小麥中嘔吐毒素的ELISA和HPLC法檢測分析

1、小麥中嘔吐毒素的ELISA和HPLC法檢測分析馬曉靜摘  要：小麥是糧食作物的一種，小麥的質(zhì)量直接影響著其銷量，且關(guān)乎人體健康。小麥中的嘔吐毒素含量一旦超標，相關(guān)制造業(yè)運營的穩(wěn)定性那么難以保證，導致企業(yè)的經(jīng)濟效益不同程度受損?；诖?，應用ELISA和HPLC法檢測小麥嘔吐毒素的含量，既能了解不同檢測方法的應用原理，又能全面保證小麥質(zhì)量。關(guān)鍵詞：小麥;嘔吐毒素;ELISA法;HPLC法;檢測分析文章編號：1005-2690202121-0019-02    中圖分類號：R446.6    文獻標志

2、碼：B我國河北省的小麥產(chǎn)量逐年增多，使用ELISA法和HPLC法準確檢測小麥嘔吐毒素的含量，將檢測結(jié)果作為衡量小麥質(zhì)量、篩選合規(guī)小麥的重要標準，以此提升河北省的小麥銷量，盡可能降低小麥加工企業(yè)的平安風險。從糧食平安保障角度出發(fā)，分析ELISA法和HPLC法在小麥嘔吐毒素檢測中的應用十分必要，能夠在一定程度上減輕儲糧經(jīng)濟損失。1  嘔吐毒素嘔吐霉素指主成分為DON的單端孢霉烯族化合物【1】，在禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌作用下生成，因為嘔吐霉素中DON結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、毒害性較大，一旦谷物中出現(xiàn)嘔吐毒素且含量超過規(guī)定標準，那么谷物產(chǎn)品及其加工品的平安風險會大大增加。當前，嘔吐毒素常見于小麥

3、、高粱等糧食作物中，經(jīng)檢測可知嘔吐毒素的含量，應據(jù)此制定可行的管控方法，盡可能減少食品平安問題的發(fā)生【2】。2  小麥中嘔吐毒素檢測的常用方法2.1  ELISA法ELISA法的全稱為酶聯(lián)免疫檢測法，這種方法具有操作便捷、快速檢測等優(yōu)點，在小麥嘔吐毒素檢測中的適用性較強【3】。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒作為小麥樣品容納裝置，在酶標板孔上預包被嘔吐毒素抗原，樣本中的嘔吐毒素和微孔上預包被抗原競爭嘔吐毒素抗體抗試劑，同時嘔吐毒素抗體與酶標記二抗酶標物相結(jié)合經(jīng)TMB底物液顯色。檢測期間，先后參加標準試劑或樣本、酶標物、抗試劑，通過孵育結(jié)合、洗板等過程，隨后添加適量反應

4、物，然后參加顯色劑，根據(jù)藍色深度的不同，得知嘔吐霉素的含量。一般來說，嘔吐毒素含量由低到高，顏色會呈現(xiàn)出由藍到黃，顏色淺黃代表嘔吐霉素含量超標。最后參加終止液令反應停止，直到物質(zhì)顏色變黃。接下來使用酶標儀檢測污染程度，樣本的吸光度值與其嘔吐毒素含量負相關(guān)，與標準曲線比較，再乘以稀釋倍數(shù)，即可得到嘔吐霉素的含量，用以提示工作人員采取相應的管控措施。酶聯(lián)免疫檢測法的缺點是檢測環(huán)節(jié)需要嚴控溫濕度，并且檢測結(jié)果存在一定誤差。2.2  HPLC法HPLC法全稱為高效液相色譜法，用這一方法檢測小麥中的嘔吐毒素含量時，應做好準備工作以減少檢測誤差，保證檢測結(jié)果的準確性和全面性【4】。但該

5、檢測法具有耗時長、本錢高等缺點，所以檢測機構(gòu)要慎重選用高效液相色譜法。當提出高精度檢測要求時，高效液相色譜法更為適宜。3  采用ELISA法或HPLC法檢測小麥嘔吐毒素3.1  材料及設備嘔吐霉素標準液為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇100 g/mL;嘔吐毒素免疫親和柱由北京華安麥科生產(chǎn);紫外檢測器的型號為Agilent;電子天平的型號為METTLERME;嘔吐毒素測試盒的型號為ELISA，產(chǎn)自北京華安麥科;酶標儀型號為680，由BIO-RAD企業(yè)生產(chǎn);高效液相色譜儀來自Agilent企業(yè);糧食測試粉碎磨的型號為JSFM-，來自中儲糧成都儲藏研究院，旋渦混

6、合器的型號為WH-861，來自上海驥輝企業(yè)。3.2  檢測方法3.2.1  ELISA法檢測小麥中嘔吐毒素的步驟ELISA測試盒存放于冰箱低溫環(huán)境，用其檢測小麥嘔吐霉素時，由低溫環(huán)境轉(zhuǎn)移到室溫環(huán)境，平衡1h以上，反應溫度控制在2025。為了直觀觀察顏色變化，在反應板上妥善放置酶標板微孔，并做好微孔標記工作。接下來，在標準品孔和樣品孔中分別參加DON標準溶液和過濾并稀釋好的樣品提取液，均為50L，逐孔參加50L酶標物、50L抗試劑，輕輕震蕩混勻，蓋板膜蓋好后，置于25避光環(huán)境中反應15min，小心揭開蓋膜將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250L/孔充分洗滌45次，

