漂浮滸苔的純化培養(yǎng)

1、上海海洋大學(xué)2017屆畢業(yè)設(shè)計(jì)報(bào)告（論文） 漂浮滸苔的純化培養(yǎng)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）（2017屆本科）題 目：漂浮滸苔的純化培養(yǎng) 學(xué) 院：海洋科學(xué)學(xué)院 專 業(yè)：環(huán)境海洋學(xué) 班 級(jí)：2013級(jí)海環(huán)1班 姓 名：徐一鳴 學(xué) 號(hào)：1321112 指導(dǎo)教師：張建恒2017年4月目 錄目錄I摘要1引言21 材料與方法4 1.1材料4 1.1.1滸苔藻種的收集與培育4 1.1.2滸苔生殖細(xì)胞（孢子或配子）的放散4 1.1.3滸苔孢子或配子的純化4 1.1.4滸苔孢子或配子的固著、萌發(fā)及其生長(zhǎng)5 1.1.5滸苔幼苗的保種52結(jié)果63討論104小結(jié)11參考文獻(xiàn)13漂浮滸苔的純化培養(yǎng)摘要：本文開(kāi)展了漂浮滸苔的純化培養(yǎng)

2、工作，從滸苔孢子的放散、純化、苗種培育及保種技術(shù)等方面做了一系列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成熟滸苔藻體一般在切段充氣培養(yǎng)2d后開(kāi)始大量放散，藻體經(jīng)歷由深綠色變?yōu)辄S色進(jìn)而轉(zhuǎn)變成白色；利用孢子/配子的正負(fù)趨光使其聚集在一處使其濃縮，用拉絲處理后的移液器（僅允許孢子大小通過(guò)）收集孢子/配子，能極大提高其純度并減少污染，重復(fù)3次左右可大大減少污染，達(dá)到純化的目的；光照使大量配子聚集在一起，呈現(xiàn)簇狀萌發(fā)，但聚集在一起的細(xì)胞因?yàn)榻佑|緊密或堆疊而無(wú)法受光或缺乏營(yíng)養(yǎng)鹽而出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，黑暗處理能使孢子/配子均勻附著在培養(yǎng)皿底部，經(jīng)暗處理2d后完全附著并變?yōu)閳A形，光照培養(yǎng)孢子/配子萌發(fā)并經(jīng)歷2細(xì)胞期、3細(xì)胞期、4細(xì)胞期等

3、階段，附著部位細(xì)胞發(fā)育成假根，呈輻射狀生長(zhǎng)，上部細(xì)胞發(fā)育成葉狀體，縱向分裂生長(zhǎng)，當(dāng)長(zhǎng)到20細(xì)胞長(zhǎng)度以上時(shí)假根間一般會(huì)相互纏繞；刮下藻體經(jīng)2L-3L-5L擴(kuò)大培養(yǎng)至藻體幼苗直徑達(dá)1mm左右，用滅菌蒸餾水強(qiáng)力沖洗可大大減少硅藻污染，再轉(zhuǎn)移到添加營(yíng)養(yǎng)鹽的滅菌海水的離心管（50ml）中密封，置于低溫培養(yǎng)箱（光照100lx，溫度10）下可長(zhǎng)期保存，從而實(shí)現(xiàn)漂浮滸苔的純化培養(yǎng)。關(guān)鍵詞：滸苔，純化，培養(yǎng)，生殖細(xì)胞，漂浮Purification and culture of EnteromorphaAbstract:In this paper, we carried out a series of studi

4、es on the purification and culture of Enteromorpha prolifera, and the results showed that the mature algae species were generally cultured after 2 days Began to mass dissipation, algae experience from dark green to yellow and then into white; the use of spores / gametes of positive and negative damp

5、ness to make it concentrated in a concentrated, with a wire after treatment pipettes (only allowed spore size Through the collection of spores / gametes, can greatly improve its purity and reduce pollution, repeat 3 times or so can greatly reduce the pollution, to achieve the purpose of purification

6、; light so that a large number of gametes together, showing clusters of germination, but gathered together cells Because of the close contact or stacking and can not receive light or lack of nutrients and the emergence of a large number of deaths, dark treatment can spore / gametes evenly attached t

