的比較物理吸附化學吸附吸附力范德華力化學鍵力吸附層數(shù)單層

9、或多層單層吸附熱小，近于液化熱大，近于反應熱選擇性 "-無或很差段強可逆性可逆不可逆吸附平衡易達到不易達到A吸附等溫線是指成一定溫度下物質(zhì)分子在兩相界面上叱行的吸附過程達到平衡對他們在兩相中濃度之間的關系。A在HPLC領域內(nèi)常逐利的吸附等溫線可 分為以下幾類，即凸形、3形、S形、H 形和階梯形。吸附等溫線大致可歸納為五種類型，只有(a)符合單分子層吸附.其余皆 為多分子層吸附。PN2在活性炭上的N?在硅膠上的吸Rr,在硅膠上基在氧化鐵凝膠水氣在活性碳上的 吸附(-195P)附(-195C)的顯附(79 P)上的吸附(50。)吸附(100。(a)(b)(c)(d)(e)幾種類型的吸附等

10、溫線A凸形吸附等溫線是液固條統(tǒng)中常見的一種，通 常出現(xiàn)于大多數(shù)小分子化合物，它反映了溶質(zhì)分子在固體表面達到飽和時生成了單分子吸附層。AH形等溫線是凸形等溫線的特殊狀態(tài)，它代表了一類很叁易在固體表面吸附的物質(zhì)，而且很看易達到飽和態(tài)，這類吸附主要是一些分子量大的聚合物，如聚乙稀、聚笨乙稀等高聚物及酶、核 酸、蛋由質(zhì)、糖等生物大分子。A凹形吸附等溫線是適用于在低濃度下 已吸附 的狼吸附分子又能吸附在液相中的分子、從而 生成多分子吸附層的那些物質(zhì)。AS形等溫線實際上是凹形和臼形兩種等溫線疊 加的產(chǎn)物，它代表了故吸附的分子之間具有很 強的作用力，能進一步吸附其它分子，而濠質(zhì)分子與固體表的作用力相對較弱，

11、或者與表面覆蓋率無關。吸附等溫線信息1、可以預測代表了該吸附等溫線的組分在 非線性色譜中色譜峰的形狀。2 .為非戰(zhàn)性色譜分,與先化物質(zhì)選擇聚佳 條件。3 .反映極分,物質(zhì)分子與國定相表面的作 用，從而研究分子的構(gòu)型與吸附狀忠。4 .災立分子結(jié)構(gòu)-吸附之間的定量關東，從而由分子結(jié)構(gòu)預測吸附性能。吸附等溫線的測定及附等溫線的測定可以分為普態(tài)法與動態(tài)法兩大類。1、靜香法：較簡單，是一種經(jīng)典的方法，是將被 測物質(zhì)流斛在灌制中配成一定濃度的漆浪，再敵人 一定量的閡相吸附劑，等體未達到平街后，根據(jù)漳 法濃度的戒少CACJ、漳液體積CVJ和吸附劑量(G),就可以計算漳質(zhì)在吸附制上的濃度(q)q= ACXV/

12、G始制一條列漳浪濃度，可以得到一系列q值，將q 與其相平褥的：做圖，即可得到該注質(zhì)在波固系統(tǒng) 中的吸附等溫線。2、功忠法動態(tài)法最早是用氣相色譜原理來測定氣 固或4氣液兩相中的吸附等溫線的，常用的有 4種方式：前'沿分析fFAJ ；特征點的沿分析CFACPJ ；特征或洗脫CECPJ ；平臺洗脫f EPJ o18-2 FA、FA(R ECP、Em定R聘溫發(fā)恥燃方法mimm透gFA福大繳小ft*FACP蝙小大可以ECP 孀.觸；一次大:-發(fā)EP福然小«可以困 S-3微坦吸附普遍絨網(wǎng)走儀流:建國1而工裁；2動眄；3電磁網(wǎng)；4 店也空54 9 64 r5Zi A. ; *7iffi.

