基因重組及遺傳分析

1、第五章第五章 細(xì)菌基因重組及遺傳分析細(xì)菌基因重組及遺傳分析基因重組（基因重組（gene recombination）是指不同來源的）是指不同來源的遺傳物質(zhì)通過轉(zhuǎn)移和交換而重新組合的過程。高等遺傳物質(zhì)通過轉(zhuǎn)移和交換而重新組合的過程。高等動植物和許多動植物和許多產(chǎn)產(chǎn)生生有性孢子的真核微有性孢子的真核微生物生物的基因重的基因重組都是通過有性世組都是通過有性世代代來完成。來完成。在細(xì)菌中，提供部分遺傳在細(xì)菌中，提供部分遺傳物質(zhì)或少數(shù)基因的一方稱物質(zhì)或少數(shù)基因的一方稱為供體（為供體（donor），而獲得），而獲得基因的另一方稱為受體基因的另一方稱為受體（recipient）。）。第一節(jié)第一節(jié) 轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化

2、（Transformation）轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化：是指某一基因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基是指某一基因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型細(xì)胞的因型細(xì)胞的DNA而使受體的基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)而使受體的基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)化因子的證實對促進(jìn)現(xiàn)代分子生物象。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)化因子的證實對促進(jìn)現(xiàn)代分子生物學(xué)的誕生和發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動作用。學(xué)的誕生和發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動作用。 在實驗室條件下，通常用在實驗室條件下，通常用CaCl2、cAMP、低溫培、低溫培養(yǎng)養(yǎng)、PEG介導(dǎo)及電脈沖等方法轉(zhuǎn)介導(dǎo)及電脈沖等方法轉(zhuǎn)化化細(xì)細(xì)菌菌或其它微或其它微生物生物。細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過。

3、細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過程大體可分為三個階段：程大體可分為三個階段：感受態(tài)的出現(xiàn)感受態(tài)的出現(xiàn)DNA的吸附和進(jìn)入的吸附和進(jìn)入DNA的整合的整合1. 感受態(tài)的出現(xiàn)感受態(tài)的出現(xiàn) 感受態(tài)（感受態(tài)（competence）：）：是指受體是指受體菌菌細(xì)胞最容易接受外源細(xì)胞最容易接受外源DNA并使之不被并使之不被DNA酶降解的生理狀態(tài)。酶降解的生理狀態(tài)。一、轉(zhuǎn)化過程和機制一、轉(zhuǎn)化過程和機制 細(xì)菌細(xì)胞在特定時期產(chǎn)生一種稱為感受態(tài)因子的小分子蛋細(xì)菌細(xì)胞在特定時期產(chǎn)生一種稱為感受態(tài)因子的小分子蛋白（白（5-10 kD）。這種感受態(tài)因子可與細(xì)胞表面受體蛋白）。這種感受態(tài)因子可與細(xì)胞表面受體蛋白結(jié)合，使細(xì)胞產(chǎn)生感受態(tài)特異蛋白，其中

4、包括細(xì)胞壁自溶結(jié)合，使細(xì)胞產(chǎn)生感受態(tài)特異蛋白，其中包括細(xì)胞壁自溶素。自溶素使細(xì)胞表面的素。自溶素使細(xì)胞表面的DNA結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來，結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有與使其具有與DNA結(jié)合的活性。因此，當(dāng)細(xì)菌表面出現(xiàn)許多結(jié)合的活性。因此，當(dāng)細(xì)菌表面出現(xiàn)許多DNA結(jié)合位點時，就意味著細(xì)菌出現(xiàn)了感受態(tài)。結(jié)合位點時，就意味著細(xì)菌出現(xiàn)了感受態(tài)。 4. 進(jìn)入細(xì)胞的單鏈與進(jìn)入細(xì)胞的單鏈與寄主寄主DNA同源區(qū)重組同源區(qū)重組并整合到染色體上并整合到染色體上革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌1. 雙鏈雙鏈DNA片段在片段在DNA結(jié)合蛋白（黑結(jié)合蛋白（黑色點）的幫助下吸附到細(xì)胞表面并由色點）的幫助下吸附到細(xì)胞表面并

5、由核酸酶（紫色橢圓）切成缺口核酸酶（紫色橢圓）切成缺口2. 由核酸酶降解由核酸酶降解其中一條單鏈其中一條單鏈3. 未被降解的單鏈與未被降解的單鏈與感受態(tài)特異蛋白相互感受態(tài)特異蛋白相互作用并進(jìn)入細(xì)胞作用并進(jìn)入細(xì)胞2. DNA的吸附和進(jìn)入的吸附和進(jìn)入 在流感嗜血在流感嗜血菌菌中，其感受態(tài)細(xì)中，其感受態(tài)細(xì)胞形成一種結(jié)合雙鏈胞形成一種結(jié)合雙鏈DNA的的膜結(jié)構(gòu)，稱為轉(zhuǎn)化小體膜結(jié)構(gòu)，稱為轉(zhuǎn)化小體（transformasome）。該小體）。該小體吸附吸附DNA后，與細(xì)胞的內(nèi)外后，與細(xì)胞的內(nèi)外膜相融合而轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)側(cè)，再膜相融合而轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)側(cè)，再將雙鏈變成單鏈將雙鏈變成單鏈DNA。 轉(zhuǎn)化小體轉(zhuǎn)化小體雙鏈雙鏈DN

6、A被轉(zhuǎn)被轉(zhuǎn)化小體攝取化小體攝取轉(zhuǎn)化的雙鏈轉(zhuǎn)化的雙鏈DNA（30-50kb）結(jié)合）結(jié)合到膜受體上到膜受體上很快進(jìn)行同源重組很快進(jìn)行同源重組使外源使外源DNA整合到整合到染色體上染色體上革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌DNA在進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞在進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞之之前，要經(jīng)過可逆性吸附和不可逆性前，要經(jīng)過可逆性吸附和不可逆性吸附。吸附?？赡嫖降目赡嫖降腄NA對對DNA酶敏感，并可以洗脫下來。隨著感受酶敏感，并可以洗脫下來。隨著感受態(tài)細(xì)胞膜蛋白的參與，可逆性吸附逐步向不可逆吸附轉(zhuǎn)化，態(tài)細(xì)胞膜蛋白的參與，可逆性吸附逐步向不可逆吸附轉(zhuǎn)化，不可逆吸附不可逆吸附DNA對對DNA酶不敏感。酶不敏感。吸附到細(xì)胞表面是雙鏈