7、o the bottom of the dish, after dark treatment for 2 d completely attached and become round, light culture spores / Germination and experience 2 cell stage, 3 cell stage, 4 cell stage and so on, the attachment part of the cells developed into a pseudo root, was radial growth, the upper cell Into the

8、 foliage, the longitudinal division of growth, when the length of 20 cells or more when the roots are generally intertwined with each other; scraping algae by 2L-3L-5L expanded to the body diameter of about 1mm, with sterile distilled water Strong flushing can greatly reduce the diatom pollution, an

9、d then transferred to the nutrient-added sterile seawater centrifuge tube (50ml) sealed, placed in low temperature incubator (light 100lx, temperature 10 ) can be long-term preservation, in order to achieve Enteromorpha prolifera of moss.Keywords:Enteromorpha prolifera，purification, culture，germ cel

10、l，floating引言滸苔（Enteromorpha prolifera）是屬于綠藻門(mén)綠藻綱石莼科滸苔屬的一種常見(jiàn)定生性的大型海藻類，也被人們俗稱為青苔，苔條等，是一種會(huì)快速繁殖的經(jīng)濟(jì)藻類，其自身無(wú)毒，在我國(guó)常見(jiàn)的滸苔種類有條滸苔（Enteromorpha clathrata）、扁滸苔(Enteromorpha compressa)、緣管滸苔（Enteromorpha linza）和腸滸苔（Enteromorpha intestinalis）等1。滸苔藻體細(xì)長(zhǎng)，綠色絲狀，中空呈管狀、帶狀或者葉片狀，往往呈叢狀，主枝明顯，分枝細(xì)，長(zhǎng)可達(dá)數(shù)米長(zhǎng)。藻體的基部有固著器可以附生在巖石或與海灘潮間帶，有

11、時(shí)也會(huì)在大型藻類的藻體上附生，通常生長(zhǎng)在潮間帶。滸苔歷來(lái)是各國(guó)人民食用的海藻，一般在夏、秋季采收，鮮食有鹽腌、鹽漬等，干食有曬干、烘干、烤干等，可放湯、做菜、做餅、加餡等。浙江地區(qū)常見(jiàn)的有苔條餅、千層餅等，這些食品有一種清香可口的風(fēng)味，深受沿海居民的喜愛(ài)。自古以來(lái)，滸苔就被認(rèn)為是可以藥用的藻類。很多古代藥典都記錄了滸苔的各種功效，它具有軟堅(jiān)散結(jié)，清熱解毒的功效，主治甲溝炎、頸淋巴腫、手癰、背癰、瘡癤（ji）等。李時(shí)珍著的本草綱目就有“燒末吹鼻止衄血，湯漫搗敷手背腫痛”的記載2。滸苔富含蛋白質(zhì)、粗纖維、礦物質(zhì)及碳水化合物，同時(shí)含有脂肪和維生素。滸苔還含有較多的維生素B12，是很好的保健食品。滸苔

12、富含天門(mén)冬氨酸，臨床將其用于治療肝炎、肝硬化，是滸苔成為保健品的重要原因之一。在滸苔的蛋白質(zhì)當(dāng)中，氨基酸種類十分齊全，必需氨基酸的含量普遍較高。滸苔還含有豐富的多糖，同其他海藻類一樣，其所含多糖與陸生植物不同，主要為硫酸多糖。滸苔多糖存在于細(xì)胞間，是滸苔的主要活性物質(zhì)之一。滸苔多糖可以促進(jìn)人體淋巴細(xì)胞的增殖，表明了它在抗腫瘤方面有用武之地。滸苔多糖使T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力增強(qiáng)，有明顯的免疫調(diào)節(jié)的功能。滸苔多糖可以提高SOD活力，降低體內(nèi)MDA含量，從而改善高血脂對(duì)機(jī)體的損害作用3。而且滸苔泛濫、價(jià)格低廉，因此是開(kāi)發(fā)生產(chǎn)藥物和保健品的絕佳原料。隨著經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展,能源危機(jī)和環(huán)境污染問(wèn)題的日趨嚴(yán)

