組織學(xué)與胚胎學(xué)：01-組織學(xué)緒論

1、第第1 1章章 組織學(xué)緒論組織學(xué)緒論Introduction of Introduction of Histology Histology一、組織學(xué)的研究?jī)?nèi)容和意義 組織學(xué)（histology）是研究正常機(jī)體微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的科學(xué)。 只有學(xué)好組織學(xué)，認(rèn)識(shí)人體的微細(xì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能，才能全面掌握人體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，探索生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)。 只有認(rèn)識(shí)了人體的正常結(jié)構(gòu)，才能更好地分析和理解人體的生理過(guò)程和病理過(guò)程，才能學(xué)好生理學(xué)、病理學(xué)及其他醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程和臨床課程。三、組織學(xué)的研究方法和技術(shù)（一）普通光鏡標(biāo)本的制備和光鏡觀(guān)察 應(yīng)用普通光鏡觀(guān)察組織切片是組織學(xué)研究的主要技術(shù)，可獲得有關(guān)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功

2、能的許多信息。光鏡的放大作用由其光學(xué)部分實(shí)現(xiàn)，后者主要由聚光鏡、物鏡和目鏡組成 。（一）普通光鏡標(biāo)本的制備和光鏡觀(guān)察 生物組織和器官不能直接在光鏡下觀(guān)察，制備能使光線(xiàn)透過(guò)、微細(xì)結(jié)構(gòu)清晰可辨的組織切片是組織學(xué)研究的基本方法，主要包括固定、切片、染色等步驟，常用石蠟切片、HE染色。石蠟切片 組織塊必須有一定的硬度方可切成薄片。首先用酒精和二甲苯將固定后的組織塊脫水(dehydration)和透明(clearing)，再用熔化的石蠟浸透、包埋(embedding)，制成有一定硬度的組織蠟塊，然后用切片機(jī)(microtome)將其切成510 m厚的組織切片(tissue section)，貼于載玻片上

3、 。上述方法稱(chēng)石蠟切片(paraffin sectioning)，是組織學(xué)中的常規(guī)切片方法。 HE染色 組織學(xué)中最常用的染色方法是蘇木精（hematoxylin）和伊紅（eosin）染色法，簡(jiǎn)稱(chēng)HE染色法（HE staining）。蘇木精使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的核糖體等酸性物質(zhì)染成紫藍(lán)色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的堿性成分染成淡紅色。 與堿性染料親和力強(qiáng)、易被染色的特性稱(chēng)嗜堿性（basophilia）；與酸性染料親和力強(qiáng)、易被染色的特性稱(chēng)嗜酸性（acidophilia）；若與兩種染料的親和力都不強(qiáng)，則稱(chēng)中性（neutrophilia）。 （三）電子顯微鏡術(shù) 電鏡（Electron Microsc

4、opy）不同于光鏡之處是用電子束代替可見(jiàn)光，用電磁場(chǎng)代替玻璃透鏡。電鏡又分為透射電鏡術(shù)和掃描電鏡術(shù)。各種顯微鏡的分辨率與人眼的比較各種顯微鏡的分辨率與人眼的比較分辨率人眼0.2 mm普通光鏡0.2 m透射電鏡0.10.2 nm掃描電鏡2.5 nml透射電鏡術(shù) 透射電鏡術(shù)（Transmission electron microscopy）用電子束穿透標(biāo)本，經(jīng)過(guò)電磁透鏡的會(huì)聚、放大后，在熒光屏上成像，直接觀(guān)察，或?qū)⒂跋裢渡涞秸障嗟灼瞥呻婄R照片進(jìn)行觀(guān)察。透射電鏡的分辨率可達(dá)0.10.2 nm，放大倍數(shù)從幾千倍到幾十萬(wàn)倍。由于電子束穿透力弱，電鏡標(biāo)本需制成5080 nm的超薄切片。2掃描電鏡術(shù) 掃

5、描電鏡術(shù)（Scanning electron microscopy） 用于觀(guān)察細(xì)胞、組織和器官表面的立體微細(xì)結(jié)構(gòu)。將小塊組織（直徑約0.3 cm）經(jīng)固定和臨界點(diǎn)脫水干燥后，在其表面噴鍍薄層碳膜和金屬膜。掃描電鏡發(fā)射的細(xì)電子束在樣品表面按順序逐點(diǎn)移動(dòng)掃描，使樣品表面金屬膜發(fā)射出電子（稱(chēng)二次電子），二次電子信號(hào)被探測(cè)器收集，經(jīng)過(guò)放大，在熒光屏上成像。掃描電鏡的景深長(zhǎng)，圖像清晰，富有立體感。（四） 組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 組織化學(xué)（histochemistry）和細(xì)胞化學(xué)（cytochemistry）技術(shù)是應(yīng)用化學(xué)反應(yīng)原理檢測(cè)組織和細(xì)胞的化學(xué)成分并進(jìn)行定位和定量的技術(shù)。組織細(xì)胞中的糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)

