棉花黃萎病菌的分離及培養(yǎng)技術(shù)研究

1、 編 號(hào)： 審定成績(jī)： 重慶郵電大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）設(shè)計(jì)（論文）題目：棉花黃萎病菌的分離及培養(yǎng)技術(shù)研究學(xué) 院 名 稱 ： 生物信息學(xué)院學(xué) 生 姓 名 ： 專 業(yè) ： 生 物 技 術(shù)班 級(jí) ： 學(xué) 號(hào) ： 指 導(dǎo) 教 師 ： 江懷仲答辯組 負(fù)責(zé)人 ：填表時(shí)間： 2015 年 5月重慶郵電大學(xué)教務(wù)處制重慶郵電大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 摘 要棉花黃萎?。╒erticillium Wilt of Cotton）是一種土傳性的維管束系統(tǒng)病害，嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和質(zhì)量，有人稱它為“癌癥”。病害發(fā)生的關(guān)鍵因子，除了品種抗病性較低和適宜的氣候條件外，土壤中棉花黃萎病菌的大量積累是棉花黃萎病發(fā)生流行的主要原因。據(jù)

2、國(guó)外報(bào)道，棉花黃萎病菌形成的休眠結(jié)構(gòu)微菌核，可以在土壤中常年存活，并成為危害侵染循環(huán)中最重要的侵染源。在全球因黃萎病所造成的經(jīng)濟(jì)損失平均每年達(dá)10億多美元，篩選利用抗病品種是防治黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一，而品種的篩選與鑒定及相關(guān)研究都需要分離和培養(yǎng)黃萎病菌種。本研究通過(guò)查閱現(xiàn)有文獻(xiàn)和結(jié)合現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件，采集四川簡(jiǎn)陽(yáng)棉花地里耕作層土壤、棉花根際土壤作為病菌分離材料，然后用最簡(jiǎn)單有效的逐步稀釋法稀釋樣本，并將稀釋液涂布在PDA培養(yǎng)基上。根據(jù)生長(zhǎng)出來(lái)的菌落形態(tài)和顏色等特征，挑取單菌落再用平板培養(yǎng)法分離出純化的棉花黃萎病菌。然后將所得的棉花黃萎病菌用不同液體培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)，從而選擇出一種最利于棉花黃萎

3、病菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，以利于將分離純化出的棉花黃萎病菌培養(yǎng)成可供應(yīng)用的黃萎菌液，供相關(guān)研應(yīng)究用。將采集的四份土壤樣本，稀釋成10-1、10-2、10-3不同濃度，涂布平板和平板培養(yǎng)后得到了4株純化的真菌，經(jīng)過(guò)鑒定最終得到了1株純化的棉花黃萎病菌。然后用不同液體培養(yǎng)基對(duì)棉花黃萎病菌對(duì)照培養(yǎng)，得出淘米水培養(yǎng)基培養(yǎng)的棉花黃萎病菌以微菌核形式為主；察氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的棉花黃萎病菌含有較多菌絲和孢子；馬丁氏培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的棉花黃萎病菌以含孢子為主。【關(guān)鍵詞】棉花黃萎病菌 分離和培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基 ABSTRACTVerticillium Wilt of Cotton is one of the main

4、diseases which affecting the yield and quality of the cotton. The key factor of the disease, in addition to less resistant varieties and appropriate climate conditions, the accumulation of a large number of Verticillium dahliae in soil is the main reason which cotton Verticillium wilt is popular. Ac

5、cording to foreign reports, sleeping structure micro-sclerotia which Verticillium dahliae formed can survive in soil all the year round and become the most important infection source of against infection cycle. In the world, the economic loss caused by Verticillium wilt account for one billion U.S.

6、Dollars average every year, one of the most cost-effective ways which control Verticillium wilt is filtering and using resistant varieties, while screening and identification of the species and related research all need to isolate and culture Verticillium species. In this study, according to search

7、the existing literature with the existing experimental conditions, we collected farming soil and rhizosphere soil from cotton of Sichuan Jianyang as bacteria isolated material, and then gradually dilute the sample, and coating the dilution on the PDA medium. Based on the growth characteristics of co

8、lony, such as shape and color, we can pick a single colony and culture it on the medium. In this way, we can isolate and select the purified Verticillium dahliae. And then Verticillium dahliae were cultured with different liquid medium. So that selecting one of the most favorable medium for the grow

9、th of Verticillium dahliae, in order to culture the isolated and purified Verticillium dahliae into yellow wilt bacterium，for research applications.Diluting the four soil samples which collected from Jianyang, into different concentrations of 10-1,10-2,10-3.Plating culture after coating plate, we ge

10、t four sets of purified fungi. After identification, I get a set of purified Verticillium dahliae. Then using different liquid media to culture Verticillium dahliae, finally, from the reproduction of Verticillium dahliae, we can draw a conclusion, after using Taomi Shui medium to culture Verticilliu

11、m dahliae, obtained a lot of micro-sclerotia; using Czapek liquid medium to culture, obtained many mycelium and spores; using Mading Shi medium to culture, obtained many spores.【Key words】Verticillium dahliae Isolation and Culture liquid medium目 錄前 言 1第一章 棉花黃萎病菌概述 2第一節(jié) 棉花黃萎病菌的形態(tài)特征 .2第二節(jié) 棉黃黃萎病發(fā)病癥狀 .2

12、第三節(jié) 棉花黃萎病菌的傳播及防治方法 .4第四節(jié) 研究目的及意義.5第二章 棉花黃萎病菌的分離.6 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料 .6 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法 .8第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 .12第三章 棉花黃萎病菌的培養(yǎng) 16 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料 .16 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法 .17 第三節(jié) 培養(yǎng)結(jié)果 .18 第四節(jié) 本章小結(jié) .21結(jié) 論 .23 致 謝24參考文獻(xiàn) 25附 錄 26 一、英文原文26二、英文翻譯36- 44 -前 言 我國(guó)是棉花產(chǎn)量最高的國(guó)家之一，棉花種植最早出現(xiàn)在公元前4-5千年的印度河流域文明中。在棉花傳入中國(guó)之前，中國(guó)只有可供充填枕褥的木棉，沒(méi)有可以織布的棉花。它既是重要的纖維作物，又是重要