13、重。所以,針對(duì)生物質(zhì)能源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究已經(jīng)成為重要科研項(xiàng)目。今年來(lái)通過(guò)研究表明,海洋藻類是一種優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)能資源4。通過(guò)各種生物技術(shù),用海洋藻類生產(chǎn)生物柴油、燃料乙醇、生物氫氣和沼氣等清潔燃料。而滸苔由于其吸收養(yǎng)分快,繁殖能力強(qiáng),適宜人工養(yǎng)殖等原因,成為人們眼中理想的生物質(zhì)能資源。綜合利用滸苔生物質(zhì)能資源對(duì)于解決資源短缺,推動(dòng)清潔能源應(yīng)用具有重要意義。海藻用于水產(chǎn)及畜牧飼料添加劑始于20世紀(jì)50年代，現(xiàn)在全世界海藻粉產(chǎn)量近5萬(wàn)噸，歐洲與北美各國(guó)均有不同程度地添加海藻粉用于動(dòng)物飼料。隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，飼料緊缺成為了較為突出的問(wèn)題。而滸苔營(yíng)養(yǎng)全面，有較好的的食用和藥用價(jià)值，因此滸苔制造成海

14、藻粉用于動(dòng)物飼料既能解決滸苔暴發(fā)、處理難題，又能“變廢為寶”提高我國(guó)動(dòng)物飼料資源具有重要意義5。隨著經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，能源危機(jī)和環(huán)境污染問(wèn)題的日趨嚴(yán)重。所以，針對(duì)生物質(zhì)能源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究已經(jīng)成為重要科研項(xiàng)目。今年來(lái)通過(guò)研究表明，海洋藻類是一種優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)能資源6。通過(guò)各種生物技術(shù)，用海洋藻類生產(chǎn)生物柴油、燃料乙醇、生物氫氣和沼氣等清潔燃料。而滸苔由于其吸收養(yǎng)分快，繁殖能力強(qiáng)，適宜人工養(yǎng)殖等原因，成為人們眼中理想的生物質(zhì)能資源。綜合利用滸苔生物質(zhì)能資源對(duì)于解決資源短缺，推動(dòng)清潔能源應(yīng)用具有重要意義。近年來(lái)，隨著我國(guó)對(duì)海洋藻類的開(kāi)發(fā)，藻類的需求量日益增大，尤其是對(duì)綠藻中的滸苔7-8需求量成倍增加，海區(qū)

15、野生滸苔已經(jīng)不能滿足市場(chǎng)數(shù)量和質(zhì)量的需求。海區(qū)養(yǎng)殖受到水體、潮汐、季節(jié)、水污染等不可控影響也制約了我國(guó)目前滸苔產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，另外由于我國(guó)對(duì)黃海滸苔爆發(fā)所帶來(lái)的不良影響報(bào)道比較多，使得國(guó)內(nèi)人群對(duì)滸苔的觀念仍主要停留在“滸苔的生態(tài)危害”上9-10，如滸苔的爆發(fā)機(jī)制、滸苔的生態(tài)特性等11，對(duì)滸苔設(shè)施化養(yǎng)殖以及加工技術(shù)等方面的研究還不多。 事實(shí)上隨著國(guó)際上日本韓國(guó)等在90年代加強(qiáng)了對(duì)滸苔養(yǎng)殖的技術(shù)開(kāi)發(fā),在養(yǎng)殖培養(yǎng)基、培養(yǎng)過(guò)程環(huán)境調(diào)控、培養(yǎng)設(shè)施等方面已經(jīng)有了很好的基礎(chǔ)12-14。近幾年韓國(guó)對(duì)滸苔食品的開(kāi)發(fā)已綜合利用發(fā)展起來(lái)了，滸苔養(yǎng)殖加工產(chǎn)業(yè)化發(fā)展也比較完善15。我國(guó)對(duì)滸苔的研究已相當(dāng)深入，并積累了一定

