第二章_酶的生產(chǎn)與分離純化

1、第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化第2章 酶的生產(chǎn)與分離純化 主要內(nèi)容： 2.1 國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀 2.2 酶的發(fā)酵技術(shù) 2.3 酶的分離純化 2.4 酶分離、純化的評價 2.5 酶的劑型與保存2.1國內(nèi)外酶制劑工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用現(xiàn)狀2.1.1 新技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用： w 三種方法： n 組織提?。耗竟系鞍酌浮⒛榈鞍酌?n 微生物發(fā)酵：最大量的來源 n 化學(xué)及生物合成：生物重組 w 高新技術(shù)的應(yīng)用：酶的修飾、固定化、基因重組、膜分離技術(shù)、冷凍干燥、微膠囊 2.1.2. 集中壟斷，市場全球化： w 規(guī)模企業(yè)由20世紀(jì)80年代初的80多家減少至20多家，占市場90%w 丹麥諾和諾得公司（諾維信

2、novozymes）1978年進入中國諾維信公司，占50%市場（天津）；w 美國杰能科公司（Genencor）98年進入中國，與無錫合資，控股80%（無錫），兩家公司銷售額占全球2/3；（2005年杰能科國際公司被丹尼斯克公司收購）；w 芬蘭科特公司和丹麥丹尼斯克公司酶制劑業(yè)務(wù)合并，Pfizer，Rhone，SKW , Biosystems，日本天野2.1.3. 品種、規(guī)模不斷擴大 w 目前30多家600多個品種，應(yīng)用于18個工業(yè)領(lǐng)域。w 我國2000年酶制劑產(chǎn)量為30萬噸，100家，市場份額僅占5%，以未經(jīng)除菌去渣的粗制品粉狀酶為主。w 國際以液體、顆粒為主。w 國內(nèi)糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶

3、三大類占了97%，顯然不合理。w 重要產(chǎn)品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國內(nèi)尚未投入生產(chǎn);w 我國有7家上市公司介入酶制劑開發(fā)生產(chǎn)。2.1.4. 應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大： w 美國酶制劑年產(chǎn)值6.25億美元，食品工業(yè)占62%，拓展飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化學(xué)工業(yè)。2.2 酶的發(fā)酵技術(shù) w 利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點是：n (1) 微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。n (2) 微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。n (3) 微生物培養(yǎng)基來源廣泛、價格便宜。n (4) 可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動化，經(jīng)濟效益高。n (5) 可以利用以基因

4、工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種。因此，下面將主要介紹微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的一般原理和工藝。2.2.1 產(chǎn)酶微生物 w 菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。菌種不僅與產(chǎn)酶種類、產(chǎn)量密切相關(guān)，而且與發(fā)酵條件、工藝等關(guān)系密切。已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的酶約有5060種。它們的生產(chǎn)菌種十分廣泛，包括細菌、放線菌、酵母菌、霉菌。2.2.2 酶的發(fā)酵技術(shù) w 2.2.2.1 培養(yǎng)基n 培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無機鹽、生長因子和產(chǎn)酶促進劑等。 （1）碳源w 碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，也是細胞貯藏物質(zhì)和生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物

5、的骨架，還是菌體生命活動的能量的主要來源。當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能利用有機碳 的異養(yǎng)型微生物。有機碳的主要來源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。此外，以石油產(chǎn)品中12 16 碳的成分來作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。 n 不同的細胞對各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時應(yīng)根據(jù)不同細胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營養(yǎng)要求外，還要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導(dǎo)作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。 n 例如，淀粉

6、酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)該選用有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。w （2）氮源n 氮是生物體內(nèi)各種含氮物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機氮源和無機氮 源兩種，常用的有機氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無機氮源有：(NH4)2SO4 、NH4Cl 、NH4NO3 、(NH4)3P04 、尿素等。 n 不同的細胞對各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進行選擇和配制。一般來說，動物細胞要求有機氮，植物細胞主要要求無機氮。多數(shù)情況下將有機氮源和無機氮源配合使用才能取得較好的效果。例如

