石蠟切片VS冰凍切片

1、石 蠟 切 片 VS 冰 凍 切 片石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué) 科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣 泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然后進(jìn)行切片的一種方法。制作過(guò)程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便，因而多應(yīng)用于手術(shù)中的快速 病理診斷。石蠟切片冷凍切片應(yīng)用對(duì)象廣泛應(yīng)用常規(guī)制片手術(shù)中的快速病理診斷保持時(shí)間持久保存保存時(shí)間較短優(yōu)點(diǎn)1、細(xì)胞定位準(zhǔn)確2、組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)保存完好3、保存時(shí)可放在室溫下保存1、簡(jiǎn)便。2、快速，用時(shí)短3、組織變化不大4、能很好的保存脂肪、類脂 等成分5、較好的保

2、存抗原活性及酶 類。缺點(diǎn)1、步驟繁多，制片中抗原活性有所降低1、不易做連續(xù)切片2、切取的組織不能過(guò)大實(shí)驗(yàn)步驟、石蠟切片1. ? 固定：將新鮮組織切成小塊， 固定于4%多聚甲醛過(guò)夜。凝固組織中的物質(zhì)成分， 盡可能保持其活體時(shí)的結(jié)構(gòu)。同時(shí)能使組織硬化，有利于切片的進(jìn)行。2. 脫水：為了減少組織材料的急劇收縮， 應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行經(jīng)70%、 85%、 95%直至純酒精（無(wú)水乙醇），每次時(shí)間為1 小時(shí)。固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀， 否則會(huì)影響后期的染色效果。3. 透明：常用的透明劑有二甲苯，二甲苯是石蠟的溶劑。純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的

3、溶劑，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在透明劑浸漬過(guò)程稱透明。 ?4. 浸蠟：先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1 小時(shí)。 先后移入 2 個(gè)熔化的石蠟液中浸漬1 小時(shí)左右。5. 包埋：以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于包埋盒內(nèi)上，然后置于速凍臺(tái)，讓石蠟固定。6. 切片：切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可將蠟塊至于冷水中改變蠟塊硬度。 通常切片厚度為3-5um， 用毛筆輕托輕放在37 度水浴中展片。7. 貼片與烤片：一般使用恒溫水浴鍋，溫度控制在37-40左右，有利于石蠟切片的展開(kāi)，貼好的切片置于60恒溫箱內(nèi)干燥2 小時(shí)，蛋白質(zhì)凝固后即可染色。8. 切片脫蠟及水化：

4、干燥后的切片置于二甲苯中進(jìn)行脫蠟， 然后依次使用從高濃度到低濃度遞減的順序進(jìn)行經(jīng)純酒精、95%、 85%、 70%進(jìn)行水化。9. 染色：經(jīng)典的蘇木精和伊紅：細(xì)胞核被蘇木精染成紫藍(lán)色，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)及非細(xì)胞成分被伊紅染成粉紅色。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單。免疫組化： 指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)。二、冰凍切片1. 取材：應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。2. 速凍：1）將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）。2）如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)。 ?3）當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v，此時(shí)

5、小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約 10-20s 組織即迅速冰結(jié)成塊。4）在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。5）若需要保存，應(yīng)快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80冰箱貯存?zhèn)?用。3. 固定：1）樣品托上涂一層OC飽埋膠，將速凍組織置于其上，4c冰箱預(yù)冷5-10min 讓OCT交浸透組織。2）取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。3）組織置于樣品托上，具上再添一層OCT交，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上 30min。4. 切片：1）恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)，其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi)，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5-10區(qū)m2）切片時(shí)，低溫室

6、內(nèi)溫度以- 15 ?- 20為宜，溫度過(guò)低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。5. 免疫熒光染色：1）冰凍切片室溫晾干15min,可用含10%E常山羊血清的PB旌溫封閉切片1 小時(shí)（此步可不洗）。 ?2）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個(gè)過(guò)程中不會(huì)使組織干涸）。3）將切片放在加了 PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時(shí)或4c過(guò)夜。4）第二天先將濕盒放到37c回溫1h,然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。5）滴加用PBSa釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37c孵育1小時(shí)?；厥斩?/p>