16、的有關(guān)滸苔育苗、養(yǎng)殖及加工技術(shù)的基礎(chǔ)，但并未形成產(chǎn)業(yè)化，滸苔養(yǎng)殖業(yè)及加工業(yè)仍處于起步階段，與國(guó)外技術(shù)力量相比仍較為薄弱，與國(guó)際上相比有一定的差距16-17。要大力發(fā)展國(guó)內(nèi)滸苔養(yǎng)殖加工產(chǎn)業(yè)，首要需要研究的是采苗、育苗和保種技術(shù)，因此我們需要解決的問(wèn)題是如何成功誘導(dǎo)母藻成熟、準(zhǔn)確把握孢子/配子放散時(shí)機(jī)、如何收集和純化孢子/配子、如何防止或解決藻體污染以及如何進(jìn)行有效的保種措施。1 材料與方法1.1材料1.1.1滸苔藻種的收集與培育本次試驗(yàn)采用的滸苔（Ulva prolifera）樣品采集于2016年5月，滸苔藻體漂浮生長(zhǎng)在南黃海江蘇近岸海域（圖1-1），用剪刀和鑷子從漂浮滸苔基部以上1cm左右切斷

17、，取基部以上部分，用滅菌海水清洗干凈，裝入盛有滅菌海水的離心管內(nèi)，低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用過(guò)濾滅菌的干凈海水繼續(xù)清洗，進(jìn)一步用高溫消毒的毛筆或軟刷去除藻體表面雜物和雜藻，并通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子鑒定，確定為滸苔純種。取健康成熟絲狀藻體，培養(yǎng)于光照養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)條件為溫度20、光照強(qiáng)度100 umol·m-2·s-1、光周期為12 L:12 D、鹽度30，每3天更換1次滅菌的過(guò)濾海水，并充氣培養(yǎng)。圖1 天然滸苔的采集Fig.1 The collection of natural Ulva prolifera1.1.2滸苔生殖細(xì)胞（孢子或配子）的放散取生長(zhǎng)健康的藻體，在1.1的培養(yǎng)條件下暫養(yǎng)

18、7天，取深綠管狀藻體剪成約3mm片段，無(wú)菌淡水沖洗1分鐘，按照密度為0.8g/L18養(yǎng)于燒杯，通氣培養(yǎng)23天，每天取培養(yǎng)液鏡檢觀察是否有孢子/配子放散。對(duì)部分未放散完全的藻段采用兩種方式進(jìn)行處理：（1）更換培養(yǎng)液繼續(xù)充氣培養(yǎng)；（2）不改換培育液連續(xù)培育；分別觀察兩種處理方式藻段孢子/配子的放散情況。1.1.3滸苔孢子或配子的純化孢子/配子大量迅速釋放后，靜置于日光燈下，利用配子/孢子的正負(fù)趨光特性使其聚集在一側(cè)，即孢子/配子濃縮液。將移液器置于酒精噴燈的外焰處灼燒，待玻璃融化時(shí)用鑷子夾住該處，離開(kāi)火源的同時(shí)拉絲（圖），使用拉絲后的移液器針孔允許孢子/配子通過(guò)，吸取孢子/配子，并置于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)

19、皿中添加含有營(yíng)養(yǎng)鹽的無(wú)菌海水，再用單側(cè)光源照射培養(yǎng)皿，待滸苔孢子/配子重新聚集在一側(cè)時(shí)，用新的移液器重新收集孢子/配子，在培養(yǎng)皿中可重復(fù)上述步驟對(duì)孢子/配子進(jìn)行收集和純化，以孢子/配子在培養(yǎng)皿中第一次聚集并收集為次數(shù)1，設(shè)置收集次數(shù)分別1、2、3次3個(gè)組，每個(gè)組設(shè)置10個(gè)平行，暗處理24h后更換培養(yǎng)液，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察養(yǎng)殖過(guò)程中3個(gè)組的孢子萌發(fā)期的污染情況。1.1.4滸苔孢子或配子的固著、萌發(fā)及其生長(zhǎng)將收集并純化后的滸苔孢子/配子于培養(yǎng)皿中，加培養(yǎng)液搖勻，分別置于光照條件（100mol·m-2·s-1）和黑暗條件下處理24h，24h后分別鏡檢觀察配子的附著情況，將黑