7、吸附到細(xì)胞表面是雙鏈DNA，而不是單鏈，而不是單鏈DNA實驗證明：實驗證明：肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化因子在肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化因子在100下逐漸失去轉(zhuǎn)化下逐漸失去轉(zhuǎn)化活性活性(DNA發(fā)生變性發(fā)生變性)。在逐漸冷卻過程中活性逐漸恢復(fù)在逐漸冷卻過程中活性逐漸恢復(fù)(單鏈單鏈DNA復(fù)性成雙鏈復(fù)性成雙鏈)。說明完整的說明完整的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)對于轉(zhuǎn)化活性來說是必要的，轉(zhuǎn)雙鏈結(jié)構(gòu)對于轉(zhuǎn)化活性來說是必要的，轉(zhuǎn)化的第一步，需要雙鏈化的第一步，需要雙鏈DNA才能結(jié)合到細(xì)胞表面的結(jié)合位才能結(jié)合到細(xì)胞表面的結(jié)合位點上。點上。當(dāng)當(dāng)DNA吸附后，被酶解開成單鏈吸附后，被酶解開成單鏈DNA，只有單鏈，只有單鏈DNA才才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與

8、受體染色體能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與受體染色體DNA進(jìn)行整合。進(jìn)行整合。 流感嗜血菌特異性攝取序列：流感嗜血菌特異性攝取序列： 5AAGTGCGGTCA 3淋病奈瑟球菌特異性攝取序列：淋病奈瑟球菌特異性攝取序列：5GCCGTCTCAA 3在流感嗜血菌的染色體上有在流感嗜血菌的染色體上有600個拷貝的攝取序列。攝取序個拷貝的攝取序列。攝取序列雖然只有列雖然只有10-12bp，但很少隨機地出現(xiàn)在其他物種的，但很少隨機地出現(xiàn)在其他物種的DNA序列中，因此這些細(xì)菌對外源序列中，因此這些細(xì)菌對外源DNA的吸收具有選擇性。的吸收具有選擇性。為什么有些細(xì)菌對攝取的為什么有些細(xì)菌對攝取的DNA有特異性要求呢？有特異性要

9、求呢？近年來的研究表明，近年來的研究表明，G-菌和菌和G菌對單鏈菌對單鏈DNA也能進(jìn)行有效也能進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化，但一般是在較低的轉(zhuǎn)化，但一般是在較低的pH值下進(jìn)行的。值下進(jìn)行的。外源外源DNA片段在受體細(xì)片段在受體細(xì)胞中的命運：外源胞中的命運：外源DNA（紅色）（紅色）轉(zhuǎn)化到受體細(xì)轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞后，通過同源重組整胞后，通過同源重組整合到染色體上，否則被合到染色體上，否則被降解成核苷酸。降解成核苷酸。 3. DNA的整合的整合 轉(zhuǎn)化為相同或相近物種之間的同源重組提供了可能性，是自然轉(zhuǎn)化為相同或相近物種之間的同源重組提供了可能性，是自然界中基因交換的一條重要途徑，在生物變異和進(jìn)化中起著重要界中基因交換

10、的一條重要途徑，在生物變異和進(jìn)化中起著重要作用。作用。轉(zhuǎn)化的效率決定于下列三個內(nèi)在因素：轉(zhuǎn)化的效率決定于下列三個內(nèi)在因素： 受體細(xì)胞的感受態(tài)，決定轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的感受態(tài)，決定轉(zhuǎn)化DNA能否進(jìn)入細(xì)胞能否進(jìn)入細(xì)胞 受體細(xì)胞的限制系統(tǒng)，決定轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的限制系統(tǒng)，決定轉(zhuǎn)化DNA在整合前是否被分解在整合前是否被分解 供體和受體供體和受體DNA的同源性，決定轉(zhuǎn)化的同源性，決定轉(zhuǎn)化DNA的整合。由于轉(zhuǎn)的整合。由于轉(zhuǎn)化化DNA總是與順序相同或相似的受體總是與順序相同或相似的受體DNA配合，所以親緣配合，所以親緣關(guān)系越近的其同源性也越強，轉(zhuǎn)化效率也越高。關(guān)系越近的其同源性也越強，轉(zhuǎn)化效率也越高。二、人工轉(zhuǎn)化二、

11、人工轉(zhuǎn)化 1. 通過二價陽離子處理，大腸桿菌等部分通過二價陽離子處理，大腸桿菌等部分G-細(xì)菌能產(chǎn)生細(xì)菌能產(chǎn)生感受態(tài)感受態(tài)2. 通過制備原生質(zhì)，大多數(shù)細(xì)菌特別是某些通過制備原生質(zhì)，大多數(shù)細(xì)菌特別是某些G+細(xì)菌細(xì)菌 已知許多細(xì)菌包括大腸桿菌均無自然轉(zhuǎn)化的能力，但經(jīng)已知許多細(xì)菌包括大腸桿菌均無自然轉(zhuǎn)化的能力，但經(jīng)人工誘導(dǎo)可使它們形成感受態(tài)。如：人工誘導(dǎo)可使它們形成感受態(tài)。如：1970年年Mandel和和Higa首先發(fā)現(xiàn)首先發(fā)現(xiàn)DNA在含有高濃度在含有高濃度Ca2+的條的條件下能夠被受體細(xì)胞攝入和轉(zhuǎn)化，隨后的實驗證明由件下能夠被受體細(xì)胞攝入和轉(zhuǎn)化，隨后的實驗證明由Ca2+誘導(dǎo)的人工轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中，其

12、轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的人工轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中，其轉(zhuǎn)化DNA必須是一種獨必須是一種獨立立DNA復(fù)制子。復(fù)制子。1. 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的轉(zhuǎn)化隨著研究技術(shù)的改進(jìn)和經(jīng)驗的積累，人們已經(jīng)建立了用隨著研究技術(shù)的改進(jìn)和經(jīng)驗的積累，人們已經(jīng)建立了用Ca2+、Mg2+等誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)程序，能對大腸桿菌菌株等誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)程序，能對大腸桿菌菌株C600、JMl01、JMl09、DH5a等進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。等進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。先將大腸桿菌培養(yǎng)至先將大腸桿菌培養(yǎng)至OD600=0.51接著用接著用50-100mmolL CaCl2處理制備成感受態(tài)細(xì)胞處理制備成感受態(tài)細(xì)胞然后將然后將DNA與感受態(tài)細(xì)胞混合與感受態(tài)細(xì)胞混合在冰浴中反應(yīng)