7、黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時，酶產(chǎn)量僅為有胨時的30% 。只用有機氮源而不用無機氮源時產(chǎn)量也低，故一般除使用高濃度有機氮源外尚需添加1%3% 的無機氮源。w （3） 碳氮比n 在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的不同而改變的。 n 一般蛋白酶 ( 包括酸性、中性和堿性蛋白酶) 生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利，例如黑曲霉3.350 酸性蛋白酶生產(chǎn)采用由豆餅粉3.75 % 、玉米粉0.625% 、魚粉0.625% 。NH4Cl 1% 、CaCl2 0.5% 、Na2HP04 0.2% 、豆餅石灰水解液10% 組成的培養(yǎng)基； n 淀粉酶

8、( 包括 淀粉酶、糖化酶、 淀粉酶等) 生產(chǎn)的碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高，例如枯草桿菌TUD127 淀粉酶生產(chǎn)采用由豆餅粉4 % 、玉米粉8 % 、Na2HP04 0.8% 、 (NH4)2SO4 0.4% 、CaCl2 0.2% 組成的培養(yǎng)基。而在淀粉酶生產(chǎn)中糖化酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基碳氮比的一般規(guī)律，但是由于菌種很多而其性質(zhì)各異。很難說都是符合上述規(guī)律的。 n 在微生物酶生產(chǎn)過程中，培養(yǎng)基的碳氮比也因培養(yǎng)過程不同而異。例如種子培養(yǎng)時，為了適應(yīng)菌體生長繁殖的需要，要求提供合成細胞蛋白質(zhì)的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，種子培養(yǎng)基的碳氮比一般要比發(fā)酵培養(yǎng)

9、基低些。發(fā)酵時，不同發(fā)酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF 7658 生產(chǎn) 淀粉酶的發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)降低，以利菌體生長繁殖，發(fā)酵中后期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)提高，以促進淀粉酶的生成。 w （4） 無機鹽n 微生物酶生產(chǎn)和其他微生物產(chǎn)品生產(chǎn)一樣，培養(yǎng)基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。在酶生產(chǎn)中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。鈣離子對淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩(wěn)定作用，例如在無Ca2+存在時灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH77.5很小范圍內(nèi)穩(wěn)定，當(dāng)有Ca2+存在時穩(wěn)定pH范圍可以擴大到57。鈉離

10、子有控制細胞滲透壓使酶產(chǎn)量增加的作用，酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基中有時以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式加入，例如米曲霉淀粉酶生產(chǎn)，添加適量的硝酸鈉以促進酶生產(chǎn)。n 在天然培養(yǎng)基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時，添加100 ppm Co2+和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%80%。w （5 ）生長因子 n 微生物還需一些微量的像維生素一類的物質(zhì)，才能正常生長發(fā)育，這類物質(zhì)統(tǒng)稱生長因子( 或生長素) 。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長素321

11、28mg / mL 。 w （6） 產(chǎn)酶促進劑 n 產(chǎn)酶促進劑是指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進劑。產(chǎn)酶促進劑大體上分為兩種：一是誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。表面活性劑，如吐溫80的濃度為0.1 %時能增加許多酶的產(chǎn)量。表面活性劑能增加細胞的通透性，處在氣液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護酶的活性。生產(chǎn)上常采用非離子型表面活性劑，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸類、焦糖、羧甲基纖維素、苯乙醇等。離子型的表面活性劑對微生物有害。用于食品、醫(yī)藥的酶的生產(chǎn)中所用的表面活性劑還須對人、畜無害。此外各種產(chǎn)酶促進劑的效果還受到菌種，種齡、培養(yǎng)基組成的影響。2.2.2.3

12、 液體深層發(fā)酵的工藝控制 w 酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外，還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。w (1) 溫度對產(chǎn)酶的影響 n 發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。微生物在生長發(fā)育中，不斷地吸收培養(yǎng)基營養(yǎng)成分來合成菌體的細胞物質(zhì)和酶時的生化反應(yīng)都是吸熱反應(yīng)；培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被大量分解時的生化反應(yīng)都是放熱反應(yīng)。發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收的熱量大于分解反應(yīng)放出的熱量，發(fā)酵液需要升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時，情況則相反，發(fā)酵液溫度就自行上升，加上通風(fēng)攪拌所帶來的熱量，這時，發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長繁殖和產(chǎn)酶所需的適宜溫度。n 微生物生