20、暗處理后的配子置于光照組相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每2天分別觀察一次孢子/配子的萌發(fā)和生長(zhǎng)情況。1.1.5滸苔幼苗的保種當(dāng)培養(yǎng)皿中的滸苔幼苗長(zhǎng)至1mm左右，用刮板將其刮下并用滅菌海水通氣培養(yǎng)68天，每3d換一次海水，待藻體幼苗長(zhǎng)至35mm長(zhǎng)時(shí)，將藻體放入300目圓底篩網(wǎng)中，再浸入裝有滅菌蒸餾水的容器中，使淡水剛好沒(méi)過(guò)篩網(wǎng)中的藻體幼苗，利用移液器和膠頭相連將淡水和藻體幼苗一同吸出，再用力擠出，利用篩網(wǎng)的過(guò)濾和淡水的沖擊力量沖洗藻體幼苗，沖洗810次左右將藻體幼苗移入裝有（含營(yíng)養(yǎng)鹽）的滅菌海水玻璃容器中，用移液器將藻體幼苗和培養(yǎng)液一同吸取并放入已滅菌的離心管中，封蓋，置于10、200lx光強(qiáng)的培養(yǎng)箱中保

21、存，6個(gè)月后觀察離心管中藻體的保存狀況并培養(yǎng)藻體幼苗。同時(shí)設(shè)置一個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組不進(jìn)行上述沖洗操作，每組設(shè)置4個(gè)平行。圖 1-2滸苔幼苗的保種Fig 1-2 the storage of Ulva prolifera seedlings2 結(jié)果實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在滸苔藻體切段培養(yǎng)過(guò)程中，先出現(xiàn)藻體變粗變綠，然后藻段從末端開(kāi)始變黃，進(jìn)而孢子放散，藻段發(fā)白。鏡檢發(fā)現(xiàn)深綠色藻體細(xì)胞已開(kāi)始形成生殖細(xì)胞囊，在顯微鏡下細(xì)胞囊首先出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)胞囊之間的排列間隙變大，細(xì)胞囊內(nèi)的孢子/配子處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，在發(fā)黃的藻段中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞囊內(nèi)的生殖細(xì)胞開(kāi)始做劇烈運(yùn)動(dòng)，在強(qiáng)光刺激下，大量生殖細(xì)胞從生殖細(xì)胞囊中快速放散出來(lái)（

22、圖），在發(fā)白的藻體中發(fā)現(xiàn)孢子/配子已完全從生殖細(xì)胞囊中放散出來(lái)，只剩下空的藻體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)（圖）。圖 1-3滸苔的孢子/配子釋放及收集Fig 1-3 Ulva prolifera spore release/gametes and collection實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單側(cè)光源照射已釋放生殖細(xì)胞的藻段可使其聚集在朝向光源的水體表面一側(cè)，具有正趨光性，顯微鏡下觀察具有兩鞭毛，因此釋放的生殖細(xì)胞為配子19-20。 經(jīng)過(guò)不同次數(shù)純化后，配子萌發(fā)期第6天3組培養(yǎng)皿中的污染狀況（表1-1）其中純化1次組污染最嚴(yán)重（圖1-4a），并抑制其配子的萌發(fā)和生長(zhǎng)；純化3次則未出現(xiàn)污染（圖1-4b），生長(zhǎng)狀況良好，說(shuō)明釋放的

23、配子一般純化3次即可達(dá)到無(wú)污染培養(yǎng)的目的。被污染的地方出現(xiàn)黃色渾濁物，顯微鏡下觀察到污染組的污染物主要為硅藻污染，其中大部分為舟形藻屬；被污染的孢子萌發(fā)緩慢甚至停滯生長(zhǎng)。 表1-1 不同純化次數(shù)的培養(yǎng)皿中的污染狀況Table 1-1 Different number of purification of pollution condition in petri dishes純化次數(shù)污染狀況（每組10瓶）18瓶污染22瓶污染3未出現(xiàn)污染badc圖1-4 培養(yǎng)皿中滸苔孢子的污染狀況及未放散完全的藻段生長(zhǎng)狀況Fig 1-3 The pollution condition of Ulva prolif