6、、核酸、酶等均可與相應(yīng)試劑反應(yīng)，最后形成有色反應(yīng)終產(chǎn)物或電子致密物，應(yīng)用光鏡或電鏡進(jìn)行觀(guān)察。 糖類(lèi)物質(zhì)常用過(guò)碘酸-Schiff反應(yīng)(PAS反應(yīng))顯示。 脂類(lèi)常用蘇丹染料、油紅O、尼羅藍(lán)等脂溶性染料染色。 PAS反應(yīng)示肝細(xì)胞內(nèi)的糖原顆粒（箭頭）蘇木精復(fù)染 高倍 （五）免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)是根據(jù)免疫學(xué)原理，應(yīng)用帶有可見(jiàn)標(biāo)記的特異性抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)組織、細(xì)胞中多肽和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的一種技術(shù)。 進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時(shí)，首先要獲得被檢多肽或蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的抗體。其次，要對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記。 常用的標(biāo)記物有: 熒光染料熒光染料，如異硫氰酸熒光素(FITC)、得克薩斯紅(Texas red)；

7、酶類(lèi)酶類(lèi)，如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等；重金屬重金屬，如膠體金、鐵蛋白等。最后，應(yīng)用標(biāo)記抗體孵育標(biāo)本，標(biāo)記抗體即與組織細(xì)胞中的相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合，可分別在熒光顯微鏡、普通光鏡和電鏡下觀(guān)察。免疫細(xì)胞化學(xué)的方法免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)主要有直接法和間接法）。直接法是標(biāo)記某抗原的特異性抗體（又稱(chēng)第一抗體），用標(biāo)記的第一抗體孵育標(biāo)本以檢測(cè)其中的抗原成分。在間接法中，第一抗體不標(biāo)記；以第一抗體作為抗原免疫另一動(dòng)物，制備抗第一抗體的抗體，即第二抗體，并標(biāo)記第二抗體。染色時(shí)，先后以第一抗體和標(biāo)記的第二抗體處理標(biāo)本，在抗原存在部位形成抗原-第一抗體-標(biāo)記第二抗體復(fù)合物，以達(dá)到檢測(cè)該抗原的目的。 為了在一張組織切

8、片上同時(shí)顯示兩種抗原物質(zhì)，以發(fā)現(xiàn)其定位、形態(tài)、甚至功能上的相互關(guān)系，可使用免疫細(xì)胞化學(xué)雙重染色（double staining）。 電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)常用膠體金標(biāo)記技術(shù)。（六）原位雜交 原位雜交是一種在組織細(xì)胞原位進(jìn)行的核酸分子雜交技術(shù)，敏感度高，特異性強(qiáng)，是當(dāng)前分子生物學(xué)研究的重要手段。原位雜交的原理是兩條單核苷酸鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)原則緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的雜交體。根據(jù)這一原理，用一條堿基序列已知、經(jīng)特定標(biāo)記的核苷酸鏈為探針，與組織切片、細(xì)胞制備或染色體標(biāo)本中的待檢DNA或mRNA片段進(jìn)行雜交，然后顯示標(biāo)記物，從而獲得待檢核酸的分布分布和含量含量等信息 。按照探針?lè)肿拥男再|(zhì)，可將其分為cDNA探針、

9、cRNA探針和寡核苷酸探針。 （七）放射自顯影術(shù) 放射自顯影術(shù)(Autoradiography)可通過(guò)研究機(jī)體對(duì)放射性核素標(biāo)記物的攝取和代謝過(guò)程來(lái)檢測(cè)機(jī)體、細(xì)胞和組織的生物學(xué)特性生物學(xué)特性及功能功能狀況。（八）活體組織和活細(xì)胞研究方法1組織（細(xì)胞）培養(yǎng)術(shù)組織（細(xì)胞）培養(yǎng)術(shù)將組織或細(xì)胞放置在體外適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)的技術(shù)統(tǒng)稱(chēng)組織培養(yǎng)術(shù)。利用機(jī)械分散法或酶（如胰酶和膠原酶等）消化法分離組織中某種細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，使之貼壁生長(zhǎng)或懸浮生長(zhǎng)，稱(chēng)為細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)一般在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行，嚴(yán)防微生物污染，同時(shí)要有合適的溫度、O2和CO2濃度、濕度等。培養(yǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)來(lái)自培養(yǎng)