13、在冰浴中反應(yīng)20-40min進(jìn)行進(jìn)行42熱擊可增加熱擊可增加DNA的吸收（的吸收（107個轉(zhuǎn)化子個轉(zhuǎn)化子/ug質(zhì)粒質(zhì)粒DNA ）最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法是：最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法是：由于異源的質(zhì)粒由于異源的質(zhì)粒DNA分子能夠進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，所分子能夠進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，所以大腸桿菌攝取以大腸桿菌攝取DNA是非選擇性的。是非選擇性的。2. PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化不能自然形成感受態(tài)的不能自然形成感受態(tài)的G+細(xì)菌如枯草芽孢桿菌和放線菌，細(xì)菌如枯草芽孢桿菌和放線菌，可通過可通過聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG，一般用，一般用PEG 6000)的作用實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。的作用實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。這類細(xì)

14、菌必須首先用細(xì)胞壁降解酶完全除去它們的肽聚糖這類細(xì)菌必須首先用細(xì)胞壁降解酶完全除去它們的肽聚糖層，然后使其維持在等滲的培養(yǎng)基中，在層，然后使其維持在等滲的培養(yǎng)基中，在PEG存在下，質(zhì)存在下，質(zhì)粒或噬菌體?；蚴删wDNA可被高效地導(dǎo)入原生質(zhì)體?？杀桓咝У貙?dǎo)入原生質(zhì)體。3. 電脈沖法（電脈沖法（電穿孔法電穿孔法 ）在許多細(xì)菌和真核系統(tǒng)中，它們既無自然的感受態(tài)呈現(xiàn)也在許多細(xì)菌和真核系統(tǒng)中，它們既無自然的感受態(tài)呈現(xiàn)也不能用上述的方法建立感受態(tài)。因此人們發(fā)展了一種新的不能用上述的方法建立感受態(tài)。因此人們發(fā)展了一種新的將 核 酸 分 子 導(dǎo) 入 細(xì) 胞 的 方 法 ， 最 突 出 的 是將 核 酸 分 子

15、 導(dǎo) 入 細(xì) 胞 的 方 法 ， 最 突 出 的 是 電 穿 孔電 穿 孔(electroporation)法和基因槍法和基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化法。 電穿孔法：電穿孔法：是用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜或?qū)⒓?xì)胞膜擊是用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜或?qū)⒓?xì)胞膜擊成小孔，使各種大分子成小孔，使各種大分子(包括包括DNA)能通過這些小孔進(jìn)入細(xì)能通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞，所以又稱電轉(zhuǎn)化。胞，所以又稱電轉(zhuǎn)化。 電場強度、電脈沖的長度和電場強度、電脈沖的長度和DNA濃度濃度4. 基因槍基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 基因槍轉(zhuǎn)化法首先由基因槍轉(zhuǎn)化法首先由Sanford報道，該方法是將包裹有報道，該方法是

16、將包裹有DNA的鎢顆粒像子彈一樣用高壓射進(jìn)細(xì)胞并使的鎢顆粒像子彈一樣用高壓射進(jìn)細(xì)胞并使DNA留在細(xì)胞內(nèi)，留在細(xì)胞內(nèi)，特別是留在細(xì)胞器中。特別是留在細(xì)胞器中。用這種方法首次成功地將用這種方法首次成功地將DNA導(dǎo)入酵母線粒體并引起線粒體導(dǎo)入酵母線粒體并引起線粒體遺傳變化。基因槍轉(zhuǎn)化現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)化中遺傳變化?；驑屴D(zhuǎn)化現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)化中三、建立轉(zhuǎn)化方法的策略三、建立轉(zhuǎn)化方法的策略 1. 被轉(zhuǎn)化對象（轉(zhuǎn)化受體）被轉(zhuǎn)化對象（轉(zhuǎn)化受體）2. 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化DNA的構(gòu)建（目的）的構(gòu)建（目的）3. 轉(zhuǎn)化方法選擇轉(zhuǎn)化方法選擇四、轉(zhuǎn)化應(yīng)用四、轉(zhuǎn)化應(yīng)用 在轉(zhuǎn)化中，如果轉(zhuǎn)化因在轉(zhuǎn)化中，如果轉(zhuǎn)化因子

17、的兩個基因是連鎖的，子的兩個基因是連鎖的，那么它們可以同時被轉(zhuǎn)那么它們可以同時被轉(zhuǎn)化，也稱為共轉(zhuǎn)化，連化，也稱為共轉(zhuǎn)化，連鎖的兩個基因距離越近，鎖的兩個基因距離越近，其共轉(zhuǎn)化頻率越高，反其共轉(zhuǎn)化頻率越高，反之則低。利用共轉(zhuǎn)化率之則低。利用共轉(zhuǎn)化率和連鎖的二基因間的距和連鎖的二基因間的距離的反比關(guān)系可進(jìn)行基離的反比關(guān)系可進(jìn)行基因定位的工作。因定位的工作。1. 連鎖檢測連鎖檢測2. 遺傳圖譜的繪制遺傳圖譜的繪制trp2+his2+tyr1+（供體）（供體） trp2-his2-tyr1- （受體）的轉(zhuǎn)化類型（受體）的轉(zhuǎn)化類型trp2-his2重組率= 2600+107+3660+418 100%

18、= 34% 11940+1180+ 2600+107+3660+418 trp2-tyr1重組率= 2600+1180+3660+685 100% = 40% 11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重組率= 418+1180+685+107 100% = 13% 11940+3660+418+1180+685+107trp2 his2 tyr1 3413403. 基因中斷基因中斷4. 插入基因插入基因第二節(jié)第二節(jié) 接合作用（接合作用（conjugation） 接合作用：接合作用：是指在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞直接接觸后，質(zhì)粒從是指在供體細(xì)胞和受體細(xì)胞直接接觸后，質(zhì)

19、粒從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程，也稱細(xì)菌雜交供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程，也稱細(xì)菌雜交 。 一、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與證實一、接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與證實 Lederberg和和Tatum（1946年）建立了用大腸桿菌年）建立了用大腸桿菌K12的兩個的兩個營養(yǎng)缺陷型菌株在基本培養(yǎng)基上是否生長，來檢驗細(xì)菌雜交營養(yǎng)缺陷型菌株在基本培養(yǎng)基上是否生長，來檢驗細(xì)菌雜交或重組存在的方法。在此以前，沒有人證實細(xì)菌雜交現(xiàn)象?；蛑亟M存在的方法。在此以前，沒有人證實細(xì)菌雜交現(xiàn)象。細(xì)菌雜交有別于典型的有性雜交，故稱為細(xì)菌接合作用。細(xì)菌雜交有別于典型的有性雜交，故稱為細(xì)菌接合作用。A菌株菌株B菌株菌株混合培養(yǎng)后在基本培養(yǎng)基中出現(xiàn)