13、A. ; 8i®. B ;9 樣品膏 13; IO吸附柱， 11遍水咨1 12檢洪4錯; 132己裝儀、14詼:計；15 座費曲=:=g=;= =:=0=圖8-4 前沿分析測定a-胰凝乳蛋白酶A在弱陽離子交換劑（WCX）上吸附等溫線的色譜圖,沿分析法(frontal analysis, FA)是由 James和Philips, 1964年看先提出并將其用于單組分等溫線的測定。 FA賣膾過程是左色譜樁入口處每隔一定時間連鎮(zhèn)壓 入大量濃度不斷通增的持測樣舄。在FA中，對每一 個濃度的樣品，進樣量要足夠大，以保證其洗脫曲 端中與進樣濃度呈愛性關系出現(xiàn)濃度平臺。由于FA 在測定單如分等溫線時

14、僅需要洗脫,沿出現(xiàn)時的保 留時間和與其濃度相對度的平臺高度，可以克服由 低濃度數(shù)據(jù)點產(chǎn)生的誤差所造成的摟個等溫線偏喜 的缺陷。二、非線性色譜基本理企非線性色譜理論是通過研究故分離物質(zhì)在 兩相中呈高濃度情況下的濃度變化與吸附等溫 線、傳質(zhì)速率、進樣方式等因素的關東，建立 起定量的函數(shù)形式，從而能預測最佳分離條件, 得到滿意的分離結(jié)果。1、雙附平街想力學芻極分害的物質(zhì)在色譜條饒中達到熱力學平街時， 它在液相與固相中的濃度關系可用雙附平街方程式表4JV oKa S+A ;SAKd2、灰附平街動力學色譜分禽過程實際上是一個由不平街列平街、周而 復始的連續(xù)過程。平街的速率由下式可以表達為：dQ_=Ka(

15、Qo-Q)-KQ第三節(jié)非線性色譜的實除方法由于非線性色譜涉及的樣品忒度大大需 于線性r分析型）色譜的，因此通常的分析 型色譜儀及其流程就不完全符合非線性色譜 的要求，某些部件必須加以改造才能滿足要 求，以便于在優(yōu)化條件下使用，而且在實驗 方法上也需加以適當?shù)母淖?。一、非線性色譜中的固定相及色譜柱1、固定相在生物大分子分析型高效液相色譜中的 固定相耳骨幾乎都是用細顆粒大扎徑的填 料，但是云非說我色譜中，粗和細的可以 兩者都在使用。原則上林細顆粒埴料的柱 效要高，但價格也貴。粗顆粒填料雖粒效 低，但價格便宜，而且柱壓降低適合于大 型制備核。材料：填料的基體仍以硅膠和有機樹脂兩大類為主。 如系硅朕和

16、市機樹泰基體的理化性能（如扎隙度、顆 卷大小.比表面及鍵合的備能團）卻一樣，鄴么他們 呈現(xiàn)的色譜性能沒有顯著的差別。亂隙度：填料亂桎大小的要求對不同生物大分子也 不一樣，例如分肉核酸要求乳桎至少在50nm以上，分 禽蛋白質(zhì)一般要求左30-100nm,而JL隨分子量不同而 異。3O5Onm可分啻30-100kD的蛋。質(zhì)，而分畜 100kD以上的妥。質(zhì) 要求我桎在80100nm。扎桎越大，比表面越小,而，埴料對樣品的負我量也彈低，而且機械強度也臧弱。但是由于傳質(zhì)阻 力戒少而使不同范圈的妥6質(zhì)都能得到分啻，故伎埴 料效率提高。aoaiyj-o-o人悔水甘油內(nèi)fit .甲氣基底院JflUE股ay,-o

17、<12Nib-配位體CHj),-o-aij-<ki. |i-c jiMWR1NalQ,NaBH4，串一如停I?X- 均一Kf 11 ie 位體-(CH2hC-CHjG總硅膠1 號二仙*. -o<CHJ)J-OH2NH KQ»t) »c J-O-Q-NOj - 1-O A-tCJhh-O-CCIIih-O-？-O-QNoJI 均N-耽體CJljJj-O-fCTIjhW8-5硅皎為亞體合成帶不同活性基團中間體及配位體 的親和色諾填料的合成路規(guī)a*2>r-o-o«2-oh-o»< fflWHW、b) mS!位體jr(Uljh-OI

18、CIhhO0-2 J ,，2N-配位體分,生物大分子的主要填料1、反向填料：垸基鏈長是根重要的因素。反向填料上鏈合的烷基鏈長似乎與安質(zhì)的分子量也有反相的關東，即長鏈垸 基填料適合于分,小肽，短健垸基適合 于分,多肽及安。質(zhì)。2.疏水作用填料：這種填料的跳水作用比反向填料弱，主要是填料表面垸基密度3、毒子交換填料：包括強陽禽子、弱的 書子.強陰甫子、弱陰因子4種填料。4、體余排斥填料:無機填料一硅膠為主O有機填料中常用Pharmacia出的球器類填料。5、親和填料：東和填料盡管選擇性好，但耒大的問題是商品種類太少，幾乎對每一種 生物大分子的分畜都需要合成該種大分子所 需要的特珠親和冢料。* 83