13、長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質(zhì)不同而異，生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。一般細菌為37 ，霉菌和放線菌為2830 ，一些嗜熱微生物需在4050 下生長繁殖，如紅曲霉生長溫度3537，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為3740 。n 在酶生產(chǎn)中，為了有利于菌體生長和酶的合成，也有進行變溫生產(chǎn)的。例如以枯草桿菌ASl.398進行中性蛋白酶生產(chǎn)時，培養(yǎng)溫度必須從31 逐漸升溫至40 ，然后再降溫到31進行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。據(jù)報道，酶生產(chǎn)的溫度對酶活力的穩(wěn)定性有影響，例如用嗜熱芽孢桿菌進行淀粉酶生產(chǎn)時，在55 培養(yǎng)所產(chǎn)生的酶的穩(wěn)定性比35 好。w (2) pH對產(chǎn)酶的影響n 種子

14、培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。在發(fā)酵過程中，微生物不斷分解和同化營養(yǎng)物質(zhì)，同時排出代謝產(chǎn)物。由于這些產(chǎn)物都與pH有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液pH在不斷發(fā)生變化。生產(chǎn)上根據(jù)pH的變化情況常作為生產(chǎn)控制的根據(jù)。n 一般來說，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。pH的這些變化情況，常常引起細胞生長和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對產(chǎn)酶帶來不利的影響。因此生產(chǎn)中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C / N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過高時用糖或淀粉來調(diào)節(jié)

15、，pH過低時，通過氮調(diào)節(jié)。w (3) 通風(fēng)量對產(chǎn)酶的影響n 其實通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來說，在發(fā)酵初期，雖然幼細胞呼吸強度大，耗氧多，但由于菌體少，相對通風(fēng)量可以少些；菌體生長繁殖旺盛期時，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；產(chǎn)酶旺盛時的通風(fēng)量因菌種和酶種而異，一般需要強烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量過多反而抑制酶的生成。因此，菌種、酶種、培養(yǎng)時期、培養(yǎng)基和設(shè)備性能都能影響通風(fēng)量，從而影響酶的產(chǎn)量。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動測定和記錄溶解氧的儀表。 w (4) 攪拌的影響n 對于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營養(yǎng)

16、物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶氧量，增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產(chǎn)生剪切力，易使細胞受損。同時攪拌也帶來一定機械熱，易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關(guān)。 w (5) 泡沫的影響n 發(fā)酵中往往產(chǎn)生較多的泡沫。泡沫的存在阻礙了CO2的排除，影響溶氧量，同時泡沫過多影響補料，也易使發(fā)酵液溢出罐外造成跑料。因此，生產(chǎn)上必須采用消泡措施。一般除了機械消泡外，還可利用消泡劑。消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和

17、聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我國常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵(聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚)。理想的消泡劑，其表面相互作用力應(yīng)低，而且應(yīng)難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。w (6) 濕度 n 用固體培養(yǎng)基生產(chǎn)酶制劑時，一般前期濕度低些，培養(yǎng)后期濕度大些，有利于產(chǎn)酶。2.3 酶的分離純化 酶的分離純化工作，是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)。酶的純化過程，就目前而言，還是一門實驗科學(xué)。一個特定酶的提純往往需要通過許多次小實驗進行摸索，沒有通用的規(guī)律可循。酶的純化過程與一般的蛋白質(zhì)純化過程相比，又有其本身獨有的特點：一是特定的一種酶在細胞中的含量很少，二是酶可以通過測定活力的方法加以跟蹤，前者給純化帶來

18、了困難，而后者卻能使我們迅速找出純化過程的關(guān)鍵所在。2.3.1 酶原料的選擇 w 一般來說，為了使純化過程容易進行，總是選擇目的酶含量最多的生物組織為原料來進行提取純化的。當(dāng)然，也要考慮原料的來源、取材方便、經(jīng)濟等因素。在分離純化動物Cu，ZnSOD(超氧化物歧化酶)時，一般就以含Cu，ZnSOD很高的動物血球為原材料。MnSOD主要存在于線粒體中，所以，龍蝦、靈芝草、人體組織適宜于作為提取MnSOD的原材料。但龍蝦、靈芝草等非常昂貴，人體組織也很難得到，因而，除非是特殊目的的純化，一般不選用這些材料提取酶。w 目前，利用動、植物細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，可以大量獲得以前極為珍貴的原材料 (例如