20、的原養(yǎng)型菌落是否是雜混合培養(yǎng)后在基本培養(yǎng)基中出現(xiàn)的原養(yǎng)型菌落是否是雜交的結(jié)果？交的結(jié)果？必須要排除下列幾種解釋：必須要排除下列幾種解釋：一是細(xì)菌細(xì)胞并沒有接合，而是交換了一是細(xì)菌細(xì)胞并沒有接合，而是交換了DNA(轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化作用)二是細(xì)胞并未接合，而是通過培養(yǎng)基交換了養(yǎng)料二是細(xì)胞并未接合，而是通過培養(yǎng)基交換了養(yǎng)料(互養(yǎng)互養(yǎng))三是細(xì)菌細(xì)胞并未接合而是親本發(fā)生了三是細(xì)菌細(xì)胞并未接合而是親本發(fā)生了回復(fù)突變回復(fù)突變當(dāng)時當(dāng)時Lederberg和和Tatum已已經(jīng)證明，當(dāng)把經(jīng)證明，當(dāng)把A菌株的培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)液經(jīng)過滅菌，再加入到液經(jīng)過滅菌，再加入到B菌菌株的培養(yǎng)液中，沒有原養(yǎng)型株的培養(yǎng)液中，沒有原養(yǎng)型菌落，

21、這說明上述實驗并非菌落，這說明上述實驗并非轉(zhuǎn)化的結(jié)果。轉(zhuǎn)化的結(jié)果。1950年，年，Davis通過他的通過他的U形形管 試 驗 進(jìn) 一 步 支 持 了管 試 驗 進(jìn) 一 步 支 持 了Lederberg和和Tatum的結(jié)論。的結(jié)論。1. 轉(zhuǎn)化作用的排除轉(zhuǎn)化作用的排除營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而生長的現(xiàn)象亦稱營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料而生長的現(xiàn)象亦稱為為互養(yǎng)互養(yǎng)。2. 互養(yǎng)的排除互養(yǎng)的排除在在A- B+ T1s和和A+ B- T1r的雜交中，將基因型的雜交中，將基因型A- B+ T1s和和A+ B- T1r兩種細(xì)菌在基本培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)，接觸較兩種細(xì)菌在基本培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)，接觸較短的

22、一段時間以后，噴上噬菌體短的一段時間以后，噴上噬菌體T1，把，把A- B+ T1s細(xì)菌細(xì)菌殺死。殺死。經(jīng)培養(yǎng)以后仍有原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)，這說明原養(yǎng)型菌落經(jīng)培養(yǎng)以后仍有原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)，這說明原養(yǎng)型菌落的出現(xiàn)并非由于互養(yǎng)。的出現(xiàn)并非由于互養(yǎng)。 因為大腸桿菌的突變率一般都因為大腸桿菌的突變率一般都10-8，若兩個基因同時，若兩個基因同時回復(fù)突變，則其可能性只有回復(fù)突變，則其可能性只有10-16（10-810-8），這），這種幾率在平板上是很難檢測到的，所以混合培養(yǎng)能出種幾率在平板上是很難檢測到的，所以混合培養(yǎng)能出現(xiàn)現(xiàn)10-510-6頻率的菌落一定是重組的結(jié)果。頻率的菌落一定是重組的結(jié)果。3. 回復(fù)突變的

23、排除回復(fù)突變的排除4. 遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移 正交實驗正交實驗（A）Strs（B）Strr用鏈霉素將用鏈霉素將A菌株殺死菌株殺死重組體的數(shù)目變化不大重組體的數(shù)目變化不大(A) Strr (B) Strs將將B菌株殺死菌株殺死一個重組體也沒有出現(xiàn)一個重組體也沒有出現(xiàn)反交實驗反交實驗（A）met- bio-（Strr或或Strs ）（B）thr- leu- thi-（Strs或或Strr）Hayse（1952）用正反雜交實驗證明，細(xì)菌重組的發(fā)生只）用正反雜交實驗證明，細(xì)菌重組的發(fā)生只是染色體單方向的轉(zhuǎn)移，而且染色體的轉(zhuǎn)移往往不完全。是染色體單方向的轉(zhuǎn)移，而且染色體的轉(zhuǎn)移往往不完全。

24、 把把A菌株認(rèn)為是菌株認(rèn)為是供體供體，而，而B菌株是菌株是受體受體A菌株作為遺傳物質(zhì)的供體，當(dāng)鏈霉素對它進(jìn)行滅活以菌株作為遺傳物質(zhì)的供體，當(dāng)鏈霉素對它進(jìn)行滅活以后，并未影響它傳遞遺傳物質(zhì)的能力。后，并未影響它傳遞遺傳物質(zhì)的能力。B菌株作為遺傳物質(zhì)的受體，一旦被鏈霉素殺死以后，菌株作為遺傳物質(zhì)的受體，一旦被鏈霉素殺死以后，必然不能出現(xiàn)重組體。必然不能出現(xiàn)重組體。供體菌株又稱為供體菌株又稱為雄性細(xì)胞雄性細(xì)胞，受體菌株又稱為，受體菌株又稱為雌性細(xì)胞雌性細(xì)胞StrrA突變型（不育變種）突變型（不育變種） 置冰箱置冰箱1年后供體的年后供體的A菌株菌株Strr B菌株菌株Strs可育的可育的StrsA菌株

25、菌株共培養(yǎng)，一起繁殖共培養(yǎng)，一起繁殖不能得到雜交子不能得到雜交子StrrA菌株菌株 B菌株菌株Strs恢復(fù)了恢復(fù)了StrrA突變型的可育性突變型的可育性5. F質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn) (Hayes) 大腸桿菌的供體或雄性細(xì)胞大腸桿菌的供體或雄性細(xì)胞(如如A菌株菌株)記為記為F+，帶有一，帶有一個性因子或個性因子或致育因子致育因子F (fertility factor)，而另一個不帶性，而另一個不帶性因子因子F的受體或雌性細(xì)胞的受體或雌性細(xì)胞(如如B菌株菌株)叫做叫做F-； 雜交雜交F+F-是可育的，雜交是可育的，雜交F-F-是不育的；是不育的； F因子可以傳遞，從因子可以傳遞，從F+到到F-細(xì)菌

