Chapter 9 電泳

1、 電泳電泳(Electrophoresis)(Electrophoresis) 荷電溶質(zhì)荷電溶質(zhì)( (電解質(zhì)電解質(zhì)) )或粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生或粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生定向定向泳動(dòng)泳動(dòng)的現(xiàn)象，簡(jiǎn)稱(chēng)的現(xiàn)象，簡(jiǎn)稱(chēng)EPEP 。 電泳分離電泳分離 利用荷電溶質(zhì)利用荷電溶質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度的差別在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度的差別進(jìn)行分離進(jìn)行分離的方法。的方法。帶電粒子在電場(chǎng)作帶電粒子在電場(chǎng)作用下向著與其電性用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)相反的電極移動(dòng) 共同點(diǎn)：表象上均為溶質(zhì)移動(dòng)速度差異而分離共同點(diǎn)：表象上均為溶質(zhì)移動(dòng)速度差異而分離不同點(diǎn)：產(chǎn)生溶質(zhì)移動(dòng)速度差的原理不同。不同點(diǎn)：產(chǎn)生溶質(zhì)移動(dòng)速度差的原理不同。色譜為濃差驅(qū)動(dòng)

2、的傳質(zhì)色譜為濃差驅(qū)動(dòng)的傳質(zhì)平衡分離法平衡分離法電泳是外力電泳是外力( (電場(chǎng)力）作用下的電場(chǎng)力）作用下的差速分離法差速分離法 電泳色譜電泳色譜:將溶質(zhì)的電動(dòng)遷移和色譜分離作用相結(jié)合的技將溶質(zhì)的電動(dòng)遷移和色譜分離作用相結(jié)合的技術(shù)術(shù) 電色譜：電色譜：利用電滲作用驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相流動(dòng)，依據(jù)溶質(zhì)在固定利用電滲作用驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相流動(dòng)，依據(jù)溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相的分配行為差異進(jìn)行分離相和流動(dòng)相的分配行為差異進(jìn)行分離 一般情況下，二者并無(wú)嚴(yán)格區(qū)別，均稱(chēng)為電色譜一般情況下，二者并無(wú)嚴(yán)格區(qū)別，均稱(chēng)為電色譜電泳法的發(fā)展電泳法的發(fā)展2020世紀(jì)初期世紀(jì)初期 已用于蛋白質(zhì)的分離已用于蛋白質(zhì)的分離 7070年代前，主要應(yīng)用于分析目

3、的年代前，主要應(yīng)用于分析目的7070年代后，分離制備規(guī)模年代后，分離制備規(guī)模9090年代后，毛細(xì)管電泳和電色譜用于高速分析和年代后，毛細(xì)管電泳和電色譜用于高速分析和微量分離制備微量分離制備電泳法的特點(diǎn)電泳法的特點(diǎn)： （1 1）分辯率高）分辯率高, ,屬高度純化技術(shù)屬高度純化技術(shù) （2 2）電場(chǎng)作用）電場(chǎng)作用 （3 3）設(shè)備放大難，多用于分析（實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用）設(shè)備放大難，多用于分析（實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用）電泳技術(shù)的分類(lèi)電泳技術(shù)的分類(lèi) 根據(jù)原理和操作形式可分為根據(jù)原理和操作形式可分為： 區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳 等電點(diǎn)電泳等電點(diǎn)電泳 等速電泳等速電泳 根據(jù)是否使用凝膠載體可分為根據(jù)是否使用凝膠載體可分為： 凝膠電泳凝膠

4、電泳(Gel electrophoresis)(Gel electrophoresis) 自由流電泳自由流電泳( (Freeflow electrophoresisFreeflow electrophoresis) 以瓊脂糖、淀粉膠及以瓊脂糖、淀粉膠及聚丙烯酰胺等物質(zhì)作聚丙烯酰胺等物質(zhì)作支持體的電泳支持體的電泳。在無(wú)固相支持介質(zhì)在無(wú)固相支持介質(zhì), ,用特定緩沖用特定緩沖液作為分離介質(zhì)的分離系統(tǒng)中所液作為分離介質(zhì)的分離系統(tǒng)中所進(jìn)行的可溶性分子或不溶性顆粒進(jìn)行的可溶性分子或不溶性顆粒的電泳分離純化技術(shù)的電泳分離純化技術(shù) 按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可分為按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可分為:

5、 : (1)(1)板式電泳：板式電泳： 水平板式電泳：支持物水平放置，是最常用水平板式電泳：支持物水平放置，是最常用的電泳方式。的電泳方式。 垂直板式電泳：支持物垂直放置垂直板式電泳：支持物垂直放置 (2)(2)柱式電泳：柱式電泳：采用圓柱形凝膠柱，電泳分離后可將凝膠切片，采用圓柱形凝膠柱，電泳分離后可將凝膠切片，回收組份，多用于制備回收組份，多用于制備 電泳的應(yīng)用電泳的應(yīng)用： 1 1、分離各種生物產(chǎn)物：如蛋白質(zhì)、酶、核酸等、分離各種生物產(chǎn)物：如蛋白質(zhì)、酶、核酸等 2 2、分析某種物質(zhì)的純度及分子量、分析某種物質(zhì)的純度及分子量e6eZEvr 061eZf krurkr 一、自由溶液中的電泳速度

6、一、自由溶液中的電泳速度U0為遷移率遷移率(mobility)：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下帶電粒子的泳動(dòng)速度：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下帶電粒子的泳動(dòng)速度當(dāng)當(dāng)f=f時(shí)時(shí)，荷電溶質(zhì)恒速泳動(dòng)，則，荷電溶質(zhì)恒速泳動(dòng)，則靜電引力靜電引力 f=EZe黏性阻力黏性阻力 f=6e或e=u0EU0=eZ/6r kr為粒子半徑與雙電層厚度的比值為粒子半徑與雙電層厚度的比值Z溶質(zhì)電荷數(shù)溶質(zhì)電荷數(shù)E-電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度電子電量電子電量r球形溶質(zhì)半徑球形溶質(zhì)半徑,溶液粘度溶液粘度Ve溶質(zhì)運(yùn)動(dòng)速度溶質(zhì)運(yùn)動(dòng)速度二、凝膠中的電泳速度二、凝膠中的電泳速度 常用的常用的凝膠載體凝膠載體 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖、淀粉（瓊脂糖、淀粉（易發(fā)生易

7、發(fā)生電滲流電滲流，造成分離度下降，造成分離度下降） 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳速度凝膠電泳速度Lgu=lgu0-KrTgUo為自由溶液中的遷移率為自由溶液中的遷移率Kr為與交聯(lián)劑濃度有關(guān)的凝膠延遲系數(shù)為與交聯(lián)劑濃度有關(guān)的凝膠延遲系數(shù)Tg 為凝膠濃度為凝膠濃度由丙烯酰胺單體和交由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑聯(lián)劑N,N-N,N-亞甲基雙亞甲基雙丙烯酰胺共聚而成丙烯酰胺共聚而成三、電滲流速度三、電滲流速度電滲流的概念電滲流的概念瓊脂糖等凝膠載體在電場(chǎng)作用下瓊脂糖等凝膠載體在電場(chǎng)作用下易電離帶負(fù)電荷易電離帶負(fù)電荷，其誘導(dǎo)的其誘導(dǎo)的雙電層中反離子在電場(chǎng)作用下發(fā)生定向雙電層中反離子在電場(chǎng)作用下發(fā)生定向泳動(dòng)泳動(dòng)（

8、向陰極移動(dòng)），并帶動(dòng)周?chē)娜軇ㄋㄏ蜿帢O移動(dòng)），并帶動(dòng)周?chē)娜軇ㄋ┗瘜右黄鹩緞?dòng)，并在摩擦力作用下，化層一起泳動(dòng)，并在摩擦力作用下，帶動(dòng)主體溶帶動(dòng)主體溶液一起移動(dòng)液一起移動(dòng)的現(xiàn)象的現(xiàn)象電滲流驅(qū)動(dòng)的電色譜的流速電滲流驅(qū)動(dòng)的電色譜的流速 流速流速與操作壓力無(wú)關(guān)與操作壓力無(wú)關(guān)，即電滲流不會(huì)引起色譜柱，即電滲流不會(huì)引起色譜柱壓力的增大壓力的增大 電滲流速度電滲流速度與固定相粒徑無(wú)關(guān)與固定相粒徑無(wú)關(guān)，電色譜可采用比，電色譜可采用比HPLC更小的固定相粒子（更小的固定相粒子（1.5-5um)電滲流速度公式詳見(jiàn)電滲流速度公式詳見(jiàn)P366HPLC常采用固定相粒徑常采用固定相粒徑5四四、影響電泳遷移速度的