10、基，可根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)選用不同的培養(yǎng)基。2. 組織工程組織工程是用細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)在體外模擬構(gòu)建組織或器官的技術(shù)，它是生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)交叉融合的產(chǎn)物，也是目前生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)、外學(xué)者應(yīng)用組織工程技術(shù)已開(kāi)展了許多人造組織和器官的研制，如皮膚、軟骨、骨、肌腱、角膜、神經(jīng)、血管、氣管等，其中組織工程化皮膚和軟骨已獲得成功，并用于臨床。n組織工程的基本方法是：取少量組織，分離、培養(yǎng)細(xì)胞（稱(chēng)種子細(xì)胞）；應(yīng)用人工合成的有機(jī)高分子聚合物（如聚羥基乙酸和聚乳酸）或天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分（如膠原和纖維蛋白）制備有一定形狀和空間結(jié)構(gòu)的三維支架；將種子細(xì)胞種植到支架上，在體外培養(yǎng)或植入體內(nèi)；細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，并分泌

11、細(xì)胞外基質(zhì)，而支架材料逐漸降解吸收，從而形成有一定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官，用于組織修復(fù)。3活體染色與活細(xì)胞染色 活體染色與活細(xì)胞染色（Vital Staining and Vital Cell Staining）活體染色是將無(wú)毒的染料注入動(dòng)物體內(nèi)無(wú)毒的染料注入動(dòng)物體內(nèi)，組織或細(xì)胞選擇性攝取染料后，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察，研究其分布和功能其分布和功能等。如將墨汁注入動(dòng)物體內(nèi)，被巨噬細(xì)胞吞噬，從而觀(guān)察巨噬細(xì)胞的分布和吞噬活性。 也可對(duì)分離的活細(xì)胞或體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接進(jìn)行染色，稱(chēng)體外活體染色。如取血液，與煌焦油藍(lán)染液混合，染色數(shù)分鐘后涂片鏡檢，可顯示網(wǎng)織紅細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，以判斷骨髓的造血功能。4. 活細(xì)胞與

12、死細(xì)胞的鑒別有些染料不能進(jìn)入活細(xì)胞，但可進(jìn)入細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變的死細(xì)胞。如活細(xì)胞對(duì)臺(tái)盼藍(lán)拒染，而死細(xì)胞被染成藍(lán)色，常用此方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的存活率。Hoechst 33258和碘化丙啶是常用的熒光染料，均可與DNA結(jié)合。Hoechst 33258可進(jìn)入活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，使細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，活細(xì)胞的熒光均勻，凋亡細(xì)胞的熒光不均勻、增強(qiáng)或邊聚。碘化丙啶只能進(jìn)入死細(xì)胞，使其核呈紅色熒光。因此，用這兩種染料進(jìn)行體外活體染色，可區(qū)別活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。（九）形態(tài)學(xué)研究的定量術(shù)1形態(tài)計(jì)量術(shù)形態(tài)計(jì)量術(shù) 形態(tài)計(jì)量術(shù)（Morphometry）是運(yùn)用數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理對(duì)組織和細(xì)胞進(jìn)行二維和三維形態(tài)學(xué)測(cè)量的一

13、種研究技術(shù)，如細(xì)胞及其微細(xì)結(jié)構(gòu)的數(shù)量、表面積、體積、周長(zhǎng)等的相對(duì)值和絕對(duì)值。 其中三維立體結(jié)構(gòu)的研究又稱(chēng)體視學(xué)。傳統(tǒng)的體視學(xué)方法是將測(cè)試系統(tǒng)（點(diǎn)、線(xiàn)、網(wǎng)格等）投影或覆蓋在切片或照片上，進(jìn)行測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)、交點(diǎn)計(jì)數(shù)、輪廓計(jì)數(shù)、粒子計(jì)數(shù)或長(zhǎng)度測(cè)量等測(cè)試，根據(jù)平面測(cè)量的數(shù)據(jù)按一定的數(shù)學(xué)公式推算出其立體數(shù)值。2流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）是近年建立的細(xì)胞定量和分類(lèi)技術(shù)，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行生物化學(xué)和生物物理特性的快速定量測(cè)定。流式細(xì)胞儀由液流系統(tǒng)、激發(fā)光器件、信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和控制系統(tǒng)、細(xì)胞分選系統(tǒng)等組成。其工作原理是分離被檢細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行熒光染色或標(biāo)記，然后使單細(xì)胞液流快速通過(guò)該儀器的激光照射分析區(qū)，被檢細(xì)胞產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖，分別輸入計(jì)算機(jī)內(nèi)貯存，并顯示于示波器屏幕上，即可獲得該細(xì)胞群體中不同類(lèi)型細(xì)胞的有關(guān)數(shù)據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)等的研究。（十）示蹤術(shù)示蹤術(shù)是用細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)追蹤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)