26、，但必須通過細(xì)胞接觸細(xì)菌，但必須通過細(xì)胞接觸 F因子能夠自發(fā)喪失，一旦喪失就不能再恢復(fù)，除非從因子能夠自發(fā)喪失，一旦喪失就不能再恢復(fù)，除非從另一個另一個F+細(xì)胞再把它傳遞過來。細(xì)胞再把它傳遞過來。分析結(jié)果：分析結(jié)果：F因子是染色體外的一種遺傳結(jié)構(gòu)，也就是因子是染色體外的一種遺傳結(jié)構(gòu)，也就是質(zhì)粒質(zhì)粒(plasmid)。 F+是一種遺傳性狀是一種遺傳性狀F 因子的存在使細(xì)菌成為因子的存在使細(xì)菌成為F+F 因子的喪失使細(xì)菌成為因子的喪失使細(xì)菌成為F-F+ 細(xì)菌分裂仍得到細(xì)菌分裂仍得到F+細(xì)胞細(xì)胞二、二、F F質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞中的存在狀態(tài)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞中的存在狀態(tài) 1. F質(zhì)粒的遺傳結(jié)構(gòu)質(zhì)粒

27、的遺傳結(jié)構(gòu) F質(zhì)粒的基因組由三質(zhì)粒的基因組由三個主要區(qū)段組成：轉(zhuǎn)個主要區(qū)段組成：轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)制區(qū)、插入移區(qū)、復(fù)制區(qū)、插入?yún)^(qū)。區(qū)。長度為長度為33 kb，由，由23個基因組成，構(gòu)成一個個基因組成，構(gòu)成一個tra操縱子操縱子(tra operon)。tra ABCEFGHKLQUVW與性菌毛的形成有關(guān)與性菌毛的形成有關(guān)tra YZMIGD等與等與F因子的轉(zhuǎn)移有關(guān)因子的轉(zhuǎn)移有關(guān) traG、traN 影響雜交對的配對形成與否影響雜交對的配對形成與否 traI、traM 決定決定DNA轉(zhuǎn)移起始轉(zhuǎn)移起始 traI 編碼解旋酶編碼解旋酶I(helicase) traD 控制控制DNA轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移； traY、t

28、raZ 編碼的核酸內(nèi)切酶能在轉(zhuǎn)移起始區(qū)編碼的核酸內(nèi)切酶能在轉(zhuǎn)移起始區(qū) oriT上切開一個缺口。上切開一個缺口。（1）轉(zhuǎn)移區(qū)）轉(zhuǎn)移區(qū)(transfer region)復(fù)制區(qū)負(fù)責(zé)復(fù)制區(qū)負(fù)責(zé)F質(zhì)粒的自我復(fù)制質(zhì)粒的自我復(fù)制F質(zhì)粒自主復(fù)制區(qū)為質(zhì)粒自主復(fù)制區(qū)為oriV（Vegetative origin of replication），），在在oriV中包含有復(fù)制起點。中包含有復(fù)制起點。F質(zhì)粒的復(fù)制是按質(zhì)粒的復(fù)制是按型方式進(jìn)行復(fù)型方式進(jìn)行復(fù)制，它是一種嚴(yán)緊型質(zhì)粒。制，它是一種嚴(yán)緊型質(zhì)粒。F質(zhì)粒的拷貝數(shù)能被精確地控制，一個寄主細(xì)胞約有質(zhì)粒的拷貝數(shù)能被精確地控制，一個寄主細(xì)胞約有12個個F質(zhì)質(zhì)粒。粒。rep（

29、F replicative protein）編碼一組與編碼一組與F質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。inc（incompatibility）基因產(chǎn)物使細(xì)胞具有不相容性?；虍a(chǎn)物使細(xì)胞具有不相容性。（2）復(fù)制區(qū)（）復(fù)制區(qū)（replication region）F質(zhì)粒插入?yún)^(qū)包含質(zhì)粒插入?yún)^(qū)包含4個插入順序：個插入順序：2個個IS31個個IS21個個Tn1000（）它們與它們與F質(zhì)粒的整合、切除、易位有關(guān)質(zhì)粒的整合、切除、易位有關(guān) （3）插入?yún)^(qū)（）插入?yún)^(qū)（insertion region）2. F質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在形式質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在形式 根據(jù)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)有無根據(jù)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)有無F質(zhì)粒

30、及質(zhì)粒及F質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在狀質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)可將細(xì)胞分為態(tài)可將細(xì)胞分為4種類型：種類型：F-、F+、Hfr、F。F-：是細(xì)胞內(nèi)不含是細(xì)胞內(nèi)不含F(xiàn)質(zhì)粒；質(zhì)粒；F+：是細(xì)胞內(nèi)含有是細(xì)胞內(nèi)含有F質(zhì)粒且獨立染色體外；質(zhì)粒且獨立染色體外；Hfr菌株菌株(high frequency recombination strain)：高頻重組高頻重組菌株：菌株：是是F質(zhì)粒整合到宿主的染色體上，隨著宿主染色體質(zhì)粒整合到宿主的染色體上，隨著宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制；的復(fù)制而復(fù)制；F是指攜帶了宿主的一部分染色體的是指攜帶了宿主的一部分染色體的F質(zhì)粒。質(zhì)粒。 三、三、F質(zhì)粒與接合作用質(zhì)粒與接合作用 1. F+F-

31、雜交雜交有有F質(zhì)粒的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上質(zhì)粒的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上可以與可以與F-明顯區(qū)別。除了共明顯區(qū)別。除了共有的大量表面菌毛以外，有的大量表面菌毛以外，F(xiàn)+還有少量（通常在細(xì)胞對數(shù)還有少量（通常在細(xì)胞對數(shù)生長期中只有生長期中只有13根）性菌根）性菌毛。纖細(xì)的蛋白質(zhì)性菌毛有毛。纖細(xì)的蛋白質(zhì)性菌毛有的長數(shù)毫米，直徑約為的長數(shù)毫米，直徑約為8nm。性菌毛在細(xì)菌的接合過程。性菌毛在細(xì)菌的接合過程中起著十分重要的作用。中起著十分重要的作用。 2. HfrF-雜交雜交 Hfr菌株是怎樣形成的呢菌株是怎樣形成的呢? F質(zhì)粒有兩種方式整合到質(zhì)粒有兩種方式整合到染色體上：同源重組、質(zhì)染色體上：同源重組、質(zhì)粒和染色體共