9、因素影響電泳遷移速度的因素 樣品性質(zhì)樣品性質(zhì) 電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度 緩沖液的性質(zhì)緩沖液的性質(zhì) 電滲電滲 溫度溫度 (1) (1) 樣品性質(zhì)樣品性質(zhì)：帶電量，分子大小，形狀帶電量，分子大小，形狀 分子帶電量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳分子帶電量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快遷移速度越快 (2) (2) 電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電泳速度起著決定性作用，電電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電泳速度起著決定性作用，電場(chǎng)強(qiáng)度越高，電泳速度越快場(chǎng)強(qiáng)度越高，電泳速度越快過(guò)高，產(chǎn)熱，樣品和過(guò)高，產(chǎn)熱，樣品和BufferBuffer擴(kuò)散增加，條帶增寬，蛋白變擴(kuò)散增加，條帶增寬，蛋白變性。性。過(guò)低，電泳

10、時(shí)間增加，擴(kuò)散。當(dāng)需要增大電場(chǎng)強(qiáng)度以縮短過(guò)低，電泳時(shí)間增加，擴(kuò)散。當(dāng)需要增大電場(chǎng)強(qiáng)度以縮短電泳時(shí)間時(shí)（如高壓電泳），需附有冷卻裝置電泳時(shí)間時(shí)（如高壓電泳），需附有冷卻裝置 (3) (3) 緩沖液的性質(zhì)緩沖液的性質(zhì) a a 緩沖液的緩沖液的pHpH pH pH 決定帶電量，決定帶電量，(pH-PI)(pH-PI)越大，帶電量越多，遷移速率越越大，帶電量越多，遷移速率越大大 b b 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度 I I越大，樣品電流減小，遷移率變??；越大，樣品電流減小，遷移率變小；I I越小，樣品電流越越小，樣品電流越大，遷移率越大，但樣品易擴(kuò)散，一般大，遷移率越大，但樣品易擴(kuò)散，一般I I在在0.02-0.

11、02-0.2M0.2M 選擇合適的選擇合適的pH，使各種蛋，使各種蛋白質(zhì)所帶電荷差異較大，白質(zhì)所帶電荷差異較大，利于彼此分開(kāi)；電泳過(guò)程利于彼此分開(kāi)；電泳過(guò)程中須采用具有一定緩沖能中須采用具有一定緩沖能力的緩沖液使力的緩沖液使pH值恒定值恒定 。 (4) (4) 電滲電滲 當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時(shí)，會(huì)加快顆粒泳動(dòng)速度，當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時(shí)，會(huì)加快顆粒泳動(dòng)速度，反之，當(dāng)兩者方向相反時(shí)，會(huì)減慢顆粒泳動(dòng)速度。反之，當(dāng)兩者方向相反時(shí)，會(huì)減慢顆粒泳動(dòng)速度。（5 5）溫度：過(guò)高，由于產(chǎn)熱增加、水分蒸發(fā)，對(duì)電）溫度：過(guò)高，由于產(chǎn)熱增加、水分蒸發(fā)，對(duì)電泳不利。泳不利。 凝膠電泳與凝膠過(guò)濾的區(qū)別凝膠電泳與