13、的油料作物，也是含有高蛋白的經(jīng)濟(jì)作物，還是紡織、精細(xì)化工原料的戰(zhàn)略物資。現(xiàn)在棉花已經(jīng)成為我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，它具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)，提高棉花的產(chǎn)量除了能給種植者帶來(lái)豐富的收入，而且能間接提高我國(guó)的國(guó)民收入。棉花枯、黃萎病是危害棉花生產(chǎn)的兩大頑固病害，它們分別在現(xiàn)蕾期和花鈴期達(dá)到發(fā)病高峰期，潮濕或適當(dāng)?shù)臏囟纫灿欣诓『Φ陌l(fā)生。當(dāng)子葉受害后，出現(xiàn)水漬狀小斑，真葉發(fā)病時(shí)葉片出現(xiàn)斑塊。隨著植株的生長(zhǎng)其病害也不斷加重，最終病葉的邊緣及斑塊變褐色而枯死，病株的莖桿及葉柄等木質(zhì)部導(dǎo)管也呈現(xiàn)褐色。目前，雖然我國(guó)的棉花抗病育種工作已取得了巨大進(jìn)步，枯萎病也基本得到控制，但是所得到的品種整體上對(duì)黃萎病

14、的抗性較差。據(jù)調(diào)查，一些區(qū)縣的不少棉田由于該病危害猖獗，一般減產(chǎn)10%30%，發(fā)生嚴(yán)重的地塊減產(chǎn)可達(dá)80%以上，甚至絕收，對(duì)棉花產(chǎn)量造成了巨大損失和威脅。由于這種病原菌可以通過(guò)種子、土壤、水流和病殘?bào)w傳播，因此傳播速度極快；同時(shí)，又因病原菌可以在土壤中常年存活，能夠在棉花的各個(gè)生育期發(fā)病，故防治很困難。為了減少全球因棉花黃萎病菌所造成的經(jīng)濟(jì)損失，篩選抗黃萎病菌品種是防治黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一，而抗棉花黃萎病品種鑒定、篩選和相關(guān)研究需要分離和培養(yǎng)黃萎病菌，本研究?jī)?nèi)容為國(guó)家自然基金項(xiàng)目“陸地棉抗源抗落葉型黃萎病及相關(guān)抗病性應(yīng)答的分子機(jī)理研究”的部分內(nèi)容，為研究陸地棉抗黃萎病基因表達(dá)譜，篩選研究

15、差異表達(dá)基因，分析研究相關(guān)抗病應(yīng)答的分子機(jī)制提供黃萎病菌菌液。第一章 棉花黃萎病菌概述第一節(jié) 棉花黃萎病菌的形態(tài)特征棉花是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物，而棉花黃萎病是影響我國(guó)棉花產(chǎn)量與品質(zhì)的主要病害之一，是由大麗輪枝菌引起的一種危害性極大的維管束系統(tǒng)病害，它通過(guò)病原菌堵塞導(dǎo)管、產(chǎn)生毒素等多種形式危害棉株。由棉花黃萎病菌引起的棉花黃萎病害，近年來(lái)在我國(guó)南北棉區(qū)持續(xù)爆發(fā)危害，成為發(fā)展棉花生產(chǎn)的主要障礙。黃萎病在世界各棉花產(chǎn)區(qū)均有分布并且防治極為困難，危害棉花的輪枝菌有五個(gè)種，其中對(duì)棉花危害最為嚴(yán)重的是大麗輪枝菌和黑白輪枝菌1。張緒振2曾研究來(lái)自8個(gè)省區(qū)的棉花黃萎病菌的23個(gè)單孢菌系，經(jīng)對(duì)菌落及休眠結(jié)構(gòu)的觀察和

16、不同溫度影響研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)主要棉區(qū)黃萎病菌均屬大麗輪枝菌。大麗輪枝菌是一種世界性分布，且寄主范圍很廣的植物病原真菌，已報(bào)道可引起 660 種植物的黃萎病3。棉花黃萎病菌的菌絲體白色，分生孢子梗直立，長(zhǎng)110130um，呈輪狀分枝，每輪有34個(gè)分枝，分枝大小為13.721.4×2.39.1(um)，在輪枝頂端或頂枝著生分生孢子，分生孢子無(wú)色，呈長(zhǎng)卵圓形，單胞無(wú)色，大小為2.39.1×1.53.0(um)。孢壁增厚形成了黑褐色的厚垣孢子，許多厚壁細(xì)胞結(jié)合成近球形的微菌核，大小在3050um之間。棉花黃萎病菌屬于真菌中的霉菌。一般的霉菌菌落由菌絲體和孢子組成，其菌落比細(xì)菌和放線菌

17、大，有的甚至布滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，菌落較疏松呈絨毛或絮狀；因霉菌的基內(nèi)菌絲在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，故其菌落不易被接種針挑起；因霉菌孢子帶有各種顏色，使其菌落表面也呈現(xiàn)黃、綠、青、橙、黑等顏色4。而棉花黃萎病菌的菌落也因?yàn)槠洫?dú)特的微菌核，使菌落顯黑色。第二節(jié) 棉花黃萎病發(fā)病癥狀1、發(fā)病條件 (1)黃萎病發(fā)病的最適溫度為2225，高于30時(shí)，發(fā)病緩慢，35以上時(shí)，癥狀暫時(shí)隱蔽。在六月份，棉苗出現(xiàn)4、5片真葉時(shí)開(kāi)始發(fā)病，田間出現(xiàn)零星病株；現(xiàn)蕾期進(jìn)入發(fā)病適宜階段，病情迅速的發(fā)展；在七八月份，花齡期達(dá)到高峰；(2)棉花的品種不同，對(duì)黃萎病的抗性也不同；(3)棉花生育期不同，抗病能力也不同，棉花從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)進(jìn)入生殖生