24、era spores in a petri dish and not fully radiation algal growth滸苔藻體切段后，孢子大量釋放，除大部分藻段能大量集中放散，還存在一小部分未放散的藻段。此時(shí)，（1）若將未放散的藻段過(guò)濾，棄去已放散的液體，重新加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，1d后藻段變黃并繼續(xù)釋放孢子。（2）若對(duì)未放散的藻段不進(jìn)行任何處理繼續(xù)培養(yǎng)，則未完全放散藻段不會(huì)繼續(xù)釋放配子，在35d后從藻段自體直接長(zhǎng)出細(xì)密的幼苗（圖1-4d），用鑷子將長(zhǎng)滿幼苗的藻段繼續(xù)分裂成更小的片段，則生成簇狀滸苔幼苗，每個(gè)簇狀滸苔上有10-100根幼苗不等，這與馬家海和丁懷宇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致21-25。

25、實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)配子固著期在有光和無(wú)光條件下差異很大。（1）光照條件下：由于剛放散的配子活性很高，具有正趨光性，在有光源條件下會(huì)聚集在朝向光源一側(cè)的水體表面，約2小時(shí)后，配子活性逐漸降低，游動(dòng)能力下降，聚集在水體表面一側(cè)的配子開(kāi)始下沉，并立即固著在培養(yǎng)皿底部，鏡檢發(fā)現(xiàn)配子大量聚集在一起（圖），鞭毛消失，但彼此間不進(jìn)行融合，萌發(fā)后呈簇狀生長(zhǎng)（圖）。這與丁懷宇發(fā)現(xiàn)滸苔單性生殖的研究結(jié)果是一致的22。（2）黑暗條件下：24h后取出培養(yǎng)皿鏡檢發(fā)現(xiàn)配子均勻的附著在培養(yǎng)皿底部，有先前的梨形變成圓形，鞭毛消失，彼此間沒(méi)有出現(xiàn)聚集現(xiàn)象（圖）。配子附著后即開(kāi)始生長(zhǎng)，萌發(fā)會(huì)經(jīng)歷2細(xì)胞期、3細(xì)胞期、4細(xì)胞期等階段（圖1-5

26、df），生物學(xué)上端細(xì)胞縱向分裂形成細(xì)長(zhǎng)的葉狀體，其固著部位形成假根（圖1-5gh），假根生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分支并呈輻射狀向四周擴(kuò)大生長(zhǎng)，當(dāng)固著配子密度較大時(shí)，其生長(zhǎng)階段孢子的假根會(huì)彼此連接纏繞在一起（圖1-5i），用刮板將藻體刮下可進(jìn)行藻體幼苗的擴(kuò)大培養(yǎng)，這為后期滸苔的規(guī)?；B(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)。圖 1-5滸苔配子各階段的生長(zhǎng)狀況Fig 1-5 The growth condition of every stage of the Ulva prolifera gametes6個(gè)月后取出離心管，經(jīng)過(guò)沖洗處理的藻體幼苗仍然新鮮如初，有一股清新的海藻味，且經(jīng)過(guò)幾天的培養(yǎng)，能夠正常生長(zhǎng)；而對(duì)照組4個(gè)離心管中藻體都

27、已變成暗黃色，開(kāi)蓋后聞到一股濃烈的腐臭味，鏡檢發(fā)現(xiàn)已被大量硅藻污染，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，藻體幼苗幾乎全部死亡，生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)失敗。3 討論3000深綠色滸苔切段后一般2天后藻體發(fā)黃，而藻體發(fā)黃到孢子完全放散之間的時(shí)間差非常短，通常在十多分鐘的時(shí)間內(nèi)即可完成放散，因此可以將藻體發(fā)黃作為孢子放散的“零界點(diǎn)”，但孢子放散的零界點(diǎn)不好掌控，因此一般實(shí)驗(yàn)工作時(shí)選擇深綠色的滸苔藻體進(jìn)行孢子放散實(shí)驗(yàn)較為適宜。當(dāng)滸苔藻段處于放散“零界點(diǎn)”時(shí)停止對(duì)其光照處理，藻段即停止放散，而重新給予光照時(shí)，藻段又開(kāi)始大量放散，因此，滸苔的孢子放散與光照強(qiáng)度是密不可分的。利用放散孢子后的液體繼續(xù)培養(yǎng)未放散完的滸苔藻段可以使藻段生長(zhǎng)成簇狀幼苗，