19、人參細胞、某些昆蟲細胞等)，用于酶的分離純化。利用基因工程重組DNA技術(shù)，能夠使某些在細胞中含量極微的酶的純化成為可能。例如，大腸桿菌胞內(nèi)芳香族氨基酸的合成需要EPSP合成酶（丙酮酰莽草酸磷酸合成酶）的參與。現(xiàn)已分離出這種酶的基因并重組入多拷貝質(zhì)粒pAT153，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，產(chǎn)生一種比野生型大腸桿菌株高100倍EPSP合成酶含量的新菌株。從18g新菌株的菌體中，可純化得4.8 mgEPSP合成酶。2.3.2 酶的提取 2.3.2.1 生物組織的破碎 w 各種生物組織的細胞有著不同的特點，在考慮破碎方法時，要根據(jù)細胞性質(zhì)、處理量及酶的性質(zhì)，采用合適的方法。w (1) 機械 (勻漿) 法n

20、 利用機械力的攪拌、剪切、研碎細胞。常用的有高速組織搗碎機，高壓勻漿泵、玻璃或Teflon加研棒勻漿器高速球磨機或直接用研缽研磨等。w (2) 超聲波法n 超聲波是破碎細胞或細胞器的一種有效手段。經(jīng)過足夠時間的超聲波處理，細菌和酵母細胞都能得到很好的破碎。超聲處理的主要問題是超聲空穴局部過熱引起酶活性喪失，所以超聲振蕩處理的時間應(yīng)盡可能短，容器周圍以冰浴冷卻處理，盡量減小熱效應(yīng)引起的酶的失活。w (3) 凍融法n 生物組織經(jīng)冰凍后，細胞胞液結(jié)成冰晶，使細胞壁脹破。凍融法所需設(shè)備簡單，普通家用冰箱的冷凍室即可進行凍融。一般需在凍融液中加入蛋白酶抑制劑，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、絡(luò)合劑EDTA、

21、還原劑DTT (二硫蘇糖醇) 等以防破壞目的酶。w (4) 滲透壓法n 滲透破碎是破碎細胞最溫和的方法之一。細胞在低滲溶液中由于滲透壓的作用，溶脹破碎。如紅血球在純水中會發(fā)生破壁溶血現(xiàn)象。但這種方法對具有堅韌的多糖細胞壁的細胞，如植物、細菌和霉菌不太適用，除非用其他方法先除去這些細胞外層堅韌的細胞壁。w (5) 酶消化法n 利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶對細胞膜或細胞壁的酶解作用，使細胞崩解破碎。將革蘭氏陽性菌 (如枯草桿菌) 與溶菌酶一起溫育，就能得到易破碎的原生質(zhì)體，用EDTA與革蘭氏陰性菌 (如大腸桿菌) 一起溫育，也可制得相應(yīng)的原生質(zhì)體。幾丁質(zhì)酶和3葡聚糖酶則常用于水解曲霉、面包霉等的

22、細胞壁。w (6) 化學(xué)破碎法n 化學(xué)破碎法是應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細胞膜作用，使細胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞的方法。n 常用的化學(xué)試劑可分為有機溶劑和表面活性劑兩大類。n 有機溶劑處理w 常用的有機溶劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。w 有機溶劑可使細胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋出胞外。例如，將細胞懸浮在10倍體積的預(yù)冷至20的丙酮之中，攪拌均勻，待自然沉降后棄上清液，抽濾得細胞，再用2.5倍體積的20 丙酮洗滌，抽干后，把得到的細胞立即放入真空干燥器中，除去殘余的丙酮，得到細胞干粉，可長期保存，使用時再用水或緩沖液把胞內(nèi)的酶提取出來。n 表面活性劑處理w

23、表面活性劑可以和細胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過性。2.3.2.2 酶的提取 w 酶的提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱作酶的抽提。酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。大多?shù)酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液提取；有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中，要注意控制好溫度、pH值等各種條件。破碎生物組織一般在適當(dāng)?shù)木彌_液中進行。典型的抽提液由以下幾部分組成：w 抽提液 離子強度調(diào)節(jié)劑 十 pH緩沖劑 溫度效應(yīng)劑 (KCl、NaC