12、凝膠過(guò)濾的區(qū)別： 凝膠電泳：凝膠電泳：樣品中各分子的運(yùn)動(dòng)速度是小分子快于樣品中各分子的運(yùn)動(dòng)速度是小分子快于大分子大分子 凝膠過(guò)濾凝膠過(guò)濾：大分子運(yùn)動(dòng)快于小分子：大分子運(yùn)動(dòng)快于小分子原因原因：凝膠電泳中：凝膠電泳中,系統(tǒng)里沒(méi)有空隙體積系統(tǒng)里沒(méi)有空隙體積,只有網(wǎng)狀骨只有網(wǎng)狀骨架。大分子物質(zhì)不及小分子物質(zhì)容易移動(dòng)。架。大分子物質(zhì)不及小分子物質(zhì)容易移動(dòng)。 1.1.板式凝膠電泳板式凝膠電泳 處理量很小，不適合生物產(chǎn)物的分離制備。處理量很小，不適合生物產(chǎn)物的分離制備。 水平式平板凝膠電泳水平式平板凝膠電泳垂直式平板凝膠電泳垂直式平板凝膠電泳凝膠電泳的類(lèi)型凝膠電泳的類(lèi)型 2.2.圓柱型凝膠柱圓柱型凝膠柱 凝

13、膠切成圓片，分別溶出各個(gè)組分。凝膠切成圓片，分別溶出各個(gè)組分。 缺點(diǎn)：操作過(guò)于繁瑣，回收率不高，缺點(diǎn)：操作過(guò)于繁瑣，回收率不高，且易變性且易變性優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，凝膠可重復(fù)使用。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，凝膠可重復(fù)使用。缺點(diǎn)：回收的溶質(zhì)濃度很低缺點(diǎn)：回收的溶質(zhì)濃度很低。連續(xù)洗脫凝膠電泳：連續(xù)洗脫凝膠電泳：當(dāng)溶質(zhì)泳動(dòng)當(dāng)溶質(zhì)泳動(dòng)到凝膠末端時(shí)，通入洗脫液分別到凝膠末端時(shí)，通入洗脫液分別回收各個(gè)組分回收各個(gè)組分。凝膠種類(lèi)和濃度凝膠種類(lèi)和濃度電泳槽電泳槽制備膠板制備膠板放置樣品梳放置樣品梳加樣加樣電泳電泳觀察和拍照觀察和拍照凝膠電泳操作步驟凝膠電泳操作步驟制膠或染色時(shí)加制膠或染色時(shí)加入的染料入的染料EBEB是強(qiáng)是強(qiáng)

14、誘變劑并有中等誘變劑并有中等毒性，配制和使毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套用時(shí)都應(yīng)戴手套M 1 2 3 4PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳二、不連續(xù)凝膠電泳二、不連續(xù)凝膠電泳不連續(xù)凝膠電泳的分離原理： 1、樣品的濃縮效應(yīng) 1）凝膠層的不連續(xù)性 2）緩沖液離子成分的不連續(xù)性 2、電荷效應(yīng) 各種蛋白質(zhì)所帶電荷不同，有效遷移率也不同 3、分子篩效應(yīng) 凝膠濃度不同， 網(wǎng)孔徑大小不同。 分子量和構(gòu)型不同的蛋白質(zhì)分子，通過(guò)一定孔徑的凝膠時(shí)所受阻力不同，引起泳動(dòng)速度的變化，從而達(dá)到分離目的。 影響因素： 1、聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小 2、緩沖系統(tǒng) 3、離子強(qiáng)度 不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離

15、膠所組不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。成。不連續(xù)電泳的三個(gè)不連續(xù)性：不連續(xù)電泳的三個(gè)不連續(xù)性：a.a.凝膠濃度的不連續(xù)性凝膠濃度的不連續(xù)性( (分離膠濃度分離膠濃度 濃縮膠濃縮膠）b.b.緩沖液緩沖液pHpH值的不連續(xù)性值的不連續(xù)性 c.c.緩沖液離子成分的不連續(xù)性緩沖液離子成分的不連續(xù)性不連續(xù)電泳的不連續(xù)性不連續(xù)電泳的不連續(xù)性濃縮層凝膠緩沖液為濃縮層凝膠緩沖液為pH6.8的的Tris-HC1；分離層凝膠緩沖；分離層凝膠緩沖液為液為pH8.9的的Tris-HC1；電極；電極緩沖液是緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸甘氨酸-HC1緩沖液。緩沖液。電荷因素分子大小分子形狀分子形狀和