18、長(zhǎng)時(shí)，抗病性開(kāi)始下降，黃萎病的發(fā)生率逐漸加重；(4)耕作栽培條件不同，黃萎病發(fā)生率也不同。棉田連作時(shí)，土壤中病菌數(shù)量累積愈多，病害愈重；水愈大，病害傳播愈快；同時(shí)營(yíng)養(yǎng)失調(diào)也是促成寄主感病的誘因，氮、磷是棉花不可缺少的營(yíng)養(yǎng)，但偏施或重施氮肥，反而能助長(zhǎng)黃萎病的發(fā)生5。2、棉花黃萎病不同發(fā)病期癥狀 棉花黃萎病能在棉花整個(gè)生長(zhǎng)期間侵染危害。一般在播種1個(gè)月以后出現(xiàn)黃萎病株，由于受棉花品種抗病性、病原菌致病力及環(huán)境條件的影響，黃萎病在棉花生長(zhǎng)的不同階段呈現(xiàn)不同癥狀類型6。 (1) 幼苗期。一是病葉邊緣退綠發(fā)軟，呈失水狀，葉脈間出現(xiàn)不規(guī)則淡黃色病斑，病斑逐漸擴(kuò)大，變褐色干枯，維管束明顯變色。二是有些病株

19、在苗期不明顯，外觀看上去正常，但切開(kāi)棉花橫截面，部分木質(zhì)部和維管束已變成暗褐色。 (2) 成株期。黃萎病在現(xiàn)蕾期后才逐漸發(fā)病，一般在六月下旬，黃萎病病株逐漸增多，到七八月份開(kāi)花結(jié)齡期發(fā)病達(dá)到最高峰。近年來(lái)，其癥狀呈多樣化的趨勢(shì)，常見(jiàn)癥狀有：病株由下部葉片開(kāi)始逐步向上發(fā)展，葉脈間產(chǎn)生不規(guī)則淡黃色斑塊，但葉脈附近仍保持綠色，病葉邊緣向上卷曲；有時(shí)葉片、葉脈間出現(xiàn)紫紅色，失水萎蔫的不規(guī)則病斑，病斑逐漸擴(kuò)大，變成褐色枯斑甚至整個(gè)葉片枯焦，脫落成光稈；有時(shí)生長(zhǎng)在主干上或側(cè)枝上的葉片大量脫落枯焦后，在病株的莖部或落葉的葉腋里，可長(zhǎng)出許多贅芽和枝葉；在七八月份，棉花花齡期，在盛夏久旱遇暴雨或大水漫灌時(shí)，田間

20、有些病株常發(fā)生一些急性型黃萎病癥狀，先是棉葉呈水燙樣，繼而突然萎垂，逐漸脫落成光稈；有些黃萎病株黃化但植株不矮縮、結(jié)鈴少；有些黃萎病株變得矮小，幾乎不結(jié)鈴，甚至死亡。棉花黃萎病發(fā)病較晚，一般現(xiàn)蕾期開(kāi)始發(fā)病，花齡期為發(fā)病高峰。發(fā)病植株的維管束變色較淺，一般不會(huì)矮化枯死。植株感病時(shí)，多在中下部葉片最先表現(xiàn)癥狀，并逐漸向上發(fā)展，不會(huì)形成“頂枯癥”。發(fā)病初期葉片邊緣或主脈之間呈現(xiàn)淡黃色不規(guī)則斑塊，但葉脈不變黃，隨后病斑逐漸擴(kuò)大，并變成褐色而干枯。第3節(jié) 棉花黃萎病菌的傳播及防治方法1、傳播途徑 棉花黃萎病是危害棉株維管束的病害，黃萎病菌傳播途徑很多，主要有：(1)棉花種子傳病。這種現(xiàn)象已經(jīng)在生產(chǎn)實(shí)踐中

21、得到證實(shí)；(2)病株殘?bào)w傳播。棉田中的病株、病葉、病枝殘?bào)w直接落到地里或用以漚制堆肥，是造成再循環(huán)傳播黃萎病的重要途徑，有時(shí)當(dāng)年的病株落葉都會(huì)對(duì)當(dāng)年的新棉株、健康棉株造成侵染；(3)流水和農(nóng)業(yè)操作也是造成病害蔓延的原因；(4)帶菌土壤傳播。黃萎病菌在土壤中，能以腐殖質(zhì)為生或在病株殘?bào)w中休眠，因而在土壤中能存活長(zhǎng)達(dá)20-25年之久，連作棉田土壤中因不斷積累菌量，發(fā)病會(huì)更加嚴(yán)重。棉田一旦傳入黃萎病菌，若不及時(shí)采取措施，將以很快的速度蔓延、危害（特別是遇雨后）7。2、綜合治理目前對(duì)于棉花黃萎病菌的防治方法很多，主要包括以下方面8： (1)選抗病品種。這是防治黃萎病，提高棉花產(chǎn)量最為經(jīng)濟(jì)、有效的措施。

22、 (2)輪作倒茬。在棉田種植3-5年的田塊或病株較多的田塊，采取輪作方式?？梢砸远嗄攴N植禾本科作物的田塊輪換倒茬。 (3)加強(qiáng)棉田管理。清潔棉田，減少土壤菌源，及時(shí)清溝排水，降低棉田濕度，使其不利于病菌的滋生和侵染。平衡施肥，氮、磷、鉀合理配比使用，切忌過(guò)量使用氮肥，重施有機(jī)肥，側(cè)重施氮、鉀肥，以利棉株健壯生長(zhǎng)，增強(qiáng)自身的抗逆能力。如果在整個(gè)生長(zhǎng)期噴施黃腐酸鉀3-4次，可有效減少黃萎病的發(fā)病幾率。 (4)生物防治。放線菌對(duì)大麗輪枝菌有較強(qiáng)的抑制作用。細(xì)菌中芽孢桿菌屬和假單胞屬的某些種，能有效抑制大麗輪枝菌菌絲散發(fā)。木霉菌對(duì)大麗輪枝菌有較強(qiáng)拮抗作用，可用以改變土壤微生物區(qū)系進(jìn)而減輕發(fā)病9。(5)