7、抗，切片置于染缸內(nèi)，PBSt 5minX3次。6）滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min （工作濃度舞色15min）。7）回收DAPI,滴加5-10抗熒光衰減封片劑或中性樹(shù)膠，用處理干凈的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。8）做好的切片放在切片盒內(nèi)，置于4 冰箱，可保存一周左右。常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案1. 切片上卷且不能形成連續(xù)蠟帶原因：切片刀不夠鋒利。切片刀與蠟快的角度不當(dāng)。蠟塊四周留蠟邊太少。石蠟硬度過(guò)大，黏度不夠。解決方法：重新磨刀。調(diào)整切片刀的角度?？芍匦掳窕?qū)⑾瀴K四周熔化，再放入包埋框中補(bǔ)蠟，修理蠟塊時(shí)組織塊周圍保留的石蠟以2mmfc右為宜。蠟塊過(guò)硬可適當(dāng)加

8、些蜂蠟，或更換熔點(diǎn)較低的石蠟重新包埋。2. 切片彎曲且不能形成直帶原因：蠟塊上下或左右兩邊不平行。蠟塊與切片刀刀口不平行。組織塊外形不整齊。切片刀各處的鋒利程度不一致。解決方法：將蠟塊四邊反復(fù)修平對(duì)稱。調(diào)節(jié)蠟塊夾持器，使其與切片刀平行。修整組織塊時(shí)，注意修切整齊。移動(dòng)切片刀，更換刀口位置。3. 切片上出現(xiàn)裂紋原因： 切片刀上有小缺口， 或刀口不平整。 組織中可能含有較硬之物質(zhì)，如固定液之結(jié)晶石灰質(zhì)。包埋時(shí)石蠟凍結(jié)太慢。解決方法：切片刀某處有缺口，可調(diào)換刀口部位或重新磨刀。刀口上缺口過(guò)多且不平整， 可先將刀鋒垂直在磨刀石上輕輕磨數(shù)次， 然后按常規(guī)磨刀田。組織中硬性物質(zhì)太多，則不宜用。糾正包埋時(shí)的

9、缺點(diǎn)。一般待蠟塊周圍凝結(jié)一層，即可放入冷水中。4. 切片粘在切片刀不易取下原因：切片時(shí)有靜電作用，產(chǎn)生靜電吸引，在冬季或氣候干燥時(shí)常出現(xiàn)這種情況。解決方法：可用加濕器。以增加空氣中的水分，而減少靜電作用。 ?5. 切片厚薄不均原因：切片微動(dòng)部分失靈，齒輪跳格。蠟塊太大，過(guò)硬，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)刀刃受 震動(dòng)。解決方法：修理切片機(jī)失靈的部分，調(diào)整螺旋。加機(jī)油潤(rùn)滑零件，必要時(shí) 需請(qǐng)專業(yè)技術(shù)人員調(diào)整切片機(jī)。 如蠟塊過(guò)大， 以后取材時(shí)注意取材的大小。蠟塊組織過(guò)硬，可返回水中浸泡，再重新脫水和包埋。6. 切片碎爛或組織脫出并與石蠟分離原因：組織脫水，透明不夠。浸蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng).浸蠟溫度過(guò)高。組織脫 出是由于脫水、透明時(shí)間不夠，或組織中含有乙醇等，石蠟不易滲入組織中.故導(dǎo)致石蠟與組織分離。二甲苯使用時(shí)間過(guò)久。解決方法：必須按組織大小厚薄選擇脫水、透明時(shí)間。依組織的性質(zhì)和 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)確定浸蠟時(shí)間.控制包埋溫度。一般這種情況難以補(bǔ)救。脫水， 透明滲蠟不夠，應(yīng)重新熔化，退回入二甲苯和酒精，再進(jìn)行滲蠟包埋。更 換二甲苯。7. 切片皺褶太多且不能完全展開(kāi)原因：石蠟太軟或室溫過(guò)高。切