16、大小相同，分子形狀和大小相同，所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量不所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量不同同分子形狀和所帶電荷性質(zhì)分子形狀和所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子大小不和數(shù)量相同，分子大小不同同分子所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量分子所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量相同，分子形狀不同相同，分子形狀不同 原理原理：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，遷移率取決于：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，遷移率取決于其所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙其所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,(sodium do

17、decyl sulfate,簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)SDS)SDS)，則蛋白質(zhì)分子的，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形，而與所帶電荷和形狀無(wú)關(guān)。因此可以利用狀無(wú)關(guān)。因此可以利用SDS-PAGESDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。 等速電泳的特點(diǎn)等速電泳的特點(diǎn) (1)(1)各個(gè)各個(gè)組分間形成相互連接的獨(dú)自區(qū)帶組分間形成相互連接的獨(dú)自區(qū)帶，可有效抑制擴(kuò)散，可有效抑制擴(kuò)散引起的區(qū)帶分散現(xiàn)象。引起的區(qū)帶分散現(xiàn)象。 (2)(2)提高前導(dǎo)電解質(zhì)濃度，可提高溶質(zhì)的濃縮率。提高前導(dǎo)電解質(zhì)濃度，可提高溶質(zhì)的濃縮率。 (3)(3)采用適當(dāng)?shù)牟捎眠m當(dāng)?shù)牡头肿?/p>

18、兩性電解質(zhì)低分子兩性電解質(zhì)，在目標(biāo)蛋白質(zhì)前后作，在目標(biāo)蛋白質(zhì)前后作間間隔物隔物，可使目標(biāo)蛋白與其他蛋白質(zhì)完全分離，得到高度純，可使目標(biāo)蛋白與其他蛋白質(zhì)完全分離，得到高度純化。化。 定義：一種利用具有連續(xù)pH梯度的支持介質(zhì)分離等點(diǎn)電不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。等等 電電 聚聚 焦焦 電電 泳泳 在電泳介質(zhì)中放入在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐步增加的由正極到負(fù)極逐步增加的pHpH梯度梯度，正極附近是低正極附近是低pHpH區(qū)，負(fù)極附近是高區(qū)，負(fù)極附近是高pHpH區(qū)。區(qū)。 蛋白質(zhì)（和氨基酸）等兩性電解質(zhì)具

19、有等電點(diǎn)，在等電蛋白質(zhì)（和氨基酸）等兩性電解質(zhì)具有等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)的點(diǎn)的pHpH值下呈電中性，不發(fā)生泳動(dòng)。因此，在此體系中，值下呈電中性，不發(fā)生泳動(dòng)。因此，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于其相應(yīng)的等電點(diǎn)位置上聚焦于其相應(yīng)的等電點(diǎn)位置上，形成具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)區(qū)帶形成具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)區(qū)帶pI1pI2pI3 pIn- -+ +有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定、重復(fù)性良好的連有一個(gè)在電泳條件下基本穩(wěn)定、重復(fù)性良好的連續(xù)續(xù)pHpH梯度梯度有一個(gè)抗對(duì)流的電泳材料，使已經(jīng)分離的樣品不有一個(gè)抗對(duì)流的電泳材料，使已經(jīng)分離的樣品不再重新混合再重新混合電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)鑒定分離的區(qū)帶電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)鑒定分離的區(qū)帶凝膠中加有凝膠中加有兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì)溶液（溶液（pH9-3） 加電場(chǎng)加電場(chǎng)后在凝膠內(nèi)后在凝膠內(nèi)形成一個(gè)穩(wěn)形成一個(gè)穩(wěn)定定pH梯度梯度 加樣品，加樣品，然后繼續(xù)然后繼續(xù)電泳電泳凝膠染色表明凝膠染色表明樣品按照各自樣品按照各自pI值沿著值沿著pH梯度分布梯度分布等電聚焦示意圖等電聚焦示意圖（一）優(yōu)點(diǎn)（一）優(yōu)點(diǎn)1.1.分辨率高分辨率高 分辨率較不連續(xù)分辨率較不連續(xù)PAGEPAGE更高更高（精密度可達(dá)（精密度可達(dá)0.01pH0.01