23、保健栽培。減少辛硫酸、甲胺酸等有機(jī)酸農(nóng)藥用藥次數(shù)及濃度，防止棉株受藥害降低自身抗病力。不要偏施、過(guò)施氮肥，做好氮磷鉀配合試用，注意增施鉀肥，提高抗病力。改善棉田生態(tài)環(huán)境使棉田土溫較高，濕度不宜過(guò)大，忌大水漫灌，可減少發(fā)病。 第四節(jié) 研究目的及意義棉花黃萎病是危害棉花維管組織的一種真菌類病害，在全國(guó)棉區(qū)均有分布，它通過(guò)病原菌堵塞導(dǎo)管、產(chǎn)生毒素等形式危害棉株。在棉花生長(zhǎng)前期可造成死苗，中后期引起蕾鈴脫落，導(dǎo)致棉花產(chǎn)量、品質(zhì)嚴(yán)重下降。由于這種病的病原菌可以通過(guò)種子、土壤、水流和病殘?bào)w傳播，因此傳播速度極快；同時(shí)，又因棉花黃萎病菌形成的休眠結(jié)構(gòu)微菌核，可以在土壤中長(zhǎng)年存活，并成為病害侵染循環(huán)中最重要的

24、初侵染源10，故棉花黃萎病的防治很困難。國(guó)內(nèi)外的研究證實(shí)，棉花黃萎病的發(fā)生及危害損失與土壤中病原菌的初侵染源和繁殖體微菌核有極為密切的關(guān)系。棉花黃萎病菌主要以微菌核在土壤中越冬，也能在棉籽內(nèi)外、病殘?bào)w、帶菌棉籽殼、棉籽餅中越冬而引起侵染，帶病種子是遠(yuǎn)距離傳病和使病區(qū)迅速擴(kuò)大的重要途徑。因此，明確棉黃萎病菌在土壤中的分布、消長(zhǎng)、侵入等基本情況，對(duì)抗病育種工作及病害的預(yù)測(cè)和防治有重要意義。目前，化學(xué)防治不僅成本較高，而且效果較差，水旱輪作雖然可有效抑制棉花黃萎病的發(fā)生，但受自然條件或耕作制度的影響，這一技術(shù)很難得到普遍推廣11。多年的實(shí)踐證明，只有培育和推廣抗病品種才是目前在棉花生產(chǎn)上控制棉花黃萎

25、病危害最為經(jīng)濟(jì)有效的方法，篩選黃萎病抗原并研究其抗性遺傳規(guī)律，對(duì)抗病育種有著重要意義。而品種的篩選與鑒定及相關(guān)研究都需要分離和培養(yǎng)黃萎病菌種，由于黃萎病菌的生長(zhǎng)速度很慢，培養(yǎng)數(shù)日后才形成典型菌落，因此棉花黃病菌的大量培養(yǎng)還受到一定的限制。本研究為國(guó)家自然基金項(xiàng)目“陸地棉抗源抗落葉型黃萎病及相關(guān)抗病性應(yīng)答的分子機(jī)理研究”的部分內(nèi)容，首先從四川棉區(qū)（簡(jiǎn)陽(yáng)）分離純化具有中等致病力的黃萎病菌，然后進(jìn)行液體培養(yǎng)技術(shù)的研究，為研究陸地棉抗黃萎病基因表達(dá)譜，篩選研究差異表達(dá)基因，分析研究相關(guān)抗病應(yīng)答的分子機(jī)制提供黃萎病菌菌液。 第二章 棉花黃萎病菌的分離 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料1、 病菌分離材料來(lái)源四川簡(jiǎn)陽(yáng)棉花地

26、里采集的棉花耕作層土壤、棉花根際土壤2、 主要器材試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、接種針、酒精燈、移液槍、無(wú)菌槍頭、涂布棒、恒溫箱、電磁爐、鐵架臺(tái)、漏斗、無(wú)菌操作臺(tái)、電子稱、棉塞、試管框3、 培養(yǎng)基制備 培養(yǎng)基（Medium）是指由人工配制的、適合微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合營(yíng)養(yǎng)料。任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物生長(zhǎng)所需要的六大營(yíng)養(yǎng)要素，一般含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽（包括微量元素）以及維生素和水等，有的培養(yǎng)基還含有抗菌素、色素、激素和血清等。 培養(yǎng)基由于配制的原料不同、使用要求不同，因而貯存保管方面也稍有不同。一般培養(yǎng)基在受熱、吸潮后，易被細(xì)菌污染或分解變質(zhì)，因此一般培

27、養(yǎng)基必須防潮、避光、陰涼保存。制作培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)盡快配制并立即滅菌，否則就會(huì)雜菌叢生，并破壞其固有的成分和性質(zhì)。對(duì)一些需嚴(yán)格滅菌的培養(yǎng)基（如組織培養(yǎng)基），較長(zhǎng)時(shí)間的貯存，必須放在26的冰箱內(nèi)。由于液體培養(yǎng)基不易長(zhǎng)期保管，現(xiàn)在均改制成粉末。此外，為了滿足微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的要求，還必須控制培養(yǎng)基的pH。一般細(xì)菌、放線菌適于生長(zhǎng)在中性或微堿性的環(huán)境中，而酵母菌和霉菌則適于生長(zhǎng)在偏酸性的環(huán)境中。因此，在配制培養(yǎng)基時(shí)，須將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)在一定的范圍內(nèi)12。迄今為止，培養(yǎng)基的種類極其繁多、種類各異。根據(jù)培養(yǎng)基的化學(xué)成分可將培養(yǎng)基分為：天然培養(yǎng)基、組合培養(yǎng)基、半組合培養(yǎng)基；根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可將