32、有插入序列粒和染色體共有插入序列和轉(zhuǎn)座子。大腸桿菌染色和轉(zhuǎn)座子。大腸桿菌染色體基因組有體基因組有7個個IS1、13個個IS2及及6個個IS3；F質(zhì)粒有質(zhì)粒有1個個IS2和和2個個IS3。 3. FF-雜交雜交 F質(zhì)粒在脫離質(zhì)粒在脫離Hfr細(xì)胞的染色體時也會發(fā)生差錯，從而形成帶有細(xì)菌細(xì)胞的染色體時也會發(fā)生差錯，從而形成帶有細(xì)菌染色體基因的染色體基因的F質(zhì)粒。而質(zhì)粒。而F因子又可通過交換融合到細(xì)菌染色體的因子又可通過交換融合到細(xì)菌染色體的原來位置上，回復(fù)到原來的原來位置上，回復(fù)到原來的Hfr狀態(tài)。狀態(tài)。由于在由于在FF-接合使用接合使用中能專一性地向中能專一性地向F-轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移F質(zhì)粒攜帶的供體基因，

33、質(zhì)粒攜帶的供體基因，因而通過因而通過F因子的轉(zhuǎn)移因子的轉(zhuǎn)移而使受體菌改變其遺而使受體菌改變其遺傳性狀，這種現(xiàn)象也傳性狀，這種現(xiàn)象也被稱為被稱為F 因子轉(zhuǎn)導(dǎo)因子轉(zhuǎn)導(dǎo)。四、中斷雜交試驗和基因定位四、中斷雜交試驗和基因定位 中斷雜交：中斷雜交：就是將兩個菌株（例如就是將兩個菌株（例如Hfr a+ strsF- a strr）在培養(yǎng)液中進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，）在培養(yǎng)液中進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，把菌液放入組織搗碎器里攪拌以中斷雜交，經(jīng)過稀釋把菌液放入組織搗碎器里攪拌以中斷雜交，經(jīng)過稀釋接種到鑒別培養(yǎng)基上，待形成菌落后鑒定它們的基因接種到鑒別培養(yǎng)基上，待形成菌落后鑒定它們的基因型。型。

34、1957年年Wollman和和Jacob首次進(jìn)行首次進(jìn)行中斷雜交實驗：中斷雜交實驗：供體菌：供體菌：HfrH strs thr+ leu+ azis tons lac+ gal+受體菌：受體菌： F- strr thr leu- azir tonr lac- gal-0 azi ton lac gal F0 thr lac trp his thy arg str F2 8 27 45 61 69 73Peptide-induced transfer of Enterococcus faecalis plasmid pCF10. (A) Peptide pheromone cCF10 (tria

35、ngles) is expressed from the chromosome of both plasmid-containing donor cells and plasmid-free recipient cells. Inhibitor peptide (stars) is expressed from pCF10 and secreted into the medium to prevent pheromone from the donor cell from inducing itself, probably through competitive binding to the p

36、heromone binding protein PrgZ. (B) Pheromone from a nearby recipient cell is detected by PrgZ. PrgZ imports the peptide pheromone using the chromosomally encoded Opp (Oligopeptide permease) system. (C) Imported cCF10 induces expression of transfer genes, including the cellsurface adhesin PrgB. (D) P

37、rgB mediates aggregation of the donor and recipient cells. A mating channel is then formed and single-stranded pCF10 is transferred to the donor cell via a rolling circle mechanism. After pCF10 has established itself in the recipient cell, the inhibitor peptide and another mechanism of negative cont

38、rol, PrgY, is expressed to prevent self-induction by endogenous cCF10.第三節(jié)第三節(jié) 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo) (transduction) 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)：是利用噬菌體為媒介，將供體菌的部分：是利用噬菌體為媒介，將供體菌的部分DNA轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的現(xiàn)象。因為絕大多數(shù)細(xì)菌都有噬菌體，所到受體菌內(nèi)的現(xiàn)象。因為絕大多數(shù)細(xì)菌都有噬菌體，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)作用較普遍。另外，轉(zhuǎn)導(dǎo)以轉(zhuǎn)導(dǎo)作用較普遍。另外，轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA位于噬菌體蛋白外位于噬菌體蛋白外殼內(nèi)，不易被外界的殼內(nèi)，不易被外界的DNA水解酶所破壞，所以比較穩(wěn)定。水解酶所破壞，所以比較穩(wěn)定。 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)：局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)

39、：被轉(zhuǎn)導(dǎo)的被轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA片段僅僅是那些靠近染色片段僅僅是那些靠近染色 體上溶源化位點的基因體上溶源化位點的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：任何供體的染色體都可以轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞任何供體的染色體都可以轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞1952年年Lederberg和他的學(xué)生和他的學(xué)生Zinder把鼠傷寒沙門菌把鼠傷寒沙門菌的一個突變菌株的一個突變菌株LT22(trp-)和另一個突變菌株和另一個突變菌株LT2(his-)在基本培養(yǎng)基上進(jìn)行混合培養(yǎng)，結(jié)果在在基本培養(yǎng)基上進(jìn)行混合培養(yǎng)，結(jié)果在107細(xì)胞中得到細(xì)胞中得到大約大約100個原養(yǎng)型菌落。個原養(yǎng)型菌落。 一、轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)一、轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) LT2菌株菌株LT22

40、菌株菌株中間用濾板隔開中間用濾板隔開U形管實驗形管實驗 可過濾因子并不由于可過濾因子并不由于DNA酶的處理而失活；酶的處理而失活； 可過濾因子和從溶源性的可過濾因子和從溶源性的LT22菌株得來的噬菌體菌株得來的噬菌體(稱為稱為 P22)具有相同的大小和質(zhì)量；具有相同的大小和質(zhì)量； 可過濾因子加熱后失活，用抗可過濾因子加熱后失活，用抗P22血清處理后也失活；血清處理后也失活； 把把P22與與 LT2和和LT22菌株分別混合培養(yǎng)，在基本培養(yǎng)基菌株分別混合培養(yǎng)，在基本培養(yǎng)基上不出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。上不出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。結(jié)果證實了可過濾因子是溫和噬菌體結(jié)果證實了可過濾因子是溫和噬菌體P22。這就是最早發(fā)現(xiàn)。

41、這就是最早發(fā)現(xiàn)的的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。 通過一系列的實驗，證實可過濾因子具有下列一些特性：通過一系列的實驗，證實可過濾因子具有下列一些特性：轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有三個組成部分，即轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有三個組成部分，即供體、噬菌體和受體供體、噬菌體和受體。這種。這種導(dǎo)致基因重組的方式不同于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化需要供體導(dǎo)致基因重組的方式不同于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化需要供體DNA和受體和受體細(xì)胞接觸，而轉(zhuǎn)導(dǎo)則是以噬菌體為媒介將供體遺傳物質(zhì)傳給細(xì)胞接觸，而轉(zhuǎn)導(dǎo)則是以噬菌體為媒介將供體遺傳物質(zhì)傳給受體，無需受體，無需DNA和受體細(xì)胞接觸。和受體細(xì)胞接觸。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)，普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)又可分為，普遍性轉(zhuǎn)