24、l、蔗糖) (各種緩沖液) (甘油、二甲基亞砜) 蛋白酶抑制劑 防氧化劑 重金屬絡(luò)合劑 增溶劑 (PM3F、DIFP) (DTT 巰基乙醇) (EDTA、檸檬酸) (TritonX100)w 根據(jù)酶提取時所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機溶劑提取等。w (1) 鹽溶液提取n 大多數(shù)酶溶于水，而且在一定濃度的鹽存在條件下，酶的溶解度增加，這稱之為鹽溶現(xiàn)象，然而酶濃度不能太高，否則溶解度反而降低，出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。所以一般采用稀鹽溶液進行酶的提取，鹽濃度一般控制在0.020.5 mol/L的范圍內(nèi)。例如，用固體發(fā)酵生產(chǎn)的麩曲中的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等

25、胞外酶，用0.15 mol/L的氯化鈉溶液或0.020.05 mol/L的磷酸緩沖液提??；酵母醇脫氫酶用0.50.6 mol/L的磷酸氫二鈉溶液提取；6磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1 mol/L的碳酸鈉提?。嚎莶輻U菌堿性磷酸酶用0.1 mol/L的氯化鎂提取等。有少數(shù)酶，如霉菌產(chǎn)生的脂肪酶，用清水提取比鹽溶液提取的效果較好。w (2) 酸溶液提取n 有些酶在酸性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好宜用酸溶液提取。例如從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12 mol/L的硫酸溶液進行提取。w (3) 堿溶液提取n 有些在堿性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好的酶，應(yīng)采用堿溶液提取。例如，細菌L天門冬酰胺酶的

26、提取是將含酶菌體懸浮在pH 1112.5的堿溶液中，振蕩20 min，即達到顯著的提取效果。w (4) 有機溶劑提取n 有些與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團較多的酶，不溶或難溶于水、稀酸、稀堿和稀鹽溶液中，需用有機溶劑提取。常用的有機溶劑是與水能夠混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。其中丁醇對脂蛋白的解離能力較強，提取效果較好，已成功地用于琥珀酸脫氫酶、細胞色素氧化酶、膽堿酯酶等的提取。2.3.2.3 離心分離 w 離心是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)，在酶的提取和分離純化過程中，細胞的收集、細胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等往往要使用離心分離。在離心分離時，

27、要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。w 離心機多種多樣，按照離心機的最大轉(zhuǎn)速的不同可以分為常速(低速)、高速和超速三種。w 常速離心機的最大轉(zhuǎn)速在8000 r / min以內(nèi)，相對離心力(RCF)在1×104g以內(nèi)，在酶的分離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。w 高速離心機的最大轉(zhuǎn)速為1×104 2.5×104 r / min，相對離心力達到1×104 g 1×105 g，在酶的分離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。w 超速離心機的最大轉(zhuǎn)速達2.5×

28、;104 8×104 r / min，相對離心力可以高達5×105 g。超速離心可以采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。超速離心可用于酶分子的分離純化。在離心過程中，應(yīng)該根據(jù)需要，選擇好離心力(或離心速度) 和離心時間，并且控制好溫度和pH值等條件。2.3.3 酶的純化 w 抽提的酶液是否需要進一步經(jīng)過純化，要視其應(yīng)用部門的要求。一般工業(yè)的酶，如紡織工業(yè)應(yīng)用淀粉酶脫膠處理，往往采用液體粗酶便可；皮革工業(yè)應(yīng)用的細菌蛋白酶也是如此。食品工業(yè)應(yīng)用的酶如果粗酶液已達到食品級標(biāo)準(zhǔn)要求，特別是衛(wèi)生指標(biāo)，也無需進一步純化。然而，應(yīng)用于醫(yī)藥、化學(xué)試劑級的酶液必須進一步純化。w

29、在濃縮液或發(fā)酵液中，除含有我們需要的酶以外，還不可避免地存在著其他大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)。其中小分子物質(zhì)在以后的純化步驟中會自然而然的除去。大分子物質(zhì)中包括核酸、粘多糖及其他蛋白質(zhì)等。因此，酶的分離純化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來或者將雜蛋白從酶溶液中除去。現(xiàn)有酶的分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。w 酶和雜蛋白的性質(zhì)差異大體有以下幾個方面，它們的分離方法根據(jù)這個基礎(chǔ)分為：n (1) 根據(jù)分子大小而設(shè)計的方法。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。n (2) 根據(jù)溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法等。n (3) 按分