28、培養(yǎng)基分為：液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、脫水培養(yǎng)基；根據(jù)培養(yǎng)基的作用可將培養(yǎng)基分為：選擇性培養(yǎng)基和鑒別性培養(yǎng)基13。PDA培養(yǎng)基的制備：PDA培養(yǎng)基是人們對(duì)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的簡(jiǎn)稱，即Potato Dextrose Agar （Medium），依次對(duì)應(yīng)馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂的英文。PDA是一種常用的培養(yǎng)基，適宜培養(yǎng)酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。按物理性狀劃分屬固體培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基成分劃分屬半合成培養(yǎng)基。1、配方:馬鈴薯200克,葡萄糖20克,瓊脂15克，自來(lái)水1000毫升 2、配制步驟(1)將馬鈴薯洗凈，去皮，切成大小約為1cm3的小塊，稱200g，放入1000mL水中煮20分鐘，用雙

29、層紗布過(guò)濾，取其液濾。（也可直接溶解馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)提取粉）(2)定容：加水補(bǔ)足至1000mL。(3)加入葡糖糖至全部溶化。(4)加瓊脂至全部溶化。(5)趁熱將一部分分裝在試管中（分裝試管方法：分裝前先準(zhǔn)備好鐵架臺(tái)和相應(yīng)的帶有橡膠管和夾子的漏斗，放在鐵架圈上，根據(jù)所要分裝的試管的長(zhǎng)度調(diào)整好漏斗的高度 將培養(yǎng)基倒在漏斗中，馬上就開(kāi)始分裝，培養(yǎng)基不能超過(guò)試管的1/5）。(6)加棉塞：分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。(7)包扎：將試管包扎成捆，在棉塞上方包一層牛皮紙（或報(bào)紙），用繩系好，貼上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基的名稱及配制日期。(8)滅菌：

30、將上述培養(yǎng)基以0.1Mpa，121，高壓蒸汽滅菌20min。(9)擺斜面和倒平板：制斜面培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)趁熱將試管有棉塞的一頭擱在一根長(zhǎng)木條上，斜度要適當(dāng)，斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管長(zhǎng)度的1/2，凝固后即成為斜面培養(yǎng)基。制平板培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)無(wú)菌操作，趁熱將培養(yǎng)基傾入滅菌培養(yǎng)皿中，使厚度在3mm左右，蓋上皿蓋，輕輕地?fù)u動(dòng)培養(yǎng)皿，使其布滿皿底，水平靜置，等凝固后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿。(10)無(wú)菌檢查：滅菌后的培養(yǎng)基放入28恒溫箱中，若24小時(shí)內(nèi)無(wú)菌生長(zhǎng)，即可使用。3、注意事項(xiàng)(1)培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在溫箱中培養(yǎng)24h，無(wú)菌生長(zhǎng)者方可使用。(2)PDA培養(yǎng)基一般不需要調(diào)節(jié)pH。對(duì)于要調(diào)節(jié)pH的培養(yǎng)基，一般用pH試紙或p

31、H計(jì)測(cè)其pH。如果培養(yǎng)基偏酸或偏堿，可用lmol/L的 NaOH或lmol/L的 HCL溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿破壞培養(yǎng)基成分。(3)培養(yǎng)基在使用時(shí)也可以做成不含瓊脂的液體培養(yǎng)基，用于菌類的振蕩培養(yǎng)。(4)倒培養(yǎng)基前加入適量的鏈霉素液搖勻，也可以加入氯霉素或土霉素，加入量為0.1g/L培養(yǎng)基，主要是為了抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，減少干擾14。四、乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液（觀察真菌）制備 1、配方：石炭酸50克，乳酸（比重1.21）50毫升，甘油100毫升，蒸餾水50毫升，棉藍(lán)0.1克2、制備步驟將石炭酸加在蒸餾水中加熱溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉藍(lán)，使其

32、溶解即成，即配成了250ml的乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液 (因?yàn)槭克岬人幤酚袕?qiáng)烈的腐蝕作用，所以在配種棉藍(lán)染液時(shí)要帶上一次性手套,而且實(shí)驗(yàn)室里面的石炭酸是固體狀態(tài)，使用前需要用東西將其粉碎，這樣可以加快其溶解速度) 。 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法1、 棉花黃萎病菌的分離(一)黃萎病菌的初步分離1、土樣制備。在四川簡(jiǎn)陽(yáng)的棉花地里，戴上滅菌手套，采用多點(diǎn)取樣法，用取土器對(duì)棉花地里的耕作層土壤（取土壤深度20cm內(nèi)）和根際土壤進(jìn)行取樣，取土后立刻將樣本放進(jìn)滅過(guò)菌的信封里面，密封好，并貼上相應(yīng)標(biāo)簽，以免實(shí)驗(yàn)時(shí)候出錯(cuò)。同時(shí)將采集來(lái)的土壤放在無(wú)菌操作臺(tái)中風(fēng)干，然后在研缽里面分別粉碎。表2.1土壤樣本編號(hào)編號(hào) 采集地點(diǎn)及

33、深度S1 耕作層土壤（樣本1）S2 耕作層土壤（樣本2）S3 根際土壤（樣本1）S4 根際土壤（樣本2）2、凡是實(shí)驗(yàn)中使用的器材，能滅菌處理的必須滅菌，如玻璃器皿（包括吸管、滴管、三角瓶、試管、培養(yǎng)皿等）、培養(yǎng)基、槍頭。金屬器材（如剪刀、鑷子、針頭等），凡能包裹的，應(yīng)先用紙包裹再滅菌。滅菌完，待蒸汽放完后將滅菌的這些器材放在干燥箱中。3、無(wú)菌操作臺(tái)的清潔：用酒精棉球?qū)⒉僮髋_(tái)內(nèi)部全部擦洗干凈，將試管架、酒精燈、標(biāo)簽、接種針、筆、火柴等實(shí)驗(yàn)用具放入操作臺(tái)內(nèi)。打開(kāi)操作臺(tái)的紫外燈，紫外線滅菌20分鐘。滅菌完后，關(guān)掉紫外燈同時(shí)打開(kāi)照明燈，保持操作臺(tái)的送風(fēng)機(jī)一直開(kāi)著，并且點(diǎn)燃酒精燈（注意事項(xiàng)：每次使用前都