28、而正常培養(yǎng)液并沒(méi)有出現(xiàn)這種效果，推測(cè)孢子/配子釋放后的培養(yǎng)液中會(huì)生成抑制藻體放散的物質(zhì)，同時(shí)也會(huì)生成促進(jìn)藻體生殖細(xì)胞萌發(fā)的物質(zhì)。利用這種方法培養(yǎng)出的簇狀滸苔幼苗是生殖細(xì)胞直接在原藻體上萌發(fā)形成的聚集體，其形態(tài)與集塊化獲得的幼苗26類似，但規(guī)模較小，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，在需求量不大的情況下也可作為滸苔苗種的一種快速擴(kuò)增方式。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了一種滸苔孢子的提取和純化方法，利用孢子的極性特征使孢子聚集在一處，然后利用拉絲移液管對(duì)孢子濃縮液進(jìn)行吸取和轉(zhuǎn)移，其中拉絲移液管通過(guò)橡膠管和空氣過(guò)濾裝置相連，利用嘴吸取。這種方法的好處在于：拉絲處理極大的縮小了移液器的孔徑范圍，一般只允許孢子大小細(xì)胞通過(guò)，因此可以排除

29、大量殘?jiān)s質(zhì)和微生物，提高孢子/配子純度，用嘴吸取可靈活掌握吸取孢子的量使其收放自如。在孢子轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中后，利用孢子的極性使其聚集在一處，而非孢子物質(zhì)因?yàn)闆](méi)有極性而不會(huì)出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，重復(fù)幾次這樣的操作后可使孢子純度大大提高，避免了雜質(zhì)污染，達(dá)到提純的目的。此外，試驗(yàn)中用到的所有器具必須滅菌處理，避免雜菌污染。本實(shí)驗(yàn)觀察到當(dāng)對(duì)放散后的滸苔配子進(jìn)行暗處理后，配子會(huì)均勻附著在培養(yǎng)皿底部，這與光照條件下配子大量聚集的現(xiàn)象差異很大，說(shuō)明配子在黑暗條件下做不規(guī)則運(yùn)動(dòng)，無(wú)法利用自身的極性特征進(jìn)行聚集，因此各配子可以均勻的在水體中游動(dòng)，等到活性下降時(shí)，就均等的附著在培養(yǎng)皿底部。研究表明，當(dāng)培養(yǎng)皿游動(dòng)配子

30、的密度足夠大時(shí)（104個(gè)/ml）27，暗處理使配子固著在培養(yǎng)皿底部后，生長(zhǎng)時(shí)彼此間的假根會(huì)纏繞在一起，因此刮下藻體進(jìn)行培養(yǎng)彼此間的假根會(huì)相互間進(jìn)行附著，這種方式可以擺脫了滸苔慣有的固著生長(zhǎng)，呈現(xiàn)簇狀生長(zhǎng)現(xiàn)象，這也是后期滸苔孢子的集塊化技術(shù)26的基礎(chǔ)。這與配子在光照條件下形成聚集體并進(jìn)而呈簇狀生長(zhǎng)的方式不同，前者配子均勻分布在培養(yǎng)皿底部，彼此間具有較大的生長(zhǎng)空間，成活率可以達(dá)到100%；后者是大量配子聚集并堆積在一起，彼此間生長(zhǎng)空間過(guò)于擁擠，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢甚至停滯生長(zhǎng)，很多堆積在一起的配子由于受不到光照而大批量腐爛死亡，存活率大大降低，無(wú)法達(dá)到大批量培育苗種的目的，因此滸苔生殖細(xì)胞放散后應(yīng)進(jìn)行黑暗

31、處理才能應(yīng)用于大規(guī)模的育苗育種。硅藻是滸苔藻體養(yǎng)殖過(guò)程中受影響最大的污染源，在培養(yǎng)培養(yǎng)出的藻體難免會(huì)發(fā)生硅藻污染28。硅藻的生長(zhǎng)條件與滸苔類似，在較高溫度和光強(qiáng)條件下會(huì)大量繁殖，過(guò)量的硅藻附著在滸苔藻體表面會(huì)阻礙陽(yáng)光和空氣，同時(shí)消耗海水營(yíng)養(yǎng)鹽，嚴(yán)重影響滸苔幼苗的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用移液器和膠頭相連，將藻體放入圓底篩網(wǎng)中再浸入裝有滅菌淡水的容器中，使淡水沒(méi)過(guò)藻體幼苗，用移液器將淡水和藻體幼苗一同吸出，再用力擠出，利用篩網(wǎng)的過(guò)濾和淡水的沖擊力量可有效沖洗掉藻體幼苗上附著的硅藻，保證藻體的健康清潔，將清洗后的藻體幼苗放入低溫培養(yǎng)箱可長(zhǎng)期保存，這些苗種可為滸苔的設(shè)施化養(yǎng)殖全年提供源源不斷的苗種源，或用

32、于其他商業(yè)用途，在滸苔種質(zhì)庫(kù)的建立、藻種保藏及海藻養(yǎng)殖方面都具有重要作用。小結(jié)參考文獻(xiàn)1張義浩，趙盛龍，吳常文.海洋生物藻類M.杭州：浙江大學(xué)出版社，2002:33.2段德麟，付曉婷，張全斌，張國(guó)防.現(xiàn)代海藻資源綜合利用M.北京：科學(xué)出版社，2016:119.3冷揚(yáng),劉艷芬.滸苔多糖對(duì)機(jī)體免疫及糖、脂代謝影響的研究J.農(nóng)墾醫(yī)學(xué),2012,(02):171-174.4張素萍, 顏涌捷, 任錚偉, 等.生物質(zhì)油精制的研究進(jìn)展 J .新能源, 2000, 22(10):12-17.5關(guān)洪斌,王曉蘭,黃榮榕. 水產(chǎn)飼料中滸苔添加量與加工工藝研究J. 資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng),2012,(11):961-963+

33、967.6張素萍, 顏涌捷, 任錚偉, 等.生物質(zhì)油精制的研究進(jìn)展 J .新能源, 2000, 22(10):12-17.7 丁蘭平, 欒日孝. 滸苔(Enteromorpha prolifera) 的分類鑒定生境習(xí)性及分布J. 海洋與湖沼, 2009, 11(2): 68-71.8 Leliaert F, Zhang X, Ye N, et al. Identity of the Qingdao algal bloomJ. Phycol Res, 2009, 57: 147-1519Sun S, Wang F, Li C L, et al. Emerging challenges: Mass

34、ive green algae blooms in the Yellow SeaJ. Nature Proceedings, 2008, 1: 22-2610 Liu D Y, Keesing J K, He P M, et al. The worlds largest macroalgal bloom in the Yellow Sea, China: Formation and implications. EstuarineJ. Coastal and Shelf Science, 2013, 129: 2-10.11劉桂梅, 李海, 王輝, 等. 我國(guó)海洋綠潮生態(tài)動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展J. 地球科學(xué)進(jìn)展, 2010, 25 (2):147-153.12 楊志娟. 新型綠藻湯料的開(kāi)發(fā)J.食品工業(yè), 2003, (3): 4243.13 馬貴武. 開(kāi)發(fā)大型綠藻的意義與途徑J. 湛江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 1990, 10(2): 8588.14 德田廣, 大野正夫, 小河久朗. 海藻資源養(yǎng)殖學(xué)M.東京:一印刷株式合社,昭和62(1987):4750.59. 110.11615 林文庭. 淺論滸苔的開(kāi)發(fā)與利用J. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2007(9): 23 251.16 王曉坤, 馬家海,