30、子所帶正負電荷多少分離的方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。n (4) 按穩(wěn)定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法、選擇性酸堿變性法、選擇性表面變性法等。n (5) 按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法、親和電泳法等。 有機溶劑沉淀法 w 利用和水互溶的有機溶劑使酶沉淀的方法很早就用來純化酶。在工業(yè)上也很重要，例如血漿蛋白質(zhì)的分離純化，至今仍采用本法。由于本法的機理和鹽析法不同，可作為鹽析法的補充。w 加入有機溶劑于酶溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來，使酶沉淀。其中主要效應(yīng)是水的活度的降低。當(dāng)有機溶劑濃度增大時，水對酶分子表面上荷電基團或親水基團的水化程度降低，或者

31、說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。在憎水區(qū)域附近有序排列的水分子可以為有機溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了憎水性特別強的酶外，對多數(shù)酶來說，后者影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致酶分子聚集而沉淀。w 有機溶劑沉淀法的優(yōu)點是溶劑容易蒸發(fā)除去，不會殘留在成品中，因此適用于制備食品級酶。而且有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有機溶劑沉淀法的缺點是，容易使酶變性失活，且有機溶劑易燃、易爆、安全要求較高。凝膠過濾(gel filtration chromatography)w 凝膠過濾有多種名稱，又稱凝膠排阻層析、分子篩層析法、凝膠層析法等。是根據(jù)溶質(zhì)分子的大小進行分離的方法。它

32、具有一系列的優(yōu)點：操作方便，不會使物質(zhì)變性，層析介質(zhì)不需再生，可反復(fù)使用等；因而在酶純化中占有重要位置。由于凝膠層析劑的容量比較低，所以在生物大分子物質(zhì)的分離純化中，一般不作為第一步的分離方法，而往往在最后的處理中被使用。它的應(yīng)用主要包括脫鹽，生物大分子按分子大小分級分離以及分子量測定等。(1) 基本原理w 在顯微鏡下，可觀察到凝膠過濾層析介質(zhì)具有海綿狀結(jié)構(gòu)。將凝膠裝于層析柱中，加入混合液，內(nèi)含不同分子量的物質(zhì)，小分子溶質(zhì)能在凝膠海綿狀網(wǎng)格內(nèi)，即凝膠內(nèi)部空間全都能為小分子溶質(zhì)所達到，凝膠內(nèi)外小分子溶質(zhì)濃度一致。在向下移動的過程中，它從一個凝膠顆粒內(nèi)部擴散到膠?？紫逗笤龠M入另一凝膠顆粒，如此不斷

33、地進人與流出，使流程增長，移動速率慢故最后流出層析柱。而中等大小的分子，它們也能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分送入凝膠顆粒，從而在大分子與小分子物質(zhì)之間被洗脫。大分子溶質(zhì)不能透人凝膠內(nèi)，而只能沿著凝膠顆粒間隙流運動，因此流程短，下移速度較小分子溶質(zhì)快而首先流出層析柱。因而樣品通過定距離的層析柱后，不同大小的分子將按先后順序依次流出，彼此分開。 圖24 凝膠過濾層析的原理a.小分子由于擴散作用進入凝膠內(nèi)部被截留；大分子被排阻在顆粒外，在顆粒間迅速通過。b. 1.蛋白質(zhì)混合物上柱，2. 洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內(nèi)大分子被排阻在顆粒外，3. 小分子被截留，大分子向下移動，大小分子分開， 4. 大小

34、分子完全分開，5. 大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進中。(2) 凝膠種類 w 葡聚糖凝膠 是分子量幾萬到幾十萬的葡聚糖凝膠通過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，可分離分子量從l 000500 000的分子。其商品名是Sephadex G，有各種型號(表23 )，G后的數(shù)字表示每g干膠吸水量 (即吸水值) 的10倍。其特性如表23所示，另外還有一種為SephacrylS，通過N，N甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)的烯丙基葡聚糖，可適用于水、有機溶劑及高濃度解離試劑存在的系統(tǒng)。另一類SephadexLH，適用于脂類化合物的分離。w 葡聚糖凝膠在干燥狀態(tài)是堅硬的白色粉末，不溶于水和鹽類溶液。因具有大