34、要提前20分鐘打開(kāi)紫外燈，并啟動(dòng)送風(fēng)機(jī)；凈化區(qū)內(nèi)嚴(yán)禁放不必要的物品以保持潔凈的氣流不受干擾）。4、平板制備：左手持皿，用左手的拇指、食指及中指將皿蓋揭開(kāi)20度左右的角度（角度越小越好，以免空氣中的細(xì)菌進(jìn)入皿中將培養(yǎng)基污染）。右手將溶化后涼至50度左右的培養(yǎng)基加入抗菌素后倒在培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)基要適量，過(guò)多就浪費(fèi)，過(guò)少會(huì)影響涂布和真菌的生長(zhǎng)；培養(yǎng)基不要沾在了培養(yǎng)皿邊緣，以免造成細(xì)菌污染；培養(yǎng)基要倒平，以免涂布的時(shí)候弄破培養(yǎng)基，影響結(jié)果觀察），倒完后蓋上皿蓋，放在操作臺(tái)空的地方。5、制備土壤稀釋液。稱取各樣品土壤5g，分別放入45ml無(wú)菌水的三角瓶中（瓶中事先放入消毒過(guò)的玻璃球，以便土壤混合），振蕩1

35、0min，即為稀釋10-1的土壤懸液，并作好相應(yīng)標(biāo)記。6、在無(wú)菌操作臺(tái)上，取裝有9ml無(wú)菌水試管2支，用記號(hào)筆編上10-2、10-3。取用無(wú)菌吸管吸取已稀釋成10-1的1號(hào)土壤液1ml，注入這編號(hào)為10-2的試管中，并在試管內(nèi)輕輕吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10-2土壤稀釋液。同法從10-2中取1ml制備10-3土壤稀釋液。7、待培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基凝固后，開(kāi)始涂布。首先將涂布棒在酒精燈上燒灼，以殺死細(xì)菌；然后待涂布棒冷卻后，用移液槍吸取1ml的稀釋液涂布，如此重復(fù)將上面的幾個(gè)稀釋濃度都分別涂布，每一組做兩個(gè)相同平板，以觀察平均結(jié)果。8、涂布好所有濃度的土壤稀釋液后，在皿蓋上貼好相應(yīng)的標(biāo)簽。然后將

36、培養(yǎng)皿放在恒溫箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28。表2.2土壤稀釋液編號(hào)土壤 10-1 10-2 10-3 耕作層土壤（S1） S111 S112 S121 S122 S131 S132耕作層土壤（S2） S211 S212 S221 S222S231 S232根際土壤（S3） S311 S312 S321 S322 S331 S332根際土壤（S4） S411 S412S421 S422 S431 S4329、收拾干凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)，如果還有剩下的平板，可以將平板倒置放在保存箱中，但是放置時(shí)間最好不要超過(guò)兩天。 (二) 黃萎病菌的純化真菌的分離培養(yǎng)的目的是進(jìn)行真菌的菌種鑒定，幫助診斷。常用的方法有斜面培養(yǎng)

37、法、玻片培養(yǎng)和平板培養(yǎng)法三種。在本次實(shí)驗(yàn)中采用平板培養(yǎng)法對(duì)棉花黃萎病菌進(jìn)行分離、純化，平板法培養(yǎng)霉菌與分離細(xì)菌的方法不同，一般采用點(diǎn)植法。將上述長(zhǎng)出的比較規(guī)整且呈現(xiàn)單個(gè)菌落，菌落形態(tài)和顏色有差異的S111、S212、S311、S312、S421、S221平板上的菌落分別用接種針挑到加了鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上。在接種前，無(wú)菌操作臺(tái)跟前面一樣進(jìn)行清潔和殺菌處理，接種針在酒精燈上加熱燒紅，挑取菌落前注意接種針要冷卻，不然會(huì)燙死真菌。左手拿起平板底，使培養(yǎng)基朝下，右手持接種針挑取菌落邊緣的單菌絲，點(diǎn)種在培養(yǎng)基中心點(diǎn)或成三角形的三分點(diǎn)（接種過(guò)程中最好不要刺破培養(yǎng)基，同時(shí)避免孢子散落在培養(yǎng)基上，使菌落生長(zhǎng)

38、一個(gè)或三個(gè)扇形的典型菌落，便于觀察）。然后蓋上平皿蓋，貼上接種菌絲的來(lái)源，始終保持平板底朝上，在恒溫箱中倒置培養(yǎng)4-5天。過(guò)后再觀察培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌落形態(tài)是否一樣，并根據(jù)棉花黃萎病菌的菌落特征從中挑選出純化的棉花黃萎病菌。二、棉花黃萎病菌的鑒定及形態(tài)觀察區(qū)分和識(shí)別各類微生物可從菌落形態(tài)（群體形態(tài))和細(xì)胞形態(tài)（個(gè)體形態(tài)）兩方面進(jìn)行，菌落形態(tài)是無(wú)數(shù)細(xì)胞形態(tài)的集中反映，因此，每一大類微生物都有其一定的菌落特征，可通過(guò)這些特征差異區(qū)分和識(shí)別。一般根據(jù)長(zhǎng)出的菌落顏色、粗糙程度、孢子、菌絲等的特征對(duì)棉花黃萎病菌進(jìn)行生理、生化鑒定。由于棉花黃萎病菌屬大麗輪枝菌，其微菌核是大麗輪枝菌在土壤中的主要存活結(jié)構(gòu)，而

39、微菌核也正是鑒定棉花黃萎病菌的一個(gè)重要特征。將S312、S421菌落菌絲接種到水瓊脂培養(yǎng)皿上培養(yǎng)（用水瓊脂培養(yǎng)真菌，有利于單個(gè)菌絲的形成），然后從中挑取單個(gè)菌絲，再對(duì)其菌絲、孢子等在顯微鏡下面觀察，結(jié)合SMITH15通過(guò)顯微鏡觀察的大麗輪枝菌分生孢子梗較細(xì)、數(shù)量少、完全透明；分生孢子較小,富含黑色的微菌核；寄主范圍廣等形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，最終確定棉花黃萎病菌。對(duì)于棉花黃萎病菌的形態(tài)觀察，本次實(shí)驗(yàn)采用的直接觀察法。制片時(shí)常用乳酸石炭酸染液，它一方面可以殺菌防腐，保持細(xì)胞不變形，另一方面有染色作用。操作步驟如下：1、在載玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)染液，用解剖針從棉花黃萎病菌菌落邊緣挑取少量已產(chǎn)孢子的棉花