42、導(dǎo)又可分為完全轉(zhuǎn)導(dǎo)和流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)完全轉(zhuǎn)導(dǎo)和流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)。二、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)二、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)1. 完全轉(zhuǎn)導(dǎo)完全轉(zhuǎn)導(dǎo)P1 供體供體 收集子代噬菌體收集子代噬菌體菌苔計數(shù)噬菌體菌苔計數(shù)噬菌體（完全培養(yǎng)基）（完全培養(yǎng)基）受體受體（缺陷型大腸桿菌）（缺陷型大腸桿菌）選出重組子選出重組子（轉(zhuǎn)導(dǎo)子）（轉(zhuǎn)導(dǎo)子）（基本培養(yǎng)基）（基本培養(yǎng)基）侵染侵染 裂解裂解 侵染侵染野生型野生型轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率= 轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù) 100% = 轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù) 100% 侵染受體的侵染受體的P1顆粒數(shù)顆粒數(shù) 噬菌斑數(shù)噬菌斑數(shù)+轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)子數(shù)2. 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)3. 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)在遺傳學(xué)和分子生物

43、學(xué)研究中的應(yīng)用 (1)共轉(zhuǎn)導(dǎo)：共轉(zhuǎn)導(dǎo)： 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要應(yīng)用之一是通過測定共轉(zhuǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要應(yīng)用之一是通過測定共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率進(jìn)行基因定位，所謂導(dǎo)的頻率進(jìn)行基因定位，所謂共轉(zhuǎn)導(dǎo)共轉(zhuǎn)導(dǎo)(cotransduction)是指是指兩個處在一個轉(zhuǎn)導(dǎo)片段上的基因一起整合進(jìn)受體染色體中。兩個處在一個轉(zhuǎn)導(dǎo)片段上的基因一起整合進(jìn)受體染色體中。 被共轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩個基因之間的距離不能超過轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體所能被共轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩個基因之間的距離不能超過轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體所能包裝的包裝的DNA長度，而且越是緊密連鎖的基因其共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率長度，而且越是緊密連鎖的基因其共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率也越高。也越高。F為共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率，為共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率，d 為基因間距離，為基因間距離

44、，L為轉(zhuǎn)導(dǎo)片段長度（這為轉(zhuǎn)導(dǎo)片段長度（這里指噬菌體基因組長度，用分鐘表示）里指噬菌體基因組長度，用分鐘表示）F = (1 d/L)3 d = L (13F)以以thr+leu+為供體，以為供體，以thr-leu-為受體的為受體的P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗中，得到中，得到1%的的thr+leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，計算轉(zhuǎn)導(dǎo)子，計算thr和和leu之間的遺傳之間的遺傳圖距。（圖距。（P1噬菌體基因組約為大腸桿菌染色體長度的噬菌體基因組約為大腸桿菌染色體長度的2.4%） d = 2.4 (130.01) = 2.4 (1-0.215) = 1.883 (2)三點雜交法：三點雜交法：P1噬菌體所進(jìn)行的共轉(zhuǎn)導(dǎo)

45、被廣泛應(yīng)用于大腸噬菌體所進(jìn)行的共轉(zhuǎn)導(dǎo)被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的基因定位中。桿菌的基因定位中。1955年年Lennox用用P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主大腸噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主大腸桿菌染色體，研究基因連鎖關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，桿菌染色體，研究基因連鎖關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，thr和和leu有時能、有有時能、有時不能與第三個基因時不能與第三個基因ara共轉(zhuǎn)導(dǎo)。共轉(zhuǎn)導(dǎo)。他用他用P1噬菌體感染供體噬菌體感染供體(thr+ leu+ ara+)，用所得到的噬菌，用所得到的噬菌體裂解液去感染受體菌體裂解液去感染受體菌(thr- leu- ara-)，得到的結(jié)果。，得到的結(jié)果。 實驗實驗1可知：可知：ara基因與基因與leu基因靠得較近，而與基因靠得

46、較近，而與thr基因相距較基因相距較遠(yuǎn)，排列順序應(yīng)是遠(yuǎn)，排列順序應(yīng)是thr-ara-leu或或thr-leu-ara。如果是前一種情況，則如果是前一種情況，則thr+ leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該大多數(shù)含有轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該大多數(shù)含有ara+基基因因；如果是后一種形式，則；如果是后一種形式，則thr+ leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該很少含有是轉(zhuǎn)導(dǎo)子應(yīng)該很少含有是ara+，或者根本沒有。，或者根本沒有。而由實驗而由實驗2可知，可知，thr+ leu+轉(zhuǎn)導(dǎo)子同時又是轉(zhuǎn)導(dǎo)子同時又是ara+的占的占85，所以，所以上述上述3個基因的排列順序是第個基因的排列順序是第1種。種。三、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)三、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specialized tr

47、ansduction) 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)：局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)：是指以噬菌體為媒介，只能將供體菌特定的是指以噬菌體為媒介，只能將供體菌特定的一個或幾個一個或幾個基因基因轉(zhuǎn)移到受體菌中的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。轉(zhuǎn)移到受體菌中的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。導(dǎo)致局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的一般都是溫和噬菌體，它們在供體菌染導(dǎo)致局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的一般都是溫和噬菌體，它們在供體菌染色體上具有特定的整合位點。在某些條件下，當(dāng)這種整合色體上具有特定的整合位點。在某些條件下，當(dāng)這種整合狀的原噬狀的原噬菌菌體脫離寄主染色體時，偶爾會將整合位點兩端體脫離寄主染色體時，偶爾會將整合位點兩端相鄰的相鄰的基因基因錯誤地切離下來，并組裝到噬菌體顆粒中。當(dāng)錯誤地切離下來，并組裝到噬菌體顆粒中

48、。當(dāng)這種噬菌體感染另一細(xì)菌時，就將原寄主的這種噬菌體感染另一細(xì)菌時，就將原寄主的基因基因轉(zhuǎn)移到另轉(zhuǎn)移到另一細(xì)菌中。一細(xì)菌中。1高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的原理高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的原理不正常環(huán)出形成不正常環(huán)出形成特殊性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒特殊性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒這種缺陷噬這種缺陷噬菌體菌體亦是轉(zhuǎn)導(dǎo)噬亦是轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體，菌體，它具有感染能力，能整它具有感染能力，能整合到寄主染色體相同的位點上形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。合到寄主染色體相同的位點上形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。所得轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率約所得轉(zhuǎn)導(dǎo)子的頻率約為為10-6，稱為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。，稱為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)攜當(dāng)攜帶帶有有g(shù)al基因的基因的缺陷噬菌體和正常的缺陷噬菌體和正常的噬菌體噬菌體在同一細(xì)胞時，正常在同一細(xì)胞時，正常噬菌