19、 l-HK.系列的總和及3c住Wfe-I-SK -Ocl 0 的RFG1OOOIT . 800011 G7OOOH* 法 乙體收槽 K0XK 分于 ,分布、令SEZmE分析3O2CXM)HW .03000PW CKiOOOfW 乙4 SI* 水醍岐、體風抄尺憤AV、旁介*9K化02000SW . C3OOOSW .oooswAt 0B!卓水履般、體白分與分析VM-X»w C7M-SPW SP-5RW DEZkK 2»WDEAK-5PW曉JRk曲陽k十文0的（一COO-） 余水離分子加耐陽子文0刑（一8。- > 安承 分子餐 尸女 0刑一SO.Ot 岐！U94nH于文-

20、Z , HE” ）內(nèi)分子擊水型網(wǎng)明川人女攜刑（一 N - lil£u>土。人T 忻、分，內(nèi)化Phonyl 5PW Rtlwr 5I»W*"分2親水4分于531«水作，”0科乙二f 介的余水點分了 F 9 水件川0 8生物大分7r m，分析9分雨Phenyl-SPW-RPOct ade<-y 1-4 PW OTJB-120A.120T A KTITVICMc V>ZA RP埃 MS反和 H 1余水 分子 0» 十八%（爾內(nèi)分于？W）士人址*皮4H1A Xt a a 怏聯(lián)應柚0X（壽水A分子SO介子大mm白質(zhì)和覘、分子小gat白

21、W、低分子 物4r.皿、|«3«>仙分析分.Amide-MOm wr.*k .#7c，g分內(nèi) T分儕ChclMto-SHWHcfrin-SfWBls-SPWHorocu*te«SPWAlA-SPW二f 儂Cit>ncron 干 F3G-A4KMM時*中睜布qJK T1 Cuae .Nn .Z/，9fd10 的分析與分內(nèi)白質(zhì).imiw*g 分析用分內(nèi)*M白、fWMt比Kk不、干擾 分析、分*W!縝、情移 RZA、校僮、1件*、*、1L 裝分忻H分內(nèi)分*HA- KMX)Suffer XXI於3er 04y文AK（E4«0：k冼）好黑型注網(wǎng)Kr/t

22、接內(nèi)41反潛撫）恪” .«» .mKM 分析 卉，Lg的分帳KnantAoP、P，L”。徑間定M10X光，弁W體分LJEAE-ISXHRSPZPRBI9J 子交掇用K Z HK”> 實心中水*we則） 幽雨于安拽加«SO>> 實心東水*眄）U門網(wǎng)怏0分儕叼”網(wǎng)2.色譜樁及填充技術(shù)A以分禽免化為主要目的的非戰(zhàn)性色譜與 分析色譜一樣，色譜樁是極關鍵的部分。A色譜板關鍵考慮兩方面：一是色譜樁的長度；二是樁的填充。色譜柱長度的選擇要考慮多種因素：1、為達到一定的分啻度就要求有一個起瑪?shù)陌彘L， 否則分禽的組分就達不到所需的純度。2、不同的埴充方法埴充的色譜

23、樁都有一個景長的 限度，疵過了這個限度，就無法得到均勻的填充床。3、精效也不是與樁長永運呈比例增長，捉過某一 長度，樁效不再隨樁長增加。4、高壓泵的袞量不允許使用很長的色譜樁。5、在置換色譜中，趣過了素佳粒長，反而會澤低 產(chǎn)率，提高成本6、粒役的選擇也4艮童要。(a)徑向壓縮(b)軸向壓縮(c)環(huán)形擠壓圖8.6制備色譜柱中各種壓縮技術(shù)示意圖(箭頭指示壓力的方向及大小)樁的埴充樁的統(tǒng)無目葡主要仍用干法和濕法兩種：1、干法標作簡單、方便，不需要特殊設備，但 精效一般較差，只遺用于直程大于30Hm的顆 尬，而且更適用于直隹較大的色譜樁。2、濕法埴充主要適用于20|iim以下的顆粒統(tǒng)料， 分恒流與恒壓埴充2種。樣品溶解與進樣方法A用非線性色譜分害與她化生物大分子時，制備 合逡的樣品涂液是成敗的關純之一。L 蛋6質(zhì)的漆解度有限，通奉需加入其他試劑 以增加它在水中的溶解度。2、漳波的性質(zhì)於須逡應于所用的固定相，使 大量的樣舄漆波導人色譜樁后不馬上步做，集 中在柱頭，以達到“塞式”進癢目的。»適當漆液制備后，