共聚焦顯微鏡簡(jiǎn)介及免疫熒光染色

1、共聚焦顯微鏡簡(jiǎn)介及免疫熒光染色共聚焦顯微鏡簡(jiǎn)介及免疫熒光染色 德國Leica激光掃描共聚焦顯微鏡SP5 II簡(jiǎn)介基本參數(shù)型號(hào)：德國Leica SP5 II激光器：4個(gè) 發(fā)射波長400nm-800nm物鏡：10倍 20倍 63倍通道：多通道 多色系統(tǒng)：windows 7LAS AF 活體細(xì)胞裝置：配有激光掃描共聚焦顯微鏡的基本特點(diǎn)l 觀察方式：以熒光為主l 光源：激光（紫外、可見光）l 照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描l 成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像l 輸出：實(shí)時(shí)觀測(cè)，數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行 圖像處理和定量分析l 多重染色樣品的觀察基本功能l多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像 采集光學(xué)顯微鏡分辨率：0

2、.25m共焦顯微鏡分辨率：0.18m基本功能l 定位、定量分析基本功能l 無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”l三維重構(gòu)成像 三維重構(gòu)成像基本功能l活體細(xì)胞熒光染色的動(dòng)態(tài)觀察及快速掃描成像 LAS AF軟件的基本界面 在生物醫(yī)學(xué)中的主要應(yīng)用（一）原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子、觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)1.細(xì)胞原位檢測(cè)核酸2.原位檢測(cè)蛋白質(zhì)、抗體及其他分子3.檢測(cè)細(xì)胞凋亡4.細(xì)胞器觀察及測(cè)定5.觀察細(xì)胞骨架6.檢測(cè)細(xì)胞融合7.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪（二）活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)1.細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化的測(cè)量2.膜電位的測(cè)量3.細(xì)胞內(nèi)PH值的測(cè)定4.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生5.檢測(cè)藥物等跨膜進(jìn)入組織

3、或細(xì)胞過程及其定位日常保養(yǎng)及注意事項(xiàng)按照手冊(cè)正確操作。如有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系 Leica Leica 工程師，尋求專業(yè)幫助。保證外部電源供應(yīng)穩(wěn)定。由于環(huán)境的變化會(huì)影響各部件的相對(duì)位等，無論工作與否請(qǐng)保持室內(nèi)恒溫，清潔，干燥。室溫 22-25 22-25 攝氏度，相對(duì)濕度80%80%以下為宜。使用一段時(shí)間后，精密器件可能會(huì)由于環(huán)境等因數(shù)引起偏移，為保證儀器正常使用，請(qǐng)與 Leica Leica 的專業(yè)工程師聯(lián)系，及時(shí)調(diào)較儀器。使用顯微鏡油鏡后請(qǐng)用無水乙醇清潔鏡頭前部。日常保養(yǎng)及注意事項(xiàng)短時(shí)間的停頓工作時(shí)，無需關(guān)閉系統(tǒng)。只是做一些分析圖片等工作時(shí)，無需打開激光器控制鑰匙，以減少激光器的損耗。請(qǐng)避免使用

4、外界存儲(chǔ)設(shè)備（U U盤，移動(dòng)硬盤等），以免電腦受病毒感染。請(qǐng)不要安裝包含殺毒軟件在內(nèi)的任何未經(jīng)軟件生產(chǎn)商授權(quán)和經(jīng)LeicaLeica工程師認(rèn)可的軟件。 熒光探針的選擇選擇熒光探針的主要步驟：1 1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定需要檢測(cè)的目標(biāo)；2 2、確定可供選擇的熒光探針的范圍；3 3、考察熒光探針的特性是否符合熒光樣品的制備 要求；4 4、熒光探針與所用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的匹配情況。樣品要求樣品經(jīng)熒光標(biāo)記組織切片在載玻片上，用蓋玻片封片固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)培養(yǎng)在共聚焦專用小培養(yǎng)皿或蓋玻片上懸浮細(xì)胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封片樣品要求載玻片厚度應(yīng)在0.81.2mm之間，蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在0.17mm

5、左右標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)盡量去除非特異性熒光信號(hào)封片劑多用甘油：PBS混合液（9：1)激光共聚焦適用的器皿及要求一、活細(xì)胞直接免疫熒光染色（溶酶體或鈣離子）（1）將A549細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)于35 mm 激光共聚焦 培養(yǎng)皿中間的圓形凹槽里；（2）染色前吸除培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液，用PBS洗2-3 次；（3）向培養(yǎng)皿中輕輕滴入Lyso-Tracker Red或 Fluo-4/AM工作液200L，使其覆蓋凹槽里 全部細(xì)胞；（4）37 、5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育30 min；（5）吸除染液，用PBS洗2-3次；（6）再用800L的PBS覆蓋凹槽里全部細(xì)

6、胞， 用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察Ca2+的變 化。 二、間接免疫熒光染色（FITCFITC標(biāo)記）（1）收集細(xì)胞 收集細(xì)胞爬片，吸取各培養(yǎng)孔上清，PBS沖洗（ 5min3），4%多聚甲醛固定20min，晾干后用。（2）通透及封閉 取出細(xì)胞爬片，貼于載玻片上，用PBS（5min3） 沖洗后，加入0.3% Triton X-100穿透細(xì)胞膜5min， PBS（5min3），加入2% BSA封閉抗原30min。（3）滴加一抗 滴加用PBS稀釋的一抗，濕盒內(nèi)4孵育過夜。每次 實(shí)驗(yàn)均作空對(duì)照白（PBS代替一抗）和同型對(duì)照（ 兔/鼠血清或IgG亞型代替一抗）。二、間接免疫熒光染色（FITCFITC標(biāo)記）（4

7、）滴加二抗 次日用PBS（5min3）沖洗后，滴加用 PBS稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗， 37孵育60 min（避光）。（5）染核并封片 用PBS（5min3）沖洗后，滴加DAPI染 核5min, PBS沖洗（5min3），滴加抗熒 光淬滅封片液。（6）激光共聚焦顯微鏡拍照Leica網(wǎng)上課程Leica Science Lab網(wǎng)址： 激光掃描共聚焦顯微鏡的基本特點(diǎn)l 觀察方式：以熒光為主l 光源：激光（紫外、可見光）l 照明方式：點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描l 成像方式：共聚焦、逐點(diǎn)成像l 輸出：實(shí)時(shí)觀測(cè)，數(shù)字化圖像，可以進(jìn)行 圖像處理和定量分析l 多重染色樣品的觀察基本功能l活體細(xì)胞熒光染色的動(dòng)態(tài)觀察及快速掃描成像 二、間接免疫熒光染色（FITCFITC標(biāo)記）（1）收集細(xì)胞 收集細(xì)胞爬片，吸取各培養(yǎng)孔上清，PBS沖洗（ 5min3），4%多聚甲醛固定20min，晾干后用。（2）通透及封閉 取出細(xì)胞爬片，貼于載玻片上，用PBS（5min3） 沖洗后，加入0.3% Triton X-100穿透細(xì)胞膜5min， PBS（5min3），加