40、黃萎病菌菌絲，再放在載玻片上的染液中。用解剖針小心地將菌絲分散開(kāi)，蓋上蓋玻片。 2、將載玻片置低倍鏡下觀察，當(dāng)尋找到清晰的圖像時(shí)，換高倍鏡對(duì)棉花黃萎病菌的菌絲和孢子進(jìn)行仔細(xì)觀察。三、棉花黃萎病菌的保藏將前面鑒定出的純化的棉花黃萎病菌S312，放在無(wú)菌操作臺(tái)上備用。具體的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：1、清潔好無(wú)菌操作臺(tái)并點(diǎn)燃酒精燈，用75%的酒精清潔手。2、接種針垂直插入酒精火焰中燒紅，再橫過(guò)火焰3次，然后左手持皿，用左手的拇指、食指及中指將皿蓋揭開(kāi)20度左右的角度，右手把接種針?lè)旁诿笊w上停留片刻待其冷卻。3、將接種針伸進(jìn)培養(yǎng)皿挑取S312菌落邊緣的菌絲（可以帶上一些培養(yǎng)基），挑取好就蓋好皿蓋。4、將保藏

41、菌種的斜面試管，挾于左手的拇指與其他四指之間，用右手的無(wú)名指與小指和手掌邊拔出棉塞并挾住。5、將帶有棉花黃萎病菌菌絲的接種針伸進(jìn)試管中接種到試管培養(yǎng)基上。6、取出接種針，試管口和棉塞進(jìn)行火焰滅菌，重新塞上棉塞。7、燒死接種針上的殘余菌，把試管和接種工具放到試管框中。8、在斜面管口寫(xiě)明菌種名稱、日期，置28恒溫培養(yǎng)。9、此種接種到斜面試管的方法是作為對(duì)已分離純化的棉花黃萎病菌的保存，以備下一次使用。但是如果保藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使用前還需要對(duì)再一次純化，以防保藏過(guò)程中雜菌的污染。第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析一、 初分離結(jié)果每天都對(duì)實(shí)驗(yàn)室里的真菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，由于真菌的生長(zhǎng)速度比較慢，所以在培養(yǎng)上比細(xì)菌的培

42、養(yǎng)時(shí)間要長(zhǎng)。最后觀察到培養(yǎng)結(jié)果為：稀釋度為10-2和10-3的平板長(zhǎng)出的真菌菌落很少，只有濃度為10-1平板長(zhǎng)出了各種菌落。菌落特點(diǎn)為：外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)絨毛狀或棉絮狀，從菌落顏色看有黑色、青色和灰色幾種。根據(jù)菌落顏色和形態(tài)，初步斷定分離出了青霉、曲霉和棉花黃萎病菌。表2.3第一次純化菌株編號(hào)編號(hào) 菌株來(lái)源 稀釋度 菌落顏色S111 耕作層土壤（樣本1） 10-1 綠色S212 耕作層土壤（樣本2） 10-1 黑灰色S221 耕作層土壤（樣本2） 10-2 灰色 S311 根際土壤（樣本1） 10-1 黑色（而且菌絲很發(fā)達(dá)）S312根際土壤（樣本1） 10-1 黑色S421 根際土壤（樣本

43、2） 10-2 黑色二、 純化結(jié)果通過(guò)對(duì)S111、S212、S311、S312、S421、S221這幾個(gè)菌落的再一次分離純化，以及將分離前后長(zhǎng)出的菌落形態(tài)、顏色進(jìn)行對(duì)比，最終分離出幾種純化的真菌。表2.4第二次純化菌株編號(hào)編號(hào) 編號(hào)來(lái)源 菌株來(lái)源 菌落顏色B1 S111 耕作層土壤（樣本1） 綠色B2 S221 耕作層土壤（樣本2） 灰色B3 S312 根際土壤（樣本1） 黑色B4 S421 根際土壤（樣本2） 黑色根據(jù)棉花黃萎病菌獨(dú)特的微菌核結(jié)構(gòu)（是菌落呈現(xiàn)黑色），而且具有菌絲孢子等，從第二次純化的菌株來(lái)看，只有B3、B4的菌落顏色、特征等比較像棉花黃萎病菌。圖2.1分離的棉花黃萎病菌菌落形

44、態(tài)圖三、鑒定結(jié)果通過(guò)在顯微鏡下對(duì)分離純化的棉花黃萎病菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，從其明顯的微菌核和無(wú)色、長(zhǎng)卵圓形的分生孢子以及菌絲形態(tài)與V991和D07038棉花黃萎病菌形態(tài)進(jìn)行對(duì)比，確定出只有S312是棉花黃萎病菌。S312是從根際土壤中分離出來(lái)，稀釋濃度為10-2。（圖2.2圖2.4） 圖2.2棉花黃萎菌形態(tài)（物鏡4倍）圖2.3棉花黃萎菌形態(tài)（物鏡10倍）圖2.4棉花黃萎菌形態(tài)（物鏡40倍）四、保藏結(jié)果圖2.5棉花黃萎菌試管培養(yǎng)(菌種保存) 第三章 棉花黃萎病菌的培養(yǎng)第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料一、 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分離而來(lái)的棉花黃萎病菌；來(lái)源于中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所的致病力強(qiáng)的V991；來(lái)源于中國(guó)農(nóng)科