35、量的羥基，故有很大的親水性，在水中即顯膨脹，吸水后機械強度大大降低。它對堿和弱酸 (pH 212) 穩(wěn)定。在強酸溶液中，特別是在高溫度下，糖苷鍵會水解。在中性下，可在120 加壓消毒保存。和氧化劑接觸會分解。長久不用時，有時會長霉，應(yīng)加防腐劑。 w 聚丙烯酰胺凝膠 是以丙烯酰胺為單體，通過N ，N 甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑共聚而成的凝膠物質(zhì)。商品名是Bio Gel P ，有各種型號，P 后的數(shù)字乘以1 000 表示其分離的最大分子量 ( 即排阻分子量) 。 w 瓊脂糖凝膠 瓊脂糖是瓊脂抽去瓊脂膠等之后所得D 半乳糖和3 ，6 脫水半乳糖，自動締合而成的網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)物質(zhì)，孔徑大小由膠的濃度決定。以商品

36、Sepharose 為例，有2B 、4B 和6B 等規(guī)格，B 前面數(shù)字表示膠百分濃度。這類凝膠孔徑都比較大，適于分離較大的物質(zhì)，如病毒、細胞顆粒和DNA 等。 其他純化方法 w 親和層析法n 利用生物體內(nèi)存在的特異性相互作用分子對而設(shè)計的層析方法w 染料層析法n 具有親和配基的染料可以吸附酶，由于配基的結(jié)構(gòu)類似某些酶的底物。w 疏水層析n 將疏水性基團如丁烷、辛烷、苯固定化到介質(zhì)上，這些基團會與蛋白質(zhì)生物大分子上的疏水區(qū)親和。w 電泳n 靠溶質(zhì)在電場移動中移動速度不同而分離的方法。2.4 酶分離、純化的評價 w 酶經(jīng)分離、純化后要確定該純化步驟是否適宜，必須經(jīng)過對有關(guān)參數(shù)的測定及計算才能確定。

37、酶的產(chǎn)量是以活力單位表示，因此在整個分離過程中每一步始終貫穿比活力和總活力的檢測、比較。 基本概念1 重要w 酶活力(Enzyme activity) ：酶活力是指酶催化反應(yīng)的能力，它表示樣品中酶的含量。1961 年國際酶學(xué)會規(guī)定，l min 催化lmol 分子底物轉(zhuǎn)化的酶量為該酶的一個活力單位 ( 國際單位 ) ，溫度為25 ，其它條件 (pH 、離子強度) 采用最適條件。 w 酶的總活力為樣品的全部酶活力。 總活力 = 酶活力 × 總體積 (mL) 或 = 酶活力 × 總質(zhì)量 (g)w 比活力 (Specific activity) ：比活力是指單位蛋白質(zhì) ( 毫克蛋白

38、質(zhì)或毫克蛋白氮) 所含有的酶活力 ( 單位/ 毫克蛋白) 。比活力是酶純度指標(biāo)，比活力愈高表示酶愈純，即表示單位蛋白質(zhì)中酶催化反應(yīng)的能力愈大。但是，比活力仍然是個相對酶純度指標(biāo)。要了解酶的實際純度，尚需采用電泳等測定方法。 w 回收率 (Yield percent) ：回收率是指提純前與提純后酶的總活力之比。它表示提純過程中酶的損失程度，回收率愈高，其損失愈少。 w 提純倍數(shù)：提純倍數(shù)是指提純前后兩者比活力之比。它表示提純過程中酶純度提高的程度，提純倍數(shù)愈大，提純效果愈佳。 酶純化評價實例 2.5 酶的劑型與保存 w 酶制劑通常有下列四種劑型：n 液體酶制劑n 固體粗酶制劑n 純酶制劑n 固定化酶制劑（見書中第五章）2.5.1 液體酶制劑 w 包括稀酶液和濃縮酶液。一般除去固體雜質(zhì)后，不再純化而直接制成，或加以濃縮而成，一般需要加穩(wěn)定劑。這種酶制劑不穩(wěn)定，且成分復(fù)雜，只用于某些工業(yè)生產(chǎn)。2.5.2 固體粗酶制劑 w 發(fā)酵液經(jīng)殺菌后直接濃縮或噴霧干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工業(yè)生產(chǎn)。有的經(jīng)初步純化后制成，如用于洗滌劑、藥物生產(chǎn)。用于加工或生產(chǎn)某種產(chǎn)品時，務(wù)須除去起干擾作用的雜酶，才不會影響質(zhì)量。固體酶制劑適于運輸和短期保存，成本也不高。2.5.3