7、每次間隔10s，在吸水紙上拍干，然后逐孔參加100L底物液，蓋板膜蓋好后置于25的避光環(huán)境中5min，取出逐孔參加50L終止液，輕輕震蕩混勻，在BIO-RAD680酶標儀上測量其吸光度450nm/630nm。3.2.2  HPLC法檢測小麥中嘔吐毒素的步驟色譜柱為C18柱4.6mm×150nm，5m;柱溫35，流動速度為0.8mL/min;流動相為甲醇體積比20、水體積比80;檢測波長218nm;進樣體積為50L。預處理：將小麥樣品均勻混合，用電子天平稱取25.00g，放置在錐形容器中刻度為250mL，然后分別添加不同規(guī)格的標準溶液至0.8g/g、1.2g/g、3

8、.2g/g，之后參加100mL水，均勻混合后震蕩20min220r/min，提取適量并離心5min，取上清液，接下來用玻璃纖維濾紙過濾，將免疫親和柱連接于玻璃注射器，與壓力泵連接，分別吸取上述濾液2.0mL，以1滴/s速度流通親和柱，在空氣進入親和柱之后停止，將流出液去除，并用水5mL對親和柱進行淋洗2次，流速為2滴/s，在空氣進入親和柱之后停止，同時將流出液去除，滴加甲醇2.0mL，同時以1滴/s流速進行洗脫處理，對所有洗脫液進行收集。在50下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，參加1.0mL流動相溶解殘留物，渦旋30s，過濾膜濾進樣瓶中。經(jīng)線性關(guān)系分析可知，用20%甲醇-水將嘔吐毒素標準貯備液1

9、0g/mL配制工作液，最正確線性關(guān)系中嘔吐毒素濃度為0.054.00g/mL。3.3  結(jié)果及分析3.3.1  ELISA法檢測結(jié)果取不含嘔吐毒素的小麥樣品，分別添加水平為0.8g/g和3.2g/g的標準品，降解酶DON含量為0.8g/g時，降解率75.86%;降解酶DON含量為3.2g/g時，降解率約92.57%。降解酶活力受酶濃度、溫度兩個因素影響，酶濃度45g/mL之前降解率直線提高，酶濃度超過45g/mL后，飽和后降解率趨于平緩。反應溫度25時降解率最高。此外，酶活力強弱通過酶作用時長來檢驗，25時小麥中DON被高效降解，當反應時間延長，DON的

10、降解率再次提高;反應至20min后，降解率平穩(wěn)變化。當酸堿度變化時，DON降解情況隨之改變，反應溫度小于25且酸堿值8后酸堿度增加，DON降解幅度減小。3.3.2  HPLC法檢測結(jié)果為保證檢測結(jié)果的準確性和真實性，進行精密度、重復性、穩(wěn)定性、加標回收試驗。測定精密度時標準溶液0.4g/mL，進樣持續(xù)5次，記錄峰面積，得知嘔吐毒素相對標準偏差為1.35%，精密度良好;測定重復性時，取一式五份平行樣品，參照供試品溶液制備方式測試峰面積，得知嘔吐毒素相對標準偏差為1.55%，重復性較佳;測定穩(wěn)定性時取相同樣品溶液，在2d內(nèi)每間隔3h進樣分析，并比照峰面積變化情況，嘔吐毒素相對標

11、準偏差為0.76%，穩(wěn)定性良好;測定回收試驗時小麥取樣量25.00g，對應參加量1.000g/g、測定量0.998g/g、回收率91.704%;小麥另一份取樣量同為25.00g時，對應參加量1.000g/g、測定量977.45g/g、回收率92.037%。嘔吐毒素相對標準偏差為1.17%。3.3.3  ELISA法與HPLC法比照基于加標回收試驗，了解這兩種測試方法在小麥嘔吐毒素檢測中的應用情況，其中，ELISA法程序簡單，過濾后能夠直接檢測，回收率在75%125%之間。相對來講，HPLC法的檢測步驟煩瑣，經(jīng)過免疫親和柱處理及長時間得到檢測結(jié)果，回收率在70%90%之間。當

12、加標濃度同時增加，二者差異甚微。間接反映出ELISA測試盒具有實用性，其檢測結(jié)果可供參考。對于小麥嘔吐毒素檢測工作者來說，應客觀掌握這兩種檢測方法的應用原理及優(yōu)缺點，了解二者的異同之處，以便合理選擇檢測法，快速、準確得出檢測數(shù)據(jù)，確保小麥質(zhì)控措施的有效制定【5】。例如，針對大量小麥樣品快速篩選時，ELISA法更具適用性，因為這一方法易操作、靈敏度高、等待結(jié)果的時間短;針對少量小麥樣品質(zhì)量高精度檢測時，選擇HPLC法更為適宜，其檢測結(jié)果誤差較小，能為后續(xù)質(zhì)控實踐指明方向。必要情況下，聯(lián)合應用ELISA法和HPLC法，既能彌補單一檢測方法的缺乏之處，又能得出可靠的檢測結(jié)果。4  結(jié)論綜上所述，小麥嘔吐毒素測定工作的重要性日益突顯，為準確獲取小麥中的嘔吐毒素含量，視情況選用ELISA法或HPLC法，既能彌補傳統(tǒng)檢測方法的缺乏，又能真實、準確地測定嘔吐毒素濃度，對小麥產(chǎn)品及其加工品的質(zhì)量優(yōu)化以及保障糧食平安方面有很好的促進作用。參考文獻：1單曉雪，楊娟，廖子龍.二氧化鈦光催化對小麥嘔吐毒素降解效果的研究J.化學試劑，2021，429：1088-1092.2