45、院棉花研究所的中等致病力的D07038。二、 主要器材試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、接種針、酒精燈、移液槍、無(wú)菌槍頭、涂布棒、無(wú)菌操作臺(tái)、電子稱、棉塞、試管框、HZP-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱。三、 培養(yǎng)基制備 真菌在靜止條件下培養(yǎng)時(shí)，會(huì)在其周圍形成透過(guò)養(yǎng)分的障壁，因此養(yǎng)分的攝入會(huì)受到很大的阻礙。但是，液體培養(yǎng)基具有進(jìn)行通氣培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。振蕩培養(yǎng)可消除這種阻礙以及增加供氧量，所以有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和提高真菌繁殖數(shù)。本次研究也正是抓住了液體培養(yǎng)的這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，所以對(duì)棉花黃萎病菌進(jìn)行液體培養(yǎng)。（一）馬丁氏培養(yǎng)基制備1、配方:葡萄糖10克，蛋白胨5克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，1%孟加拉

46、紅3.3毫升2、制備步驟 (1)在電子稱上分別用小燒杯稱好葡萄糖、蛋白胨、 磷酸二氫鉀、 硫酸鎂。再將上述藥品加適量無(wú)菌水溶化，然后再將上述溶液依次倒在量程為1000ml的量筒中，此培養(yǎng)液1000ml加1%孟加拉紅水溶液3.3ml，定容至1000ml。(2)將配好的馬丁氏液體培養(yǎng)基分裝在量程為250ml的錐形瓶中，但是分裝量一般在100ml左右就可以了（避免振蕩培養(yǎng)時(shí)液體培養(yǎng)基外濺）。(3)滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.1Mpa，121，高壓蒸汽滅菌20min。（二）察氏培養(yǎng)基制備1、配方：硝酸鈉2克，磷酸二氫鉀1克，氯化鉀1克，硫酸鎂1克，七水硫酸鐵0.02克，蔗糖30克，水1000毫升2、制備步

47、驟(1)在電子稱上分別用小燒杯稱好硝酸鈉、磷酸二氫鉀、 氯化鉀、硫酸鎂、七水硫酸鐵、蔗糖。再將上述藥品加適量無(wú)菌水溶化，然后再將上述溶液依次倒在量程為1000ml的量筒中，定容至1000ml。(2)將配好的察氏液體培養(yǎng)基分裝在量程為250ml的錐形瓶中，分裝量一般在100ml左右。(3)滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.1Mpa，121，高壓蒸汽滅菌20min。 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法 一、棉花黃萎病菌的培養(yǎng)方法1、將滅菌好的馬丁氏液體培養(yǎng)基、察氏液體培養(yǎng)基和淘米水放在無(wú)菌操作臺(tái)自然冷卻。2、待培養(yǎng)基冷卻后，在無(wú)菌操作臺(tái)中分別挑取適量保存在試管中的棉花黃萎病菌（包括分離純化的棉花黃萎病菌、致病力強(qiáng)的V991、

48、中等致病力的D07038），由于真菌生長(zhǎng)速度較慢，因此需要多挑取一些棉花黃萎病菌。3、接種好棉花黃萎病菌后，用無(wú)菌膜將錐形瓶包扎好，放在HZP-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱中開(kāi)始振蕩培養(yǎng)，每天連續(xù)振蕩培養(yǎng)。注意每天觀察錐形瓶中棉花黃萎病菌的生長(zhǎng)狀況，記錄好每一種液體培養(yǎng)基中棉花黃萎病菌的生長(zhǎng)狀況。二、測(cè)棉花黃萎病菌生長(zhǎng)情況對(duì)測(cè)定繁殖數(shù)來(lái)說(shuō)，一定要一一計(jì)算各個(gè)體的數(shù)目。所以，計(jì)繁殖數(shù)只適宜于測(cè)定處于單細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌和酵母菌，而對(duì)放線菌和霉菌等絲狀生長(zhǎng)的微生物而言，則只能計(jì)算其孢子數(shù)。1、 直接法指用計(jì)數(shù)板（例如血球計(jì)數(shù)板）在光學(xué)顯微鏡下直接觀察細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法。此法十分常用，但得到的數(shù)目是包括死細(xì)

49、胞在內(nèi)的總菌數(shù)。為解決這一矛盾，已有用特殊染料做活菌染色后再用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)的方法，例如用美藍(lán)液對(duì)酵母菌染色后，其活細(xì)胞為無(wú)色，而死細(xì)胞則為藍(lán)色；細(xì)菌經(jīng)吖啶橙染色后，在紫外光顯微鏡下可觀察到活細(xì)胞發(fā)出橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)出綠色熒光，因而也可作活菌和總菌計(jì)數(shù)。2、 間接法間接法是一種活菌計(jì)數(shù)法。這是一種依據(jù)活菌在液體培養(yǎng)基中會(huì)使其變混或在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成菌落的原理而設(shè)計(jì)的。最常用的是利用固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成菌落的菌落計(jì)數(shù)法。一般有平板菌落計(jì)數(shù)法（此法最為常用，但操作較繁瑣且要求操作者計(jì)數(shù)熟練）和厭氧菌的菌落計(jì)數(shù)法（此法設(shè)備較復(fù)雜，計(jì)數(shù)難度很高）。測(cè)定各液體培養(yǎng)基中棉花黃萎病菌的生長(zhǎng)情況，既可以用直接計(jì)數(shù)的方法，也可以用間接計(jì)數(shù)的方法。在本次研究中使用了間接計(jì)數(shù)的方法，主要操作是：取出搖床上的馬丁氏、察氏、淘米水棉花黃萎病菌培養(yǎng)基，分別搖勻；在無(wú)菌操作臺(tái)上分別移取這三種液體培養(yǎng)基1ml到無(wú)菌試管中，并加上99ml的無(wú)菌水稀釋；用帶橡皮乳頭的1ml滅菌吸管反復(fù)吸吹50次，使棉花黃萎病菌的孢子充分散開(kāi)；將10-2 濃度的棉花黃萎病菌液體分別涂布兩個(gè)平板；將培養(yǎng)皿在28的恒溫箱中倒置培養(yǎng)。表3.1三種液體培養(yǎng)基稀釋編號(hào)液體培養(yǎng)基 S312 V991 D07038馬丁氏培養(yǎng)基 SM01 SM11 VM01 VM11DM01 DM11察氏培養(yǎng)基 SC01 SC