49、體整合到噬菌體整合到寄主寄主的染色體的染色體上后，上后，產(chǎn)產(chǎn)生生兩個雜合兩個雜合(細(xì)菌細(xì)菌/噬噬菌體菌體)att位點，位點，dgal缺陷噬菌體就可以整合到該位點上。缺陷噬菌體就可以整合到該位點上。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成子的形成雜基因子雜基因子重組性轉(zhuǎn)導(dǎo)重組性轉(zhuǎn)導(dǎo)再次整合導(dǎo)致再次整合導(dǎo)致溶源性轉(zhuǎn)導(dǎo)溶源性轉(zhuǎn)導(dǎo)正正常常噬菌體噬菌體幫幫助助dgal缺陷噬菌體整合和繁殖，因此被缺陷噬菌體整合和繁殖，因此被稱為稱為助手噬菌體（助手噬菌體（helper phage）。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)子不穩(wěn)定，。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)子不穩(wěn)定，因為原噬菌體很容易被誘導(dǎo)切離下來。因為原噬菌體很容易被誘導(dǎo)切離下來。在這種切離的裂解物中，有一半是正常

50、在這種切離的裂解物中，有一半是正常噬菌體，另一噬菌體，另一半為半為dgal缺陷噬菌體。如果用這種裂解物去轉(zhuǎn)導(dǎo)另一個缺陷噬菌體。如果用這種裂解物去轉(zhuǎn)導(dǎo)另一個Gal-菌株，其轉(zhuǎn)化頻率理論上可達(dá)菌株，其轉(zhuǎn)化頻率理論上可達(dá)50%，所以也稱之為，所以也稱之為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。CRISPR結(jié)構(gòu)及作用機理結(jié)構(gòu)及作用機理nCRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)為規(guī)律成簇間隔短回文重為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，是一類廣泛分布于細(xì)菌和古復(fù)，是一類廣泛分布于細(xì)菌和古菌 基 因 組 中 的 重 復(fù) 結(jié) 構(gòu)菌 基 因 組 中 的

51、重 復(fù) 結(jié) 構(gòu) 。CRISPR通過與一系列相關(guān)蛋白通過與一系列相關(guān)蛋白、前導(dǎo)序列一起，為原核生物提、前導(dǎo)序列一起，為原核生物提供對抗噬菌體等外源基因的獲得供對抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫能力性免疫能力。 這種結(jié)構(gòu)最早于這種結(jié)構(gòu)最早于19871987年在大腸桿菌年在大腸桿菌(Escherichia coli) K12的的iap基因側(cè)翼序列中被發(fā)現(xiàn)，后來，科學(xué)家利用這個基因側(cè)翼序列中被發(fā)現(xiàn)，后來，科學(xué)家利用這個小片段找到了一種操作簡單、可對多種生物的基因組進(jìn)行小片段找到了一種操作簡單、可對多種生物的基因組進(jìn)行遺傳改造的工具遺傳改造的工具CRISPRCas系統(tǒng)。系統(tǒng)。 后續(xù)的遺傳學(xué)試驗和生物化學(xué)試

52、驗也證實，這些后續(xù)的遺傳學(xué)試驗和生物化學(xué)試驗也證實，這些CRISPR序列與很多病毒或者質(zhì)粒的序列與很多病毒或者質(zhì)粒的DNA序列是互補的，序列是互補的，很有可能是生物體抵御病毒等外來人侵者的一套特異性防很有可能是生物體抵御病毒等外來人侵者的一套特異性防御機制，就像是另外一套適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)。御機制，就像是另外一套適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)n CRISPR系統(tǒng)由前導(dǎo)序列系統(tǒng)由前導(dǎo)序列（leader sequence，LS）、 CRISPR基因座以及一系列基因座以及一系列Cas （CRISPR-associated）蛋蛋白組成白組成。nLeader序列序列： Lead

53、er序列前導(dǎo)序列由序列前導(dǎo)序列由300500bp堿基組成，位于堿基組成，位于CRISPR的的5端，與第一個重復(fù)序列直接相連，是一段在物種內(nèi)相對端，與第一個重復(fù)序列直接相連，是一段在物種內(nèi)相對保守的保守的AT富集的區(qū)域。有研究表明前導(dǎo)序列是新插入序列的識別位點富集的區(qū)域。有研究表明前導(dǎo)序列是新插入序列的識別位點，也有研究指出，它能夠作為啟動子，啟動，也有研究指出，它能夠作為啟動子，啟動CRISPR基因座的轉(zhuǎn)錄基因座的轉(zhuǎn)錄。nCRISPR基因座基因座：CRISPR基因座由簡短穩(wěn)定的同向重復(fù)基因座由簡短穩(wěn)定的同向重復(fù)序列序列(direct repect，DR)和長度相近的非重復(fù)的間隔序列和長度相近的

54、非重復(fù)的間隔序列(spacer)間隔排列而成，稱為間隔排列而成，稱為R-S結(jié)構(gòu)。其中重復(fù)序列的片結(jié)構(gòu)。其中重復(fù)序列的片段長度在段長度在2148b，且含有，且含有57 bp的回文序列，通常能形的回文序列，通常能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，間隔序列的長度在成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，間隔序列的長度在2672 bp，可能，可能來源于噬菌體、質(zhì)粒等外源來源于噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA序列。序列。Cas基因基因：cas基因是存在于基因是存在于CRISPR位點附近的一系列基因，位點附近的一系列基因，cas基因基因簇通常由簇通常由410個保守基因組成，它表達(dá)出的個保守基因組成，它表達(dá)出的cas蛋白對蛋白對CRISPR防御防御機制的實現(xiàn)不可或缺。機制的實現(xiàn)不可或缺。cas基因根據(jù)其保守程度可分為核心基因根據(jù)其保守程度可分為核心cas基因、基因、亞型特異性亞型特異性cas基因和重復(fù)序列相關(guān)未知蛋白基因和重復(fù)序列相關(guān)未知蛋白(repeatassociated mysterious proteins，RAMP)組件基因。組件基因。 cas16基因廣泛存在于各種基因廣泛存在于各種CRISPR亞型中，故被稱為核心亞型中，故被稱為核心cas基因，其編碼蛋白的功能現(xiàn)已初步得到證實，例如，基因，其編碼蛋白的功能現(xiàn)已初步得到證實，例如，Casl和和Cas2蛋白蛋白在所有在